農(nóng)業(yè)廢棄物柑橘皮渣堆肥工藝優(yōu)化及其微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律研究

劉智萍，夏家?guī)?，?晗，周月明，2*，陳猷鵬，郭勁松，晏 鵬，2

（1.重慶大學(xué) 城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院，重慶 400045;2.中國科學(xué)院 重慶綠色智能技術(shù)研究院，重慶 400714)

重慶是我國柑橘主產(chǎn)區(qū)之一，2016年產(chǎn)量高達242.6萬噸[1]。柑橘除少部分用于鮮食外，多用于加工，產(chǎn)生45%～60%的柑橘皮渣[2]。柑橘皮渣富含香精油、色素、黃酮類、果膠、維生素B及維生素C等物質(zhì)[3]，提取這些物質(zhì)仍沒有解決后續(xù)廢渣的處理問題。皮渣還可以烘干作動物飼料，但能耗較高[4]，國內(nèi)應(yīng)用較少。國內(nèi)柑橘皮渣主要進行填埋處理。柑橘皮渣含水量高達80%，pH低于4，填埋后產(chǎn)生大量酸性液體，破壞土壤結(jié)構(gòu)、污染水體和空氣[5]。因此，急需開發(fā)一種經(jīng)濟環(huán)保的柑橘皮渣資源化利用方式。

柑橘皮渣富含有機質(zhì)及氮磷鉀等營養(yǎng)元素。張云茹等[6]以柑橘皮渣和稻殼等為原料進行了平菇栽培試驗，證明了柑橘皮渣制備有機肥的可行性。但柑橘皮渣含有大量果膠、纖維素及木質(zhì)素等大分子物質(zhì)，微生物降解困難[7]。趙建等[8]篩選出可在高溫條件下快速降解果膠及纖維素的地衣芽孢桿菌，堆肥溫度高達70℃。亦有研究表明，堆肥中復(fù)合微生物菌群的協(xié)同作用大大提高了堆肥效果[9]。

堆肥以微生物代謝為核心[10]，物質(zhì)的降解受碳氮比（C/N）、含水率、pH、通氣性、粒徑大小及溫度等的影響，科學(xué)地控制這些參數(shù)有利于提高堆肥效果。楊文卿等[11]利用正交試驗得到了污泥/豬糞添加聚丙烯酸鈉混合堆肥的最優(yōu)工藝參數(shù)。沈建兵等[12]通過正交試驗探討了C/N、含水率、加菌量對污泥堆肥的影響，并獲得了最優(yōu)工藝參數(shù)。但這些研究均未對優(yōu)化后的工藝參數(shù)進行驗證。

本研究進行了柑橘皮渣堆肥工藝的優(yōu)化試驗，研究影響堆肥效果的重要可調(diào)控因素[13]：原料含水率、C/N、pH、加菌量對堆肥效果的影響，以總養(yǎng)分含量為肥效評價指標(biāo)，得到柑橘皮渣堆肥的最優(yōu)工藝條件，并在最優(yōu)工藝條件的基礎(chǔ)上進行柑橘皮渣堆肥中試研究，驗證優(yōu)化效果。同時，利用高通量測序技術(shù)分析堆肥過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化，揭示堆肥過程中細(xì)菌、真菌、放線菌及優(yōu)勢菌屬的演替規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 柑橘皮渣及輔料

柑橘皮渣取自長壽園區(qū)尚疏坊果園，粉碎至20～30 mm塊狀，輔料麩皮取自當(dāng)?shù)孛娣蹚S，柑橘皮渣及麩皮的主要成分見表1。

表1 柑橘皮渣及麩皮的主要成分（%）Tab.1 The main ingredients of citrus peel and bran（%）

1.1.2 接種菌劑

接種菌劑為實驗室自主制備的菌系J，該菌系由實驗室通過高溫限制碳源篩選得到的耐高溫皮渣降解復(fù)合菌系[由芽孢桿菌（Bacillus）、青霉（Penicillium）及喜熱裂孢菌（Thermobifida）等組成]及購自北京康源綠洲有限公司的EM（Effective Microorganisms）功能菌等比例混合得到。經(jīng)預(yù)實驗證明該菌系J可快速降解果膠、纖維素并提高堆體溫度。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 基于正交設(shè)計的柑橘皮渣堆肥小試研究

根據(jù)前期預(yù)實驗、正交試驗設(shè)置原料含水率（water content，W）、C/N、石灰量（Lime quality，L）及加菌量（microorganism dosage，M）4個對堆肥效果影響顯著的因素，每個因素選取3個水平，以總養(yǎng)分含量為評價指標(biāo)，進而確定堆肥的最優(yōu)工藝參數(shù)。正交因素及水平見表2。正交試驗設(shè)置9個處理，分別記為P1～P9，原料均為40 kg，堆置于自制帶孔（Φ=1 cm）整理箱中40 d，前2周每2 d翻堆1次，2周后每5 d翻堆1次。

表2 正交試驗因素水平表Tab.2 The levels of the orthogonal factors for composting

1.2.2 柑橘皮渣堆肥中試研究

在正交試驗得到的最優(yōu)工藝基礎(chǔ)上，于重慶市誠冠有機肥有限公司進行中試研究，驗證最優(yōu)工藝堆肥效果。堆肥原料為20 t，堆成高1 m左右的堆垛，堆置40 d。堆置前2周，每1～2 d翻堆1次，2周后5～7 d翻堆1次。

1.3 測定項目與方法

堆置期間，每日測定堆肥中心及環(huán)境溫度；于0 d，5 d，10 d，17 d，27 d，40 d進行多點取樣，混合均勻后，測定其果膠[14]、纖維素[15]、含水率、pH、氮（N）、磷（P）、鉀（K）[16]及有機質(zhì)含量，并保存部分混合鮮樣于-80℃冰箱，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，采用Illumina公司的Miseq PE 250平臺進行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010、SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理試驗所得數(shù)據(jù)，采用Origin 9.1軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘皮渣堆肥小試研究

2.1.1 堆肥過程中溫度變化

溫度是堆肥中的重要控制指標(biāo)，它既表征微生物的活性也決定著微生物的活動過程[17]。由圖1可見，各處理時間的溫度變化曲線均有明顯的升溫期（0～2 d）、高溫期（2～10 d）、降溫期（10～17 d）及腐熟期（17～40 d）。堆置2 d時，溫度均超過45℃，其中處理組P6和P8升溫較快，在3 d時達到60℃，而P7升溫略慢，可能是因為初始pH及含水率均較高，影響微生物活性。堆置5 d時，各處理組的溫度均達到最高值，其中P6（69℃）＞P7（64℃）＞P8（62℃），其余均在60℃以上，并且在高溫期（＞55℃）持續(xù)時間較長的處理組有P6（9 d）、P7（5 d）、P8（7 d），達到無害化衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求[18]。高溫期后溫度逐漸下降，進入降溫腐熟期。

圖1 各處理組不同時間堆肥溫度的變化Fig.1 The temperature changes in compost of different treatment

2.1.2 堆肥過程中總養(yǎng)分含量變化

總養(yǎng)分含量（N+P2O5+K2O）為重要的肥效指標(biāo)。由圖2可見，在堆置過程中，各處理的總養(yǎng)分含量呈持續(xù)增長趨勢。堆肥前期增長較快，5 d時增長最快的處理組為P5（36%），其次為P6（32%）。進入降溫期后總養(yǎng)分含量增長減緩，最終所有處理的總養(yǎng)分含量均達到國家標(biāo)準(zhǔn)，其中最高處理組為P6（6.01%），最低為P7（5.29%）。這可能是接種功能菌系后，堆肥溫度較高，水分及有機質(zhì)快速減少，堆體質(zhì)量快速下降，總養(yǎng)分含量逐漸升高[19]。

圖2 各處理組不同時間堆肥總養(yǎng)分含量的變化Fig.2 The total nutrient content changes in compost of different treatment

2.1.3 正交試驗結(jié)果與分析

表3為不同工藝參數(shù)下有機肥的總養(yǎng)分含量。其中Ki為每個因素在第i水平下的總養(yǎng)分含量之和，總養(yǎng)分含量越大，相應(yīng)的Ki越大。R為極差，極差越大，表示該因素對總養(yǎng)分含量影響越大。結(jié)果表明各因素對總養(yǎng)分含量的影響主次順序為B＞C＞D＞A，其中B因素影響最顯著，A因素的極差最小，故以A項為誤差進行方差分析。結(jié)果見表4，其中B因素有顯著性差異，A因素、C因素與D因素?zé)o顯著性差異。通過K值大小可判斷，最優(yōu)因素組合為A1B3C2D2（W55%C/N25L10M3%)。對于B因素（C/N），微生物分解有機物較適宜的C/N為25左右[20]，C/N過高，微生物需要多次代謝才能消耗過量的碳，從而降低了降解速度[21]，原料C/N由25升至30，對應(yīng)的K值由5.92%降至5.42%，即最終總養(yǎng)分含量也降低了8.40%。所以，當(dāng)原料含水率為55%、C/N為25、石灰投加量為10 g/kg、加菌量為3%時，所得有機肥的肥效最優(yōu)。

表3 正交試驗結(jié)果Tab.3 The results of orthogonal experiments

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 The results of ANOVA

2.2 柑橘皮渣堆肥中試研究

在最優(yōu)工藝條件（W55%C/N25L10M3%）下，進行柑橘皮渣堆肥中試研究，并與小試數(shù)據(jù)對比分析，考查工藝優(yōu)化的可靠性和穩(wěn)定性。

2.2.1 堆肥中試溫度變化

考慮到中試規(guī)模較大，堆體不同層次溫度變化差異較大，故分別測定堆體表層、中心及底部溫度，并與小試研究溫度變化（去極值后平均）相比較，具體見圖3。

圖3 中試溫度的變化Fig.3 The temperature changes in pilot test

中試溫度變化趨勢與小試相似，均有升溫期、高溫期及降溫期，中試表層最高溫度可達到73℃，堆心最高溫度可達67℃，明顯高于小試溫度61℃，并可維持高溫期（堆心溫度55℃以上）25 d，堆肥化效果及無害化效果顯著高于小試研究。這可能是由于中試規(guī)模較大，有更好的保溫效果，同時工藝的優(yōu)化增強了微生物的活性[22]。不過中試溫度分布不均，前期表層溫度最高，中心次之，底部溫度最低。這是由于前期易降解有機質(zhì)被微生物快速消耗，堆體氧氣含量成為限制因素[23]，氧氣由外至內(nèi)降低，影響好氧微生物活性。21 d后，堆體中主要物質(zhì)為難降解的纖維素類物質(zhì)，微生物活動減弱，需氧量降低，且含水率降至40%以下，堆料較初期更干燥、疏松，氧氣傳遞情況改善，堆體的保溫效果成為限制因素[24]。

2.2.2 堆肥中試各理化參數(shù)變化

中試研究各理化參數(shù)的變化趨勢與小試研究相似，故在此以小試的最優(yōu)值作對照（CK）。中試各理化參數(shù)的變化見表5。

表5 中試研究各理化參數(shù)的變化Tab.5 The changes of physical and chemical parameters in pilot test

由表5可知，隨著堆置的進行，堆料含水率、果膠、纖維素及有機質(zhì)含量顯著減少，而總養(yǎng)分含量逐漸增加。由于中試溫度更高，有機質(zhì)消耗與水分散失更快，各指標(biāo)較小試均有一定提升。

果膠含量在5 d時顯著降低，降解率達到86.36%，40 d時降解率為96.75%，優(yōu)于小試結(jié)果的93.22%，說明接種的菌系可快速降解果膠。其中含水率隨時間增加呈降低趨勢，至40 d時為24.25%，優(yōu)于小試效果。由于初期有機酸的產(chǎn)生pH有所下降[25]，之后由于氨化作用及礦化作用又逐漸上升[26]，最終趨于穩(wěn)定。纖維素含量也大大降低，至40 d時，纖維素含量僅為16.34%，降解率達到54.71%，優(yōu)于小試結(jié)果的47.19%。中試有機質(zhì)的消耗始終維持較高的水平，至40 d時有機質(zhì)含量為54.32%。堆至40 d時總養(yǎng)分含量顯著提升，達到6.48%。

2.3 堆肥微生物群落結(jié)構(gòu)的演替

目前關(guān)于堆肥過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究大多限于對細(xì)菌的研究[27]，而堆肥過程中真菌、放線菌對木質(zhì)纖維素的降解起重要作用[28]，卻少見文獻報道。筆者分析了柑橘皮渣堆肥過程中細(xì)菌、真菌及放線菌的總豐度及各自優(yōu)勢種群的相對豐度變化情況。

2.3.1 細(xì)菌、真菌及放線菌豐度的變化

由圖4可知，細(xì)菌（Bacteria）與真菌（Fungi）的總體豐度較高，堆肥過程中呈小幅度波動，而放線菌（Actinomycetes）總體豐度較低，在堆肥過程中先升高后降低，說明接種的菌系組成穩(wěn)定。堆至第5 d時細(xì)菌豐度有所降低，第17 d后逐漸升高并趨于穩(wěn)定；真菌豐度在第5 d時略有升高，于第17 d時略有下降，隨后又逐漸升高并趨于穩(wěn)定；而放線菌初期豐度很低，隨著堆肥的進行豐度逐漸升高，第17 d時達到頂峰，之后放線菌豐度稍有降低并趨于穩(wěn)定。

圖4 堆肥中物種豐富度的變化Fig.4 The changes of species abundances in compost

2.3.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化

由圖5可見，堆肥初期細(xì)菌中優(yōu)勢菌屬為假黃單胞菌（Pseudoxanthomonas）、泛菌（Pantoea）及Bacillus，且進入高溫期后優(yōu)勢逐漸擴大，同時鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium）開始快速增殖。堆至第17 d進入降溫期，Pseudoxanthomonas及Pantoea豐度快速下降，此時優(yōu)勢菌屬變?yōu)锽acillus及Sphingobacterium，并隨著堆肥的進行優(yōu)勢不斷擴大，堆至第27 d時，二者相對豐度之和達到72%。堆肥末期，鞘氨醇單胞菌（Sphingobium）開始大量增殖，逐漸占據(jù)絕對優(yōu)勢地位。據(jù)報道Pseudoxanthomonas[29]，Pantoea[30]及Sphingobacterium[31]具有高溫下降解木質(zhì)纖維素的能力；Bacillus可抵抗高溫等不良環(huán)境[32]，并擁有良好的果膠及纖維素降解能力[8]；Sphingobium則有在貧營養(yǎng)環(huán)境下的良好耐受能力[33]以及在好氧條件下降解木質(zhì)素[34]的能力，與其在后期營養(yǎng)貧瘠、pH較高時占據(jù)絕對優(yōu)勢相呼應(yīng)。

圖5 堆肥中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化Fig.5 The changes of Bacteria community structure in compost

2.3.3 真菌群落結(jié)構(gòu)的變化

高溫真菌對好氧堆肥中木質(zhì)纖維素的降解有重要的作用[35]。由圖6可知，初期真菌的優(yōu)勢菌屬為Penicillium，進入高溫期后其豐度顯著降低，而嗜熱子囊菌（Thermoascus）迅速增殖，占據(jù)絕對優(yōu)勢地位，直至堆肥結(jié)束。其中，Penicillium具有很強的纖維素[36]及果膠降解能力[37]，但其本身不耐高溫[38]，而Thermoascus可在較大的溫度（30℃～80℃）及pH（2～10）范圍下高效降解半纖維素[39]，這與其在整個堆肥過程中占據(jù)優(yōu)勢地位相呼應(yīng)。

圖6 堆肥中真菌群落結(jié)構(gòu)的變化Fig.6 The changes of Fungi community structure in compost

2.3.4 放線菌群落結(jié)構(gòu)的變化

放線菌是一類在木質(zhì)纖維素降解中占據(jù)重要地位的革蘭氏陽性細(xì)菌[40]。由圖7可知，初期放線菌的優(yōu)勢菌屬為糖單胞菌（Saccharomonospora）及Thermobifida，進入高溫期后二者優(yōu)勢顯著擴大，特別是Saccharomonospora，其相對豐度達到58%；第17 d時，Saccharomonospora豐度降低，此時優(yōu)勢菌屬為Saccharomonospora、Thermobifida及纖維微菌（Cellulosimicrobium）；至堆肥后期，擬諾卡菌（Nocardiopsis）迅速增殖，與Saccharomonospora成為后期的優(yōu)勢菌屬。據(jù)報道，Saccharomonospora及Thermobifida具有良好的耐堿耐熱及降解半纖維素的能力[41]，其中Thermobifida還可降解纖維素[42]，Cellulosimicrobium則擁有降解果膠、纖維素及固氮的能力[43]，而Nocardiopsis擁有降解各種木質(zhì)纖維素的能力[44]。雖放線菌豐度比真菌和細(xì)菌豐度低，但其對高溫期及降溫期木質(zhì)纖維素的降解有重要的作用。

圖7 堆肥中放線菌群落結(jié)構(gòu)的變化Fig.7 The changes of Actinomycetes community structure in compost

2.3.5 堆肥過程中微生物主要功能分析

柑橘皮渣堆肥的技術(shù)難點是果膠和木質(zhì)纖維素的降解[45]。果膠會直接影響脫水效果及堆肥的正常進行。試驗表明，接種菌系之后，在大量Bacillus與Penicillium等的作用下，果膠迅速分解，皮渣中的結(jié)合水轉(zhuǎn)化為自由水，隨著堆體溫度的升高而散失，堆肥得以順利進行。木質(zhì)纖維素在堆肥高溫階段逐漸軟化[46-47]并在Pantoea，Thermoascus及Saccharomonospora等的作用下迅速降解，隨著堆肥進入降溫腐熟期，木質(zhì)纖維素在Sphingobium、Thermoascus及Nocardiopsis等的作用下持續(xù)分解。

3 結(jié)論

（1）小試正交試驗以總養(yǎng)分含量為評價指標(biāo)，堆肥工藝的最優(yōu)工藝參數(shù)為原料含水率55%、C/N比25、石灰投加量10 g/kg、加菌量3%。

（2）基于最優(yōu)條件的中試研究效果顯著優(yōu)于小試研究，各指標(biāo)均有一定提升，其中總養(yǎng)分含量達到6.48%，較小試研究的6.01%有顯著提升。

（3）堆肥過程中細(xì)菌、真菌、放線菌及其優(yōu)勢菌屬隨堆肥時間不斷演變，Bacillus、Penicillium及Thermobifida在堆肥前期占據(jù)優(yōu)勢，Sphingobium、Thermoascus、Nocardiopsis則在后期占優(yōu)。

（4）Bacillus及Penicillium對堆肥前期果膠的快速降解起主要作用，木質(zhì)纖維素在不同時期均存在降解，是多種優(yōu)勢菌屬協(xié)同作用的結(jié)果。