支氣管哮喘并發(fā)幽門螺桿菌感染患兒糞便抗原與血清抗體特征分析*

趙含信，郝維敏

(宿州市立醫(yī)院，安徽宿州 234000)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，HP)感染與慢性萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌等胃腸道疾病有關(guān)[1]。臨床上常用的HP感染檢測(cè)方法分為兩大類[2，3]：一類為侵入性檢測(cè)，另外一類為非侵入性檢測(cè)(14C-呼氣試驗(yàn)、糞便HP抗原檢測(cè)、血清HP抗體檢測(cè))，有文獻(xiàn)報(bào)道在成人體檢人群中糞便HP抗原檢測(cè)可以完全取代14C呼氣試驗(yàn)[3]，而在兒童人群中HP檢測(cè)的方法評(píng)價(jià)較少。另外，支氣管哮喘(哮喘)作為常見的兒童呼吸道疾病，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，這與機(jī)體免疫、環(huán)境改變以及病原感染密切相關(guān)[4]。自有文獻(xiàn)報(bào)道了HP感染陽性患者中發(fā)生哮喘的比例明顯降低以來[5]，HP感染與過敏性疾病的發(fā)病相關(guān)性研究已成為熱點(diǎn)，但HP在兒童支氣管哮喘與健康體檢兒童間的血清HP抗體譜和血清型差異性及流行病學(xué)調(diào)查未見報(bào)道，本文擬研究在兒童人群中三種HP檢測(cè)方法的結(jié)果的可比性；調(diào)查支氣管哮喘患兒與健康體檢兒童兩組感染HP陽性率及其差異性；比較分析兩組人群中血清HP抗體譜的表達(dá)及血清型分布。研究如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年12月～2017年12月，安徽省宿州市立醫(yī)院兒科支氣管哮喘患兒135例作為疾病組，其中男童78例，年齡8.4±1.6歲，女童57例，年齡8.7±1.2歲；兒童體檢中心健康體檢者147例作為對(duì)照組，其中男童85例，年齡8.9±0.9歲，女童62例，年齡8.5±1.1歲，兩組間性別、年齡構(gòu)成無差異，具有可比性。研究對(duì)象的篩選原則：① 進(jìn)行14C-尿素呼氣試驗(yàn)(14C-UBT)前1個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行HP治療和未服用與幽門螺桿菌治療有關(guān)的抗生素；②嚴(yán)格審查各肝腎功能，必要時(shí)行影像學(xué)檢查予以排除肝腎功能不全，以及其他對(duì)研究結(jié)果可能造成影響的疾病。對(duì)照組(健康體檢兒童)除上述篩選原則外，必須滿足未有支氣管哮喘病史或處于支氣管哮喘急性發(fā)作期。疾病組患兒需滿足處于支氣管哮喘急性發(fā)作期，且未進(jìn)行相應(yīng)的治療前。所有研究對(duì)象進(jìn)行14C呼氣試驗(yàn)檢驗(yàn)并登記結(jié)果，另外收集患兒和健康體檢兒童血清各1ml，-80℃凍存?zhèn)溆?。支氣管哮喘疾病組由兒科醫(yī)生遵循2008 年修訂的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[6]對(duì)兒童支氣管哮喘做出診斷并予以隨訪。

1.2 試劑與儀器14C放射性液閃儀及0.75μCi/粒(14C-UBT)尿素膠囊(深圳市中核海得威生物科技有限公司)，幽門螺桿菌糞便抗原、血清抗體檢測(cè)試劑盒(均來自杭州艾康生物有限公司)，HP免疫印跡試驗(yàn)試劑盒(深圳市伯勞特生物制品有限公司)。

1.3 方法

1.3.114C-UBT：受檢者清晨空腹或餐后2 h口服一粒14C尿素膠囊，靜坐25 min后開啟CO2吸收劑一瓶，向瓶?jī)?nèi)平靜吹氣約1～3 min，然后向瓶?jī)?nèi)加入稀釋閃爍液4.5 ml，加蓋密封，于閃爍儀上作14C放射性測(cè)試2 min，結(jié)果判斷：14C-UBT≥100 dpm/mmol CO2可判斷為HP陽性。

1.3.2 膠體金糞便HP抗原與血清HP抗體檢測(cè)：同時(shí)收集受檢者的糞便與血清標(biāo)本，按試劑盒說明書進(jìn)行操作和結(jié)果判斷。

1.3.3 免疫印跡試驗(yàn)血清抗體譜檢測(cè)及血清分型：當(dāng)血清HP抗體檢測(cè)結(jié)果陽性時(shí)，進(jìn)行HP血清抗體譜分析，操作按試劑盒說明書進(jìn)行操作；區(qū)帶結(jié)果判斷：細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白(CagA-116KD)、空泡毒素(VacA-95KD，VacA-91KD)、尿素酶亞單位(UreA-66KD，UreB-30KD)區(qū)帶相關(guān)抗體顯色深淺低于質(zhì)控帶判斷為陰性結(jié)果，反之則為陽性結(jié)果；嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行分型結(jié)果判斷：根據(jù)文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分型，CagA-116KD，VacA-95KD，VacA-91KD區(qū)帶相關(guān)抗體中有任一陽性結(jié)果判為血清型I型，三者都陰性則為II型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 不同HP感染檢測(cè)方法之間陽性結(jié)果(率)差異的比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，抗體譜中各抗體的陽性率差異采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分率(%)表示，所有數(shù)據(jù)在SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包上進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 幽門螺桿菌感染檢測(cè)不同方法間陽性率的比較 目前在臨床上兒童幽門螺桿菌常見的檢測(cè)方法主要為：幽門螺桿菌14C-UBT實(shí)驗(yàn)、糞便中的HP抗原檢測(cè)以及血清中的幽門螺桿菌抗體檢測(cè)三種，本文通過對(duì)三者之間的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析，14C-UBT陽性率32.6%(92/282)，糞便HP抗原陽性率33.7%(95/282)，血清HP抗體陽性率35.1%(99/282)。以14C-UBT為參考方法，經(jīng)計(jì)算三種方法間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.77～0.88，P>0.05)。

2.2 健康體檢組與哮喘患兒疾病組HP感染調(diào)查情況 見表1。

表1 疾病組與對(duì)照組采用三種方法對(duì)其流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果[%(n)]

三種檢測(cè)方法在疾病組和對(duì)照組中HP感染率結(jié)果間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另外，在疾病組與對(duì)照組間HP感染率(30.4%～37.4%)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.06，0.77，0.72，均P>0.05)。

2.3 疾病組與對(duì)照組間的幽門螺桿菌抗體譜及血清型比較分析 見表2。

表2 疾病組與對(duì)照組間血清抗體譜與血清型差異性比較[n(%)]

類別指標(biāo)組別(n)疾病組(44)對(duì)照組(55) 統(tǒng)計(jì)指標(biāo)χ2P值血清抗體譜 CagA-116KDVacA-95KDVacA-91KDUreA-66KDUreB-30KD16(36.4)14(31.8)14(31.8)29(65.9)28(63.6)31(56.4)28(50.9)28(50.9)30(54.5)29(52.7) 3.923.643.641.311.190.0470.0560.0560.2520.275血清型 ⅠⅡ16(36.4)26(63.6)31(56.4)24(43.6) 3.920.047

對(duì)健康體檢組與患兒疾病組進(jìn)行比較，VacA-95KD，VacA-91KD，UreA-66KD和UreB-30KD抗體在兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.64，3.64，1.31，1.19，均P>0.05)，而CagA-116KD抗體在兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.92，均P<0.05)。血清Ⅰ型和Ⅱ型感染率在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.92，P<0.05)。

3 討論

哮喘作為兒童最常見的呼吸道慢性疾病之一，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率及其引起的病死率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，給兒童的學(xué)習(xí)教育、成長(zhǎng)發(fā)育和身心健康等造成了巨大的影響。截止目前，哮喘的主要特征是慢性氣道非特異性炎癥以及高反應(yīng)性，這已得到了廣大學(xué)者的認(rèn)可和贊同，但哮喘發(fā)作和發(fā)病的具體病理機(jī)制尚不清楚，文獻(xiàn)報(bào)道可能與遺傳易感、呼吸道感染、氣道神經(jīng)痙攣等因素密切相關(guān)。近年來，HP感染與支氣管哮喘發(fā)病的相關(guān)性研究已引起了兒科學(xué)、呼吸病學(xué)以及病原微生物學(xué)等專家的廣泛關(guān)注。在臨床上對(duì)于HP 感染和兒童支氣管哮喘的相關(guān)性研究結(jié)果多是基于流行病學(xué)調(diào)查和相關(guān)資料對(duì)照所得出的結(jié)論，未見有文獻(xiàn)報(bào)道HP感染的抗體、抗體譜、血清型與兒童支氣管哮喘的報(bào)道，而本文則從血清學(xué)角度說明HP抗體與兒童支氣管哮喘發(fā)生的內(nèi)在聯(lián)系。

HP是全球范圍內(nèi)流行的病原菌，尤其是在發(fā)展中國(guó)家兒童HP感染的陽性率高達(dá)50%[7]。與本研究中HP在兒童中流行率(30.4%～37.4%)基本一致，與張忠夫等[3]報(bào)道的體檢人群陽性率(43.5%～45.6%)相近。目前臨床上診斷HP感染的方法主要有兩類：侵入性試驗(yàn)和非侵入性試驗(yàn)[8，9]。由于非侵入性試驗(yàn)(14C-UBT，HP抗原、抗體檢測(cè))對(duì)人體損害小，各試驗(yàn)檢測(cè)的診斷效能已得到認(rèn)可[12]，在臨床已逐步得到普及和應(yīng)用，但14C-UBT相比HP抗原、抗體檢測(cè)的應(yīng)用還存在一定的局限性，如14C-UBT存在一定的放射性(該放射性傷害小)、需要患者的配合吹氣(與患者的依從性相關(guān))、試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)以及不適合大規(guī)模的人群篩查。通過本文對(duì)體檢兒童和哮喘兒童采用三種HP感染的檢測(cè)方法比較可知，糞便HP抗原膠體金試驗(yàn)可以取代14C-UBT用于兒童HP感染檢測(cè)，同時(shí)與血清抗體聯(lián)合檢測(cè)不僅有助于診斷HP感染，同時(shí)也能監(jiān)測(cè)藥物療效和了解疾病的感染階段。因此，HP抗原與抗體檢測(cè)具有取材方便、操作時(shí)間短、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)[10]，更適用于兒童HP的檢測(cè)與診斷。

已有研究表明，血清中HP刺激機(jī)體產(chǎn)生的不同抗體與其致病程度、疾病的治療以及預(yù)后密切相關(guān)[11]。目前臨床上將HP感染分為Ⅰ和Ⅱ型2種血清型，其中Ⅰ型為抗-CagA或抗-VacA抗體陽性；Ⅱ型為抗-CagA和抗-VacA抗體陰性，抗-UreA或抗-UreB陽性。文獻(xiàn)報(bào)道不同的血清型引起胃腸道疾病的結(jié)局不完全一樣[12]。本研究采用14C-UBT，糞便HP抗原與血清HP抗體三種方法聯(lián)合檢測(cè)哮喘患兒與正常體檢兒童的HP感染情況，三種實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在兒童支氣管哮喘患者與健康體檢兒童間HP感染率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與Tsang等[13]和Wang等[14]報(bào)道的HP感染與支氣管哮喘并沒必然的聯(lián)系結(jié)論相一致，從兒童HP的感染率角度并沒有充足的證據(jù)說明兩者之間存在相關(guān)性。

本文對(duì)HP抗體陽性的支氣管哮喘患兒和健康體檢兒童血清抗體譜進(jìn)行了進(jìn)一步比較分析，結(jié)果顯示VacA-95KD，VacA-91KD，UreA-66KD和UreB-30KD抗原刺激產(chǎn)生的抗體在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而CagA-116KD刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且兩組中的血清型分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，支氣管哮喘患兒中的I型比例明顯低于健康體檢組兒童。另外，我們通過數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)雖然VacA-95KD，VacA-91KD抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但統(tǒng)計(jì)的P值與0.05較為接近，可能是本文選取的樣本例數(shù)少導(dǎo)致，隨著樣本量的加大可能兩組的差異就可以統(tǒng)計(jì)出來，下一步我們將加大樣本量進(jìn)行多中心研究，以了解VacA-95KD，VacA-91KD抗體譜在兩者之間分布的差異性。CagA-116KD在兩組之間的分布存在差異，與Chen等[15]報(bào)道的CagA菌株感染率與哮喘的發(fā)病率呈現(xiàn)出反比的關(guān)系相一致。CagA陽性HP菌株感染的兒童中，支氣管哮喘發(fā)病率降低的形成原因可能與其感染后刺激引起的過敏性反應(yīng)下降相關(guān)，低濃度的IgE對(duì)于T細(xì)胞應(yīng)答具有調(diào)節(jié)作用，CagA抗體陽性的患者血清中IgE含量相對(duì)偏低[16]。

綜上所述，目前在臨床上對(duì)于兒童HP感染可以采用HP抗原與抗體聯(lián)合檢測(cè)取代現(xiàn)用的C-UBT，另外通過本文的研究HP感染后是否能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生CagA抗體，與兒童支氣管哮喘存在負(fù)相關(guān)，那么其是否是直接導(dǎo)致和抑制支氣管哮喘的直接因素還有待下一步的研究證實(shí)。