浙江地區(qū)臨床分離糞腸球菌的多位點序列分型及耐藥性分析*

施 宏，陳書韻，楊 狄，任緒義

(杭州迪安醫(yī)學檢驗中心，杭州 310000)

腸球菌屬(Enterococcus)細菌為兼性厭氧的革蘭陽性球菌，目前至少由32個菌種[1]組成，廣泛分布于土壤、水和食物中，也是人、犬、禽、豬、馬等動物胃腸道正常菌群之一。糞腸球菌是腸球菌屬中重要的院內院外感染致病菌。在需氧革蘭陽性球菌中僅次于葡萄球菌[2]，它不僅可引起尿路感染[3]、皮膚軟組織感染[4]，還可引起危及生命的菌血癥[5]、心內膜炎等[6]。多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是一種基于核酸序列測定的細菌分型方法，通過PCR擴增多個管家基因內部片段并測定其序列，可以用于分析菌株的變異，適合全球不同實驗室之間的流行菌株數(shù)據(jù)分析比較[7]。MLST對菌株進行分型鑒定試驗，檢測流行克隆株的傳播途徑，大范圍長時間內追蹤病原菌的遺傳譜的變化具有顯著優(yōu)勢。對于細菌性疾病的監(jiān)測，了解傳染源、傳播途徑和預防暴發(fā)性傳染病的發(fā)生有著非常重要的科學意義[8]。本研究利用多位點序列分型(MLST)對浙江省臨床分離的74株糞腸球菌菌株進行基因分型，了解浙江地區(qū)糞腸球菌的來源和相關的遺傳背景。探討糞腸球菌的流行變化趨勢、進化特點及耐藥性特征，為本地區(qū)糞腸球菌感染的預防治療提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 連續(xù)收集2018年1～8月浙江省10個城市28家醫(yī)院臨床分離的糞腸球菌，總計74株。菌株在10個城市的分布如下：杭州27株，湖州5株，寧波6株，紹興2株，臺州3株，衢州1株，麗水2株，舟山6株，桐鄉(xiāng)8株，義烏5株，臨安9株。菌株經VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定藥敏分析儀鑒定為糞腸球菌后即可采用。

1.2 試劑和儀器 PCR擴增儀(杭州郎基科學儀器有限公司)，全自動凝膠成像系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)，Vitek-2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)(Biomérieux)，恒溫金屬浴(杭州博日科技有限公司)，PCR擴增試劑盒(Takara)，細菌培養(yǎng)血平板(Biomérieux)。

1.3 方法

1.3.1 藥敏試驗：參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)2018年標準，采用梅里埃Vitek-2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)對研究菌株進行鑒定及藥敏實驗。

1.3.2 細菌核酸抽提：在1.5 ml的EP管中加入300 μl的無菌水，挑取10個左右的單菌落于EP管內，105℃金屬浴煮10 min，12 000 r/min離心3 min，取上清于新的離心管中作為細菌核酸模板，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 MLST基因檢測：糞腸球菌的7對管家基因(aroE，gdh，gki，gyd，pstS，xpt，yqiL)PCR擴增所用的引物參照MLST網站(http：//www.mlst.net)提供的資料，設計引物后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；PCR反應體系為50 μl：上下游引物濃度均為0.5 pmol/μl，DNA模板為5 μl，10×buffer(含Mg2+)5 μl，dNTP(2.5 mmoL)4 μl，hotTraq酶0.3 μl，ddH2O 34.7 μl。PCR反應條件：95℃變性5 min，然后94℃30 s，退火溫度設為51℃40 s，72℃60 s，共擴增40個循環(huán)。最后72℃再延伸5 min。擴增產物經電泳檢測后直接送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序采用雙向測通方法。

1.4 統(tǒng)計學分析 將7個管家基因序列的測序結果在MLST網站數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得每一管家基因的等位號碼，綜合所有的等位號碼來確定序列型，同時將等位基因譜導入eBurst軟件，構建親緣關系圖。另外，依據(jù)藥敏結果，分析糞腸球菌的耐藥與MLST的關聯(lián)性。

2 結果

2.1 MLST分型結果 見表1。

表1 74株糞腸球菌的MLST分型

備注：*表示新的型別，數(shù)據(jù)庫里不包含。

本次實驗收集臨床分離糞腸球菌菌株中，74株萬古霉素敏感糞腸球菌菌株的MLST分型分為20個ST 型，有3個型別是新的型別(數(shù)據(jù)庫里不包含)，另外17個型別均是數(shù)據(jù)庫里已知的。在這20個ST型中，其中ST16總數(shù)最多，包含21株菌(占28.38%)；其次為ST179，包含20株菌(27.03%)；再次是ST4及ST6，各包含6株菌(占8.11%)；其余ST型只各包含1～3株菌。

2.2 MLST分型親緣關系分析 見圖1。通過MLST分析鑒定，并利用eBurst軟件構建菌株進化關系圖，發(fā)現(xiàn)74株菌株有3個克隆復合體。最普遍流行的克隆復合體是CC16，包含2種ST型(ST16，ST179，其中ST16為原始克隆株)，其次為CC4，包含2種ST型(ST4，ST585，其中ST4為原始克隆株)，再次為CC6，主要以ST6為主，其它的都是相對零散的克隆復合體。

2.3 藥敏試驗結果 見表2。本次實驗收集的74株臨床分離糞腸球菌菌株中，暫未發(fā)現(xiàn)萬古霉素耐藥的菌株，除萬古霉素外，最為敏感的抗生素還有替考拉寧、氨芐西林、利奈唑胺及呋喃妥因，敏感率均為100%；耐藥程度高的抗生素主要是四環(huán)素及紅霉素，其耐藥率分別為89.2%和73.0%；其次是喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星和左氧氟沙星，其耐藥率分別為39.2%和36.5%，再次是高濃度的慶大霉素，耐藥率為32.4%；對利福平的耐藥率為16.2%，耐藥率較低的是青霉素，耐藥率為5.4%。

表2 糞腸球菌對抗生素藥敏試驗結果

圖1 74株糞腸球菌的親緣關系圖

2.4 藥物敏感性與MLST分型的相關性 分析優(yōu)勢型別的ST型與藥物敏感性的關系，ST16主要是對四環(huán)素和紅霉素產生耐藥，分別是100%和90%，其次是利福平達33%，對高濃度慶大霉素及喹諾酮類耐藥，在20%左右；ST179的耐藥譜與ST16類似，主要也是對四環(huán)素和紅霉素產生耐藥，分別為100%和95%，其次是高濃度慶大霉素及喹諾酮類耐藥，約占35%，但ST179對利福平均表現(xiàn)為敏感。ST6與ST4雖收集的菌株數(shù)比較少，分別只有6株，但是6株ST6型菌株對四環(huán)素、喹諾酮類藥物及高濃度慶大霉素均全部耐藥，對紅霉素有1株表現(xiàn)為敏感；6株ST4型菌株對紅霉素表現(xiàn)為耐藥的有5株，對喹諾酮表現(xiàn)為耐藥的有4株，對四環(huán)素、高濃度的慶大霉素及青霉素表現(xiàn)為耐藥的各為3株，在本次實驗中，僅發(fā)現(xiàn)ST4型的糞腸球菌會對青霉素產生耐藥。

3 討論

腸球菌為臨床較常見的一種致病菌。近年來腸球菌引起的醫(yī)院感染逐漸增多，造成其感染或暴發(fā)流行的原因復雜。利用病原細菌分離株的多位點序列分析(MLST)，可以發(fā)現(xiàn)或證實感染的來源，能夠針對一起暴發(fā)疫情追蹤到病原菌的精細傳播鏈，發(fā)現(xiàn)新的傳播模式和途徑等等，可以對疾病的預防及治療提供參考依據(jù)，但是目前國內對糞腸球菌的基因分型研究相對較少。

本研究中收集了74株糞腸球菌進行MLST分析，均來源于浙江地區(qū)的不同家醫(yī)院，有助于初步了解浙江地區(qū)糞腸球菌的遺傳背景資料。研究分析的74株糞腸球菌可以分為20個STs，其中優(yōu)勢型別為ST179和ST16，同屬于克隆復合體CC16。參考以往文獻，從CC16序列型感染和分布情況分析，ST16很可能是一種在不同地區(qū)、不同來源間流行的感染菌株，吳敏等[9]人在分析廣州地區(qū)多重耐藥糞腸球菌分離株的ST型，發(fā)現(xiàn)ST16最多；鄒紹偉等[10]人對包頭地區(qū)的58株糞腸球菌進行了ST分析，發(fā)現(xiàn)ST179為該地區(qū)的優(yōu)勢菌株。趙娣等[11]人則在研究動物來源糞腸球菌菌株之間的遺傳關系中發(fā)現(xiàn)豬病變內臟、生鮮肉樣、豬糞、蜂猴和雞源中均有ST16的分布。另外，在歐洲多個國家及日本的醫(yī)院和社區(qū)分離的糞腸球菌研究[12-13]表明，亦是以CC16(ST16為主要代表)克隆群的多重耐藥糞腸球菌為主要感染菌株，在很多醫(yī)院和社區(qū)都有分布。

KUCH等[12]通過MLST分析歐洲收集的386株糞腸球菌分離株，發(fā)現(xiàn)由MLST分析和隨后的eBURST聚類確定的特定類型主要屬于六種克隆復合物(CC2，CC16，CC21，CC30，CC40和CC87)在醫(yī)院抗生素耐藥性的傳播中發(fā)揮著重要作用，并在一些國家促進了更高的耐藥率，這說明糞腸球菌的耐藥性與ST之間有一定的相關性。本研究中屬于同一克隆復合體CC16的優(yōu)勢菌株ST179與ST16，其兩者的耐藥譜也很接近，區(qū)別僅在于對利福平的耐藥程度不一致，ST6型雖只有6株，但均表現(xiàn)為對四環(huán)素、喹諾酮類藥物及高濃度慶大霉素耐藥，這與尼日利亞GHEBREMEDHIN等[12，14]人在糞腸球菌人類分離株中發(fā)現(xiàn)高濃度的氨基糖苷類耐藥主要集中在ST6分型上的結論相符。ST4屬于CC4克隆株，該克隆株雖不屬于臨床大量出現(xiàn)的菌株，但是此克隆株曾在其他的亞太國家造成嚴重感染。在孫瑯等[14-15]人的研究中，僅有的一株萬古霉素耐藥糞腸球菌為ST4型。本研究未曾檢測出對萬古霉素、替考拉寧、氨芐西林耐藥的糞腸球菌菌株，但是發(fā)現(xiàn)對于青霉素耐藥的糞腸球菌只存在于ST4型中。

近年來，由于臨床抗生素的大量使用，腸球菌的耐藥性也逐漸增強，因此充分了解和掌握腸球菌的耐藥機制對防止和控制此類細菌感染的發(fā)生、傳播具有重要意義。MLST選用7個管家基因，通過基因序列分析的方法，揭示細菌各菌株之間的進化關系，相比于其他分型方法如電泳帶型分析，其結果客觀、準確，且重復性好，分辨率高。因此本研究課題期望在掌握該方法的同時，繼續(xù)收集樣本建立自己的糞腸球菌庫，同時對不同的ST型進行更深一步的研究，比如通過基因組測序考察它們是否攜帶不同耐藥基因，通過質譜儀分析相關代謝產物等，以便長期、大范圍地觀察和研究糞腸球菌在不同條件下耐藥和致病方面發(fā)生的變化。