非小細(xì)胞肺癌患者組織EGFR基因突變狀況及預(yù)后分析*

劉延梅，馬少君，馬 慶，張 靜

(陜西省人民醫(yī)院a.西院二病區(qū)；b.放射科，西安 710068)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，在中國(guó)，肺癌的發(fā)病率和死亡率均位居所有惡性腫瘤的首位[1]，肺癌的兩種主要形式是非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small-cell lung cancer，SCLC)，非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌的80%～85%[2]。肺腺癌的發(fā)病率已超過肺鱗癌，超過四分之三的肺癌患者在診斷時(shí)處于晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)，導(dǎo)致更高的死亡[3]。近年來，表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)等靶向藥物已經(jīng)成為晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)重要的治療方式之一，一系列國(guó)內(nèi)外臨床研究已證實(shí)EGFR靶向治療能顯著降低在EGFR-TKIs基因突變的晚期NSCLC患者疾病進(jìn)展或死亡風(fēng)險(xiǎn)，改善患者生活質(zhì)量，而這些臨床研究和系統(tǒng)分析均指出EGFR基因突變檢測(cè)是晚期肺癌患者使用EGFR-TKIs治療的先決條件，本研究旨在探討NSCLC患者組織中EGFR基因突變狀況及其與EGFR-TKI療效的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2014年1月～2017年5月陜西省人民醫(yī)院住院治療的NSCLC患者石蠟包埋組織標(biāo)本共111例，其中男性61例，平均年齡57.5±5.6歲，女性50例，平均年齡56.8 ±7.2歲；肺腺癌95例，其他非小細(xì)胞肺癌16例，Ⅰ和Ⅱ期患者5例，Ⅲ和Ⅳ期患者106例。所有患者確診后一線經(jīng)EGFR-TKIs治療，每天服用吉非替尼250 mg，每天一次，厄洛替尼150 mg，每天一次或?？颂婺?25 mg，每天三次，靶向治療期間未接受其他放化療、粒子植入及手術(shù)治療，所有患者均選取肺組織樣本。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑：石蠟切片樣品DNA提取試劑選用廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司的核酸提取試劑(型號(hào)：FFPE DNA，Cat NO.ADx-FF01)；EGFR基因檢測(cè)使用熒光PCR法，采用艾德生物公司人類EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：ADx-EG01-SL，ADx-EG08-SL)。

1.2.2 儀器：ABI7500熒光定量擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)，Nanodrop 2000微量分光光度計(jì)(美國(guó)Nanodrop公司)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 石蠟樣本DNA提?。河刹±磲t(yī)師確定腫瘤區(qū)域后，用一次性手術(shù)刀片刮取5～10 μm石蠟切片5～10張到EP管中，按照FFPE核酸提取試劑盒的說明書提取DNA。

1.3.2 EGFR基因熒光擴(kuò)增：提取的DNA通過Nanodrop微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和質(zhì)量，將DNA濃度稀釋到1～3 ng/L，按照人類EG-FR基因突變檢測(cè)試劑盒說明書的程序擴(kuò)增并分析結(jié)果。

1.4 隨訪方法生存評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.4.1 隨訪方法：自患者開始接受化療即開始隨訪，每?jī)蓚€(gè)化療周期進(jìn)行療效評(píng)估，化療結(jié)束后每3個(gè)月門診隨訪，隨訪時(shí)間為：健在患者隨訪至今，死亡患者隨訪至死亡時(shí)間。根據(jù)病情需要可行胸片、CT等相關(guān)檢查。

1.4.2 生存評(píng)價(jià)指標(biāo)：隨訪患者無進(jìn)展生存時(shí)間(PFS)和總生存時(shí)間(OS)。定義PFS為從檢測(cè)分組開始到第一次腫瘤進(jìn)展或死亡時(shí)間，OS為從檢測(cè)分組開始至任何原因引起死亡的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確概率法，Kaplan Meier法繪制生存曲線，生存率差異采用log-rank檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者EGFR基因突變類型分析 共有111例NSCLC患者進(jìn)行了EGFR基因突變的檢測(cè)，34例EGFR基因突變，突變率30.6%，其中19外顯子缺失突變24例(70.6%，24/34)，第21外顯子L858R點(diǎn)突變10例(29.4%，10/34)。

2.2 NSCLC患者臨床病理特征與EGFR表達(dá)關(guān)系 見表1。女性NSCLC患者的EGFR基因突變率(44%)明顯高于男性患者(19.6%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.65，P=0.007 2)。不吸煙NSCLC患者的EGFR基因突變率(41.4%)明顯高于吸煙NSCLC患者(12.2%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.40，P=0.001 3)。年齡<60歲的NSCLC患者EGFR基因突變率(35%)與年齡≥60歲患者(25.4%)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.17，P=0.27)，EGFR基因突變與疾病的組織學(xué)和分期無關(guān)(P>0．05)。肺腺癌患者EGFR基因突變率(34.7%) 明顯高于非腺癌的NSCLC患者(6.3%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.29，P=0.018)。TNM分期各期NSCLC患者EGFR基因突變率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.87，P=0.39)。

2.3 EGFR基因突變與PFS及OS關(guān)系 一線TKIs治療EGFR基因突變患者的無進(jìn)展生存期中位時(shí)間為12個(gè)月，而野生型EGFR患者的無進(jìn)展生存期中位時(shí)間為3個(gè)月，經(jīng)log-rank(MantelCox)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P<0.000 1，EGFR基因突變患者的總體存活時(shí)間也明顯高于野生型患者(20個(gè)月 vs 9個(gè)月)，經(jīng)log-rank(Mantel Cox)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P=0.000 2。見圖1。

表1 NSCLC患者EGFR突變狀況與臨床病理特征的關(guān)系[n=111，n(%)]

注：*Fisher精確概率法。

圖1 A.EGFR基因突變型與野生型患者的PFS曲線；B.EGFR基因突變型與野生型患者的OSF曲線

3 討論

EGFR是一種跨膜酪氨酸激酶受體，該受體激酶域的激活對(duì)癌細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)的相關(guān)信號(hào)傳遞具有重要意義，EGFR基因主要的突變?yōu)?9外顯子缺失(約占45%)和21外顯子L858R突變(約占40%)[4]，二者均可導(dǎo)致酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域活化，且均為EGFR-TKIs的敏感性突變，非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變的發(fā)現(xiàn)和對(duì)TKIs的敏感性是近十年來在NSCLE患者治療方面取得的重大突破[5]，近年來EGFR-TKIs已逐漸成為EGFR基因突變的晚期NSCLC患者的一線標(biāo)準(zhǔn)治療手段，多項(xiàng)研究證明EGFR酪氨酸激酶域的激活突變，主要發(fā)生在細(xì)胞酪氨酸激酶區(qū)的19，21外顯子上，特別是19外顯子缺失突變和21外顯子的替代突變(L858R)，是EGFR-TKIs療效和預(yù)后的最佳預(yù)測(cè)因子[6]。NSCLC中EGFR基因突變狀況在不同種族間差異很大，有報(bào)道顯示在北美和歐洲，這一比例為10%～15%，而在包括中國(guó)、韓國(guó)和日本在內(nèi)的東亞地區(qū)，這一比例為26%～30%[7]，本研究EGFR基因突變率為30.6%，在所有EGFR突變的患者中，女性約占三分之二(64.7%)，非吸煙者占85.3%，略高于文獻(xiàn)報(bào)道，可能與樣本數(shù)較少有關(guān)。EGFR基因突變已被發(fā)現(xiàn)與腺癌組織學(xué)、婦女和非吸煙者高度相關(guān)[8]，在本研究中，EGFR基因突變率在腺癌組織學(xué)更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.29，P=0.018)，而女性(44%)和非吸煙者(41.4%)的EGFR基因突變率明顯高于男性和吸煙者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.65，P=0.0072；χ2=10.40，P=0.001 3)，這與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致。

研究顯示[9]，如果EGFR基因突變檢測(cè)只局限于女性31%的患者將會(huì)漏診，如果EGFR基因突變檢測(cè)只局限于不吸煙者將會(huì)有40%的患者漏診，如果EGFR突變檢測(cè)局限于女性從不抽煙57%的患者會(huì)漏診，本研究中30.6%患者的EGFR突變，EGFR基因突變檢測(cè)診斷使其受益于TKI治療。全世界越來越多的學(xué)者達(dá)成共識(shí)，如果組織是可用的和盡可能的獲取的話，所有病理診斷NSCLC的患者都應(yīng)該進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)診斷[10]。本研究EGFR基因突變類型的頻率，75%的患者外顯子19的缺失突變，25%的患者外顯子21的L858R點(diǎn)突變，根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)[11]，大約有45%～54%的EGFR基因突變是19外顯子的缺失突變，40%的EGFR突變是21外顯子L858R的點(diǎn)突變，4%～9%的突變是20外顯子突變的報(bào)道，有所差異。

EGFR酪氨酸酶抑制劑(EGFR-TKIs)已經(jīng)被世界各地接受為激活EGFR突變的患者的標(biāo)準(zhǔn)一線治療手段，在生存分析方面，在本研究中使用TKIs治療的EGFR基因突變患者無進(jìn)展生存期PFS中位數(shù)(12個(gè)月)明顯長(zhǎng)于使用一線TKIs治療的EGFR陰性患者(3個(gè)月)，通過log-rank(Mantel Cox)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.000 1。EGFR基因突變患者20個(gè)月時(shí)的總體生存中位數(shù)(OS)明顯長(zhǎng)于EGFR陰性患者的總體生存中位數(shù)(9個(gè)月)，通過log-rank(Mantel Cox)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P=0.000 2，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。我們的結(jié)果與Noronha等[12]人最近發(fā)表的數(shù)據(jù)相當(dāng)，他們報(bào)道TKIs治療EGFR野生型和EGFR突變患者的中位PFS分別為4個(gè)月和10個(gè)月，突變型和野生型EGFR患者的中位OS分別為21個(gè)月和10個(gè)月。在無EGFR基因突變的患者中，TKI治療的存活率差異可能是由于缺乏高靈敏度的方法來檢測(cè)EGFR基因突變，很有可能少數(shù)被標(biāo)記為EGFR野生型的患者可能實(shí)際上已經(jīng)存在基因突變，而以現(xiàn)有檢測(cè)方法無法檢測(cè)到這種突變。

綜上所述，在我們的研究中EGFR基因突變狀況和臨床特征及預(yù)后相關(guān)性與文獻(xiàn)報(bào)道相近，而且在EGFR酪氨酸酶抑制劑(EGFR-TKIs)治療下，患者無進(jìn)展生存率和總體生存率顯著提高，這些數(shù)據(jù)表明EGFR基因突變檢測(cè)應(yīng)作為NSCLC患者靶向治療的篩查條件，以便更多的NSCLC患者能受益于EGFR-TKIs治療。