孕婦外周血無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用*

燕 鳳，燕 飛，姚念玲，陳必良，徐 慧，鄭 嬌，任菊霞，程 璐，李春艷，張建芳

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710032；2.石家莊學(xué)院，石家莊 050035)

尋求一種安全、簡單、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的產(chǎn)前篩查及診斷方案，對(duì)降低出生缺陷具有重要意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測(NIPT)是基于母體外周血中含有胎兒游離DNA片段(cell-free fetal DNA)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種檢測技術(shù)[1]。NIPT技術(shù)對(duì)常見的三大染色體非整倍體(T21，T18，T13)有較高的敏感度和特異度，但是，NIPT檢測的準(zhǔn)確性也遠(yuǎn)未達(dá)到以往報(bào)道的100%，因此，本研究通過對(duì)493例在西京醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷中心接受NIPT檢查者的陽性結(jié)果進(jìn)行分析驗(yàn)證，比較NIPT與有創(chuàng)產(chǎn)前診斷結(jié)果的符合率，探討NIPT技術(shù)在胎兒染色體非整倍體疾病的早期診斷和預(yù)防中的優(yōu)勢和應(yīng)用價(jià)值，為該技術(shù)在產(chǎn)前診斷的合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析從2015年11月～2018年6月在西京醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷中心因NIPT篩查結(jié)果高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦羊水資料493例，孕婦年齡為33.71±3.43周齡，其中年齢超過35歲的孕婦81例。NIPT檢測時(shí)的孕周為17.69±2.13周齡。雙胎孕婦72例，單胎孕婦421例。孕婦NIPT篩查的指征：NT增厚，血清學(xué)篩查陽性，高齡孕婦年齡≥35歲，異常生育史，胎兒超聲檢查異常等。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑：無創(chuàng)DNA試劑采用博奧和貝瑞和康試劑盒，F(xiàn)ISH試劑采用金菩嘉探針，芯片采用AffymetrixCytoScan 750K CNV+SNP芯片，羊水培養(yǎng)基采用張氏和Gibco細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.2.2 儀器：無創(chuàng)博奧平臺(tái)采用晶芯Bioelectron4000測序平臺(tái)，無創(chuàng)貝瑞和康平臺(tái)采用NextSeqCN500測序平臺(tái)，F(xiàn)ISH采用IMSTAR FISH熒光原位雜交分析系統(tǒng)，芯片采用Affymetrix CytoScan芯片平臺(tái)，羊水培養(yǎng)采用Thermo培養(yǎng)箱。

1.3 方法

1.3.1 NIPT檢測技術(shù)：抽取孕婦外周血5 ml 用EDTA抗凝，提取血漿游離DNA，經(jīng)過末端修復(fù)，接頭連接，構(gòu)建文庫，PCR擴(kuò)增，富集后得到測序文庫，質(zhì)控合格后采用Ion Proton高通量測序儀檢測，結(jié)果進(jìn)行高通量分析，并通過生物信息學(xué)分析計(jì)算Z值，當(dāng)Z值≥3，三體高風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng)Z值≤3，單體高風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)孕婦進(jìn)行羊水穿刺驗(yàn)證結(jié)果。對(duì)無異常結(jié)果進(jìn)行產(chǎn)前產(chǎn)后電話追蹤隨訪，判斷有無假陰性出現(xiàn)。

1.3.2 核型染色體制備：受檢者妊娠孕周均在18～36周，B超定位經(jīng)腹部羊水穿刺取樣，每次取材的羊水量為20～30 ml，將新鮮的羊水移入15 ml離心管1 500 r/min離心5 min，去上清留沉淀0.5 ml，分別接種于兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，采用G顯帶法，進(jìn)行羊水細(xì)胞染色體核型分析。

1.3.3 FISH：未培養(yǎng)的羊水6 ml，2 000 r/min離心10 min，棄上清。羊水細(xì)胞加6 ml的KCl，37℃低滲21 min，2 000 r/min離心10 min，棄上清。羊水細(xì)胞用甲醇∶冰醋酸3∶1固定液固定10 min，2 000 r/min離心10 min，棄上清，重復(fù)2次，第三次加1～2 ml固定液后，混勻滴片，烤片機(jī)上50℃干燥90 min，溫度冷卻至室溫后放2×SSC 10 min，再逐次放入70 ml/dl，85 ml/dl和100 ml/dl的酒精中各2 min洗片，室溫干燥，玻片放入70℃預(yù)熱好的甲酰胺變性液中預(yù)變性5 min后，快速放入-20℃預(yù)冷的70 ml/dl，85 ml/dl和100 ml/dl的酒精脫水3 min，晾干。避光配好探針后放73℃水浴鍋?zhàn)冃? min，加探針到玻片上，封片膠封片，46℃雜交過夜16 h后，46℃預(yù)熱好的2×SSC洗片10 min，室溫70 ml/dl，85 ml/dl和100 ml/dl的酒精中各2 min洗片，室溫避光干燥，加蓋玻片鏡下檢測分析，每個(gè)雜交區(qū)至少數(shù)100個(gè)信號(hào)強(qiáng)、無重疊的雜交細(xì)胞。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：CSP18/X/Y探針和GLP13/21探針至少數(shù)100個(gè)細(xì)胞，非整倍體細(xì)胞比例>60%判為非整倍體，非整倍體細(xì)胞比列>30%為嵌合體。

1.3.4 基因芯片：抽取10 ml羊水行基因芯片分析，采用Affymetrix CytoScan 750K CNV+SNP芯片進(jìn)行檢測，以數(shù)據(jù)通過ChAs軟件進(jìn)行分析。CNV對(duì)比CNVs數(shù)據(jù)庫OMIM(http：//omin.o-rg)，ISCA(https：//www.iscaconsortium.org/isca/ucsc/hg19)，DECIPHER(https：//decipher．sanger．a(chǎn)c．uk) 比對(duì)分析，在Pubmed數(shù)據(jù)庫上檢索相同或相似區(qū)段的CNV研究文獻(xiàn)，綜合分析。

1.3.5 追蹤隨訪：對(duì)因無創(chuàng)陽性做羊水穿刺確診的孕婦進(jìn)行電話隨訪，隨訪其妊娠結(jié)局或出生后孩子的性別及出生后的健康狀況。

2 結(jié)果

2.1 無創(chuàng)DNA結(jié)果與介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果的比較分析 見表1，表2，表3。

表1 NIPT高風(fēng)險(xiǎn)病例有創(chuàng)產(chǎn)前診斷結(jié)果

注：PPV為真陽性病例數(shù)/總病例數(shù)。

NIPT檢出孕婦外周血493例陽性，其中21三體、13三體、18三體、性染色體和其他染色體陽性例數(shù)分別為：232，32，46，125和58。通過介入性產(chǎn)前診斷分別確定他們的真陽性為：21三體178例，13三體3例，18三體23例，染色體異常46例，其他染色體7例。陽性預(yù)測值(PPV)分別為：76.7%，9.4%，50.0%，36.8%，12.1%。五組陽性預(yù)測值間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 NIPT性染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)病例有創(chuàng)產(chǎn)前診斷結(jié)果

表3 NIPT提示的其他非整倍體病例的有創(chuàng)產(chǎn)前診斷結(jié)果

2.2 隨訪結(jié)果 493例無創(chuàng)DNA結(jié)果異常的孕婦均對(duì)其進(jìn)行了電話隨訪，其中經(jīng)產(chǎn)前診斷確定染色體異常結(jié)果共236例，引產(chǎn)235例，其中1例胎兒核型46，XX/46，XY(17%)，孕婦不想引產(chǎn)，經(jīng)隨訪出生后3個(gè)月未發(fā)現(xiàn)異常，但這還需要長期跟蹤隨訪其生育能力及性腺發(fā)育才能確定。有1例孕婦因過分焦慮無創(chuàng)提示21三體，產(chǎn)前結(jié)果還未出來時(shí)經(jīng)勸說無效，隨訪后發(fā)現(xiàn)孕婦已引產(chǎn)。其中256例無創(chuàng)DNA假陽性結(jié)果經(jīng)染色體核型，F(xiàn)ISH和基因芯片確認(rèn)染色體核型正常的出生后電話隨訪，有6例沒有隨訪到，其余家屬均口述發(fā)育正常、健康，隨訪發(fā)現(xiàn)性別與染色體結(jié)果均一致。

3 討論

我國出生缺陷發(fā)生率高達(dá)5.6%[2]，其中，染色體異常在新生兒中的發(fā)生率約占0.5%～1%[3]，為了預(yù)防出生缺陷，產(chǎn)前篩查與診斷工作尤為重要，傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方式以侵入性為主，但該技術(shù)存在一定風(fēng)險(xiǎn)性，有0.5%～2.0%的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)并易導(dǎo)致相應(yīng)并發(fā)癥[4]，因此孕婦外周血無創(chuàng)DNA技術(shù)以無創(chuàng)性和相對(duì)較高的準(zhǔn)確性在臨床獲得了較廣泛的應(yīng)用。然而，NIPT并不是一個(gè)診斷性的篩查胎兒非整倍體的方法，因此，NIPT的陽性結(jié)果需要侵入性的產(chǎn)前診斷技術(shù)去確定[5]。據(jù)此，我們驗(yàn)證了493例，NIPT提示五對(duì)常見非整倍體及其他染色體高風(fēng)險(xiǎn)病例，得出NIPT對(duì)五對(duì)常見染色體非整倍體的篩查以21三體最為準(zhǔn)確，陽性預(yù)測值為76.7%(178/232)，對(duì)13三體的篩查準(zhǔn)確性最弱，陽性預(yù)測值僅為9.4%(3/32)。關(guān)于13三體篩查準(zhǔn)確性較低的原因，有研究表明可能是由于13號(hào)染色體的鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸和胞嘧啶脫氧核糖核苷酸含量較低，導(dǎo)致測序時(shí)產(chǎn)生偏差，或由于13三體孕婦的胎盤較小，釋放入母血的游離胎兒DNA數(shù)量相對(duì)較少造成[6]。2015年的研究指出，妊娠女性血漿的游離DNA分子濃度顯著高于非妊娠健康女性的游離DNA分子的相應(yīng)濃度，妊娠母體血漿游離總DNA片段大小主要集中于100 bp左右，如果要研發(fā)基于妊娠母體游離DNA的無創(chuàng)性產(chǎn)前分子診斷技術(shù)，需要將PCR擴(kuò)增片段控制在100 bp以內(nèi)，才能得到更為準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，有效地避免大片段擴(kuò)增可能導(dǎo)致的假陰性結(jié)果[7]。同時(shí)我們的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)無創(chuàng)對(duì)性染色體非整倍體的檢測相對(duì)較低，這是由于性染色體的檢測中，由于X和Y染色體上存在基因同源性等影響因素，其對(duì)性染色體疾病診斷的檢出率和準(zhǔn)確率受到一定限制，性染色體疾病和部分染色體片段重復(fù)和缺失的檢測可能是無創(chuàng)性產(chǎn)前基因檢測技術(shù)亟待解決的問題[8]。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，NIPT技術(shù)對(duì)性染色體中45，X的陽性預(yù)測值最低，其原因可能與限制性胎盤嵌合體，孕婦血清胎兒游離DNA含量低，母親染色體嵌合及母親存在潛在性腫瘤及X染色體的非隨機(jī)失活都有關(guān)系[9]。目前NIPT篩查大致可分為兩大類：一類是目前使用比較成熟的5對(duì)染色體13，18，21和性染色體的篩查；另一類是除5對(duì)染色體外的其他染色體非整倍體的篩查，準(zhǔn)確性較差。因此，無創(chuàng)DNA對(duì)其它染色體的檢測一般在報(bào)告單中不展現(xiàn)，只是起提示作用。NIPT結(jié)果假陽性也受到母體嵌合體的影響，如母體為染色體異常者、母體的體細(xì)胞嵌合、母體的癌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等因素都會(huì)增加NIPT假陽性的發(fā)生率。WANG[10]等研究發(fā)現(xiàn)NIPT中8.6%的假陽性結(jié)果都是由母體嵌合引起的。因此，隨訪中當(dāng)我們發(fā)現(xiàn)NIPT結(jié)果和侵入性產(chǎn)前診斷結(jié)果不一致時(shí)，可考慮對(duì)母體進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)分析，通過對(duì)母體的細(xì)胞遺傳學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)母體嵌合體對(duì)NIPT結(jié)果的影響，在這種情況下是可以避免不必要的侵入性診斷檢測。

綜上所述，孕婦外周血無創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查存在一定假陽性結(jié)果，孕婦外周血無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測陽性結(jié)果必須通過羊膜腔穿刺進(jìn)行確診。孕婦外周血無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果陰性時(shí)，一定要嚴(yán)格進(jìn)行B超檢查。當(dāng)B超檢查結(jié)果正常時(shí)，孕婦按照醫(yī)院規(guī)定的產(chǎn)檢流程即可。目前，孕婦外周血無創(chuàng)DNA技術(shù)對(duì)21三體綜合征具有較高的準(zhǔn)確率，這在同類研究也有報(bào)道[1]，目前并不能代替侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)。隨著測序成本的下降以及技術(shù)和算法的進(jìn)步，解決方案的優(yōu)化，孕婦外周血無創(chuàng)DNA對(duì)基因組的分析范圍、分辨率和深度將會(huì)增加。未來的幾年許多國家將會(huì)進(jìn)一步普及孕婦外周血無創(chuàng)DNA技術(shù)，這將導(dǎo)致侵入性產(chǎn)前診斷會(huì)大幅度的減少。