原發(fā)性肝癌患者外周血CD39+，CD73+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞的表達(dá)及其與肝損傷的相關(guān)性*

沈海濤，焦榮紅，陸志成，徐 正，謝鈺帆，蔣秀娣

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200137；2.上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201299)

原發(fā)性肝癌(HCC)是一種惡性程度極高的惡性腫瘤，臨床治療一直未取得顯著性突破，預(yù)后較差，研究學(xué)者愈發(fā)關(guān)注免疫治療及其預(yù)后指標(biāo)的研究。近年來，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)作為CD4+T細(xì)胞的一種重要表型，在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮著特有的抵抗外源性抗原和免疫調(diào)節(jié)作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)CD39+，CD73+在CD4+Treg細(xì)胞上的活化及表達(dá)是免疫抑制機(jī)制一個(gè)關(guān)鍵構(gòu)成部分，現(xiàn)已證實(shí)其在感染、免疫性疾病、機(jī)械性損傷及缺血再灌注損傷等疾病的炎性反應(yīng)控制過程中扮演著重要角色[2-4]。研究證實(shí)，免疫功能紊亂與肝損傷密切相關(guān)，但關(guān)于肝癌患者的免疫狀態(tài)與肝功能損傷機(jī)制之間的關(guān)系仍缺乏足夠證據(jù)[5]。本研究擬采用流式細(xì)胞技術(shù)，檢測(cè)肝癌患者外周血CD39+，CD73+Treg表達(dá)水平，探討其與患者肝損傷的相關(guān)性，旨在為肝癌的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2013年1月～2017年12月在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七醫(yī)院收治的原發(fā)性肝癌患者(HCC組)，共220例。入組標(biāo)準(zhǔn)：①均符合《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南(2015年版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，并經(jīng)手術(shù)病理診斷證實(shí)；②均未接受過放化療、分子靶向等抗腫瘤治療；③排除肝炎病毒感染、自身免疫性疾病或心肝腎等重要器官功能障礙者。其中男性143例，女性77例，年齡45～79(53.7±5.2)歲。TNM分期：Ⅰ期86例，Ⅱ期93例，Ⅲ期41例；Child-Pugh肝功能分級(jí)：A級(jí)78例，B級(jí)106例，C級(jí)36例。并發(fā)肝損傷89例，無肝損傷131例。以ALT超過正常值2倍以上(1%肝細(xì)胞損傷可致ALT成倍升高)，即ALT≥80 IU /L作為判定肝損傷的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。選取同期收治的慢性乙肝患者(CHB組，n=100)及健康體檢者(C組，n=100)。三組研究對(duì)象在年齡、性別構(gòu)成比等一般資料方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 試劑和儀器 TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；7600型全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑盒(日立公司)；FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Pharmingen公司)。

1.3 方法 采集HCC組、CHB組和C組清晨空腹靜脈血5 ml，分裝于兩個(gè)EDTA抗凝管中。取2 ml充分顛倒混勻，3 000 r/min，離心半徑20 cm，高速離心10 min，保留血漿備檢。采用全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑盒檢測(cè)肝功能指標(biāo)，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。另取3 ml離心去除血漿后，PBS稀釋，加入到含淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，2 500 r/min離心20 min，吸取中間的白色絮狀層，再用PBS洗滌2遍，即可分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)。取2×106個(gè)PBMC染色、孵育后，采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀測(cè)定CD4+Treg細(xì)胞中CD39+，CD73及自然殺傷(NK)細(xì)胞比例。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例表達(dá)情況 見表1。與C組比較，CHB組、HCC組外周血CD4+Treg細(xì)胞中CD39+，CD73細(xì)胞比例明顯升高，而NK細(xì)胞比例明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與CHB組比較，HCC組外周血CD4+Treg細(xì)胞中CD39+，CD73+細(xì)胞比例明顯升高，而NK細(xì)胞比例明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例表達(dá)情況比較

2.2 原發(fā)性肝癌患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例與肝功能損傷的關(guān)系 見表2。并發(fā)肝損傷的肝癌患者外周血CD4+Treg細(xì)胞中CD39+，CD73+細(xì)胞比例明顯高于無肝損傷的肝癌患者，而NK細(xì)胞比例則明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 原發(fā)性肝癌患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例與肝功能損傷的關(guān)系

2.3 相關(guān)性分析 見表3。Pearson相關(guān)性分析顯示，CD39+，CD73+與NK細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.452，-0.424，均P<0.05)。AST，ALT與CD39+，CD73+細(xì)胞比例呈顯著正相關(guān)，與NK細(xì)胞比例呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

表3 原發(fā)性肝癌患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性(r)

3 討論

HCC的發(fā)生機(jī)制尚未十分明確，多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為其與患者的細(xì)胞免疫功能改變有關(guān)[8]。當(dāng)機(jī)體免疫功能下降時(shí)，腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高，且腫瘤進(jìn)行性浸潤(rùn)生長(zhǎng)使免疫功能進(jìn)一步受到抑制[9]。PBMCs是包含T淋巴細(xì)胞等多種免疫活性細(xì)胞的集合體，在抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。Treg作為具有獨(dú)立功能的免疫抑制細(xì)胞亞群，能夠抑制過度的炎性免疫反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)性，并對(duì)組織器官起到保護(hù)作用，其在腫瘤微環(huán)境的作用一直是近年來的研究熱點(diǎn)[10-11]。有研究顯示，Treg可通過阻斷效應(yīng)T細(xì)胞、NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞及病毒的殺傷作用，介導(dǎo)免疫逃逸，發(fā)揮中心免疫耐受，一定程度上促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[12]。CD39+，CD73+均特異地表達(dá)于Treg細(xì)胞表面，構(gòu)成該細(xì)胞免疫抑制功能的重要環(huán)節(jié)[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)重要分子通路：胞外酶CD39+，CD73+腺苷通路，其中CD39+作為鈣鎂依賴的細(xì)胞外雙磷酸酶，通過水解ATP，ADP為單磷酸腺苷，發(fā)揮抵抗血小板聚集、抑制炎癥反應(yīng)等作用。而CD73+屬于細(xì)胞外5’核苷酸酶，通過糖基-磷脂酰肌醇與CD39協(xié)同表達(dá)于細(xì)胞膜外的一種多功能糖蛋白，可將單磷酸腺苷進(jìn)一步水解為腺苷，后者可與CD8+T，NK細(xì)胞等效應(yīng)性T細(xì)胞表面的腺苷1型嘌呤G蛋白偶聯(lián)，發(fā)揮免疫抑制作用[14-15]。本研究結(jié)果顯示，HCC組外周血CD4+Treg細(xì)胞中CD39+，CD73+細(xì)胞比例較C組和CHB組明顯升高，而NK細(xì)胞比例則明顯下降(P<0.05)，說明HCC患者免疫細(xì)胞分布異常，Treg亞群變化不平衡，存在免疫功能抑制，與Turcotte等[16]研究結(jié)果一致。大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，采用單克隆抗體等CD39+抑制劑，阻斷其促腫瘤作用，可特異性抑制Treg細(xì)胞的抗腫瘤免疫作用[17]。Bonner等[18]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過基因敲除小鼠CD73+后，可明顯抑制惡性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移。目前研究認(rèn)為，肝癌所致肝功能損傷主要與以下兩個(gè)方面因素有關(guān)：①腫瘤侵襲引起局部肝細(xì)胞壞死、膽管阻塞，隨著腫瘤的進(jìn)展可能破壞肝臟生理結(jié)構(gòu)，加重肝功能受損；②非正?；罨拿庖叻磻?yīng)是導(dǎo)致肝臟免疫功能損害的關(guān)鍵[19-20]。本組病例中，并發(fā)肝損傷的肝癌患者外周血CD4+Treg細(xì)胞中CD39+，CD73+細(xì)胞比例明顯高于無肝損傷的肝癌患者，而NK細(xì)胞比例則明顯降低(P<0.05)，提示HCC患者CD39+，CD73+細(xì)胞的表達(dá)與肝功能損傷存在相關(guān)性，并發(fā)肝損傷患者免疫功能抑制更為明顯。相關(guān)性分析顯示，CD39+，CD73+與NK細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，且AST，ALT與CD39+，CD73+細(xì)胞比例呈顯著正相關(guān)，與NK細(xì)胞比例呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，進(jìn)一步驗(yàn)證了CD4+Treg細(xì)胞與肝損傷的關(guān)系。Xing等[21]研究認(rèn)為，肝功能損傷早期HCC患者免疫功能處于亢進(jìn)狀態(tài)，晚期患者肝功能損傷加重，免疫功能逐漸轉(zhuǎn)為抑制狀態(tài)。

綜上所述，HCC患者外周血CD39+，CD73+Treg表達(dá)水平明顯升高，且與肝損傷密切相關(guān)。阻斷CD39+，CD73+的表達(dá)可能有助于減輕肝損傷，并有望成為抗腫瘤免疫治療的一種安全有效的途徑。