呼吸機相關(guān)肺損傷患者血清及誘導(dǎo)痰液NLRP3炎癥小體的表達及與其它炎癥因子的相關(guān)性*

顧慧玲，王海峰，倪紅燕，楊文林

(上海市第一人民醫(yī)院寶山分院呼吸科，上海 200940)

近年來，機械通氣(MV)作為一種重要的生命支持手段已在臨床領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但運用不當極易引起甚至加重肺損傷-呼吸機相關(guān)性肺損傷(ventilator induced lung injury，VILI)。VILI是MV的嚴重并發(fā)癥，在異常機械力刺激下，肺泡上皮細胞激活肺泡巨噬細胞等炎性細胞導(dǎo)致炎性因子大量釋放，從而介導(dǎo)失控的“瀑布式”炎癥反應(yīng)[1，2]，對危重癥患者的預(yù)后造成嚴重影響，病死率高達30%～42%[3]。NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)炎癥小體作為固有免疫系統(tǒng)的一種模式識別受體，大量研究已表明其參與到自身免疫疾病和感染性疾病，但其與非感染性疾病的相關(guān)性尚缺乏足夠證據(jù)[4，5]。本研究擬通過檢測VILI患者血清和誘導(dǎo)痰中NLRP3炎癥小體及相關(guān)炎性因子表達水平的變化，探討NLRP3炎癥小體在VILI中的作用，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2014年1月～2017年12月在上海市第一人民醫(yī)院寶山分院呼吸科及急診科收治入院行MV治療的VILI患者，共76例。入組標準：①均符合中華醫(yī)學會呼吸分會制訂的急性肺損傷診斷標準[6]，并根據(jù)臨床表現(xiàn)、胸部CT及動脈血氣等明確；②年齡≥18歲，MV時間>24h；③排除創(chuàng)傷性肺損傷、氣胸、頻死狀態(tài)(預(yù)計12h內(nèi)死亡)或并發(fā)嚴重器官功能障礙。其中男性35例，女性41例，年齡43～75(54.7±6.2)歲；Murray肺損傷評分(LIS)[7]1.8±0.6分。根據(jù)LIS評分，分為兩個亞組：輕、中度肺損傷組47例(LIS≤2.5分)，重度肺損傷組29例(LIS>2.5分)。另外在相同時期選擇我院體檢中心的健康體檢者30例作為對照組。其中男性15例，女性15例，年齡40～75(53.5±4.9)歲。各組對象年齡、性別構(gòu)成比等差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 痰的誘導(dǎo)及處理：所有受試者咳痰后漱口，吸入沙丁胺醇200 μg。隨即以3 g/dl高滲鹽水射流霧化吸入，收集痰液。于痰液中加入等量0.1ml/dl二硫蘇糖醇液，充分振蕩化開。取少許(約50 μl)做細胞計數(shù)，其余離心，將上清液分裝保存在-20℃冰箱中待測。

1.2.2 炎性因子檢測：分別抽取VILI患者、對照組空腹肘靜脈血3 ml，置于含枸櫞酸鹽的抗凝管中，3 000 r/min離心10～15 min后留取上層血清置于-20℃冰箱中備用。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測白介素1β(IL-1β)，IL-18，IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。試劑盒由美國TPI公司生產(chǎn)。

1.2.3 NLRP3炎癥小體檢測：采用ELISA雙抗夾心法檢測誘導(dǎo)痰和血清中NLRP3炎癥小體表達水平。試劑盒由美國TPI公司生產(chǎn)。

2 結(jié)果

2.1 各組血清、誘導(dǎo)痰中NLRP3炎癥小體表達水平比較 見表1。各組血清、誘導(dǎo)痰中NLRP3炎癥小體表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。輕中度肺損傷組、重度肺損傷組血清、誘導(dǎo)痰中NLRP3炎癥小體表達水平明顯高于對照組，重度肺損傷組上述指標亦明顯高于輕中度肺損傷組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 各組血清、誘導(dǎo)痰中NLRP3炎癥小體表達水平比較

注：t1，P1：輕度肺損傷組與對照組比較；t2，P2：重度肺損傷組與對照組比較；t3，P3：輕中度肺損傷組與重度肺損傷組比較。

2.2 各組血清炎性因子水平比較 見表2。方差分析顯示，各組血清IL-1β，IL-18，IL-6和TNF-α水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，輕中度肺損傷組、重度肺損傷組血清中各炎性因子水平明顯升高，與輕中度肺損傷組比較，重度肺損傷組血清中各炎性因子水平亦明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 各組血清炎性因子水平比較

注：t1，P1：輕度肺損傷組與對照組比較；t2，P2：重度肺損傷組與對照組比較；t3，P3：輕中度肺損傷組與重度肺損傷組比較。

2.3 NLRP3炎癥小體與炎性因子表達水平的相關(guān)性分析 見表3。Pearson相關(guān)性分析顯示，輕中度肺損傷組患者血清、誘導(dǎo)痰中NLRP3炎癥小體濃度與IL-1β，IL-18均呈顯著正相關(guān)，而與IL-6，TNF-α無顯著相關(guān)性(P>0.05)。重度肺損傷組患者血清、誘導(dǎo)痰中NLRP3炎癥小體濃度與IL-1β，IL-18，IL-6，TNF-α均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

表3 VILI患者NLRP3炎癥小體與炎性因子表達水平的相關(guān)性

3 討論

機械通氣(MV)是治療急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合癥不可缺少的重要手段之一。由于長時間、反復(fù)、強制性氣道高壓和高容量造成肺泡、小氣道結(jié)構(gòu)過度擴張等肺機械性損傷，進而誘發(fā)炎性滲出、肺水腫、肺間質(zhì)纖維化及肺泡表面活性物質(zhì)失活等肺炎癥性損傷，常見的VILI包括氣壓傷、萎陷傷、容積傷和生物傷四種類型[8]。肺組織細胞機械性損傷如何轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)生物信號，引起肺組織無菌性炎癥性損傷的機制尚不十分明確[9]。最近有研究報道顯示，NLRP3炎癥小體作為NLRs家族的一個重要成員，由NLRP3，凋亡相關(guān)斑點樣蛋白、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶1組成，不僅可以識別入侵的細菌等病原體所致固有免疫應(yīng)答，也可能參與到某些無菌性炎癥反應(yīng)中[10，11]，但目前多數(shù)研究集中于動物實驗階段。

LIS評分最早由Murray于1988年提出，是目前國際上評估ALI較為權(quán)威的方法，其與肺臟受累范圍密切相關(guān)，能夠?qū)Ψ螕p傷程度進行量化評估，同時有助于研究疾病的發(fā)展過程。本研究根據(jù)LIS進行VILI病情分組，結(jié)果顯示輕中度肺損傷組、重度肺損傷組血清、誘導(dǎo)痰中NLRP3炎癥小體表達水平明顯高于對照組，重度肺損傷組上述指標亦明顯高于輕中度肺損傷組(P<0.05)，與Jones等[11]研究結(jié)果基本一致，進一步證實了MV導(dǎo)致VILI的發(fā)生，且隨著肺損傷的嚴重程度增加而升高。此外，VILI患者血清中各炎性因子水平也明顯升高，且肺損傷越重，其水平越高(P<0.05)。有研究數(shù)據(jù)顯示，在全麻下MV 3 h后，患者炎性因子釋放明顯增加，其原因可能為機體肺防御功能下降和炎性輕度改變[12，13]。由此我們推測，NLRP3可能參與了VILI的發(fā)生，其水平升高可能作為VILI的早期輔助診斷指標，對優(yōu)化通氣策略具有一定指導(dǎo)意義。

相關(guān)性分析顯示，VILI患者血清、誘導(dǎo)痰中NLRP3炎癥小體濃度與炎性因子，尤其是其下游炎性因子IL-1β，IL-18呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，對于重度VILI患者而言，二者的相關(guān)性更為凸顯，再次證實了NLRP3炎癥小體激活在VILI的發(fā)生及病情進展中發(fā)揮著重要作用[14]。Ko等[15]研究認為，大潮氣量MV刺激可激活NLRP3炎癥小體各組分之間的級聯(lián)反應(yīng)，識別并結(jié)合胞內(nèi)外配體，啟動信號傳遞，通過MyD88通路激活I(lǐng)KKβ-NF-κB誘導(dǎo)其下游炎性因子IL-1β，IL-18及其他炎性因子的合成與分泌增多，進而介導(dǎo)肺部急性炎癥反應(yīng)。

綜上所述，VILI患者血清、誘導(dǎo)痰中NLRP3表達明顯上調(diào)，且與炎性因子密切相關(guān)，NLRP3介導(dǎo)了大量炎癥因子釋放，參與VILI的發(fā)生、發(fā)展，阻斷NLRP3的激活可能成為VILI的潛在治療靶點。