短波單胞菌（Brevundimonas sp.）A1A18對(duì)堿性土壤毒死蜱污染的修復(fù)

顧 欣，劉艷薇，王新譜，孫權(quán)，王銳，虎芳芳，陳燕，賈彥霞

寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021

毒死蜱屬于有機(jī)磷類(lèi)神經(jīng)毒劑，兼具觸殺和胃毒作用（農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，1989），以百余種作物害蟲(chóng)為靶標(biāo)，毒殺效果好（Kenaga et al.，1965），成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的殺蟲(chóng)劑之一。隨著毒死蜱用量及使用面積的增加，其生態(tài)毒性越來(lái)越受到人們關(guān)注。毒理試驗(yàn)表明，低濃度毒死蜱可影響人類(lèi)大腦的發(fā)育和功能，抑制核酸和蛋白質(zhì)合成（Slotkin，1995）。高濃度毒死蜱可導(dǎo)致人體呼吸系統(tǒng)麻痹，甚至死亡（Hancock et al.，2007；Hulse et al.，2014）。栽培過(guò)程中，毒死蜱通過(guò)撒播、淋溶等方式進(jìn)入土壤，促使該農(nóng)藥在植株體內(nèi)積累，通過(guò)生物富集作用，直接威脅人類(lèi)、其他生物的健康安全。目前，部分歐美國(guó)家已在某些領(lǐng)域全面禁用毒死蜱（Rauh et al.，2015；Centner，2018）。中國(guó)農(nóng)業(yè)部宣布于2017年1月1日起在蔬菜上禁止使用毒死蜱。然而，該農(nóng)藥仍被允許用于水稻、小麥、棉花、果樹(shù)、花生和甘蔗等作物的栽培中，加之土壤中的毒死蜱殘留在短期內(nèi)無(wú)法徹底降解，半衰期最長(zhǎng)達(dá)數(shù)百天（Chai et al.，2013），仍然有進(jìn)入食物鏈的可能性，對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)安全具有潛在威脅。

利用微生物降解農(nóng)藥殘留，是一種環(huán)保、高效、低成本的生物修復(fù)方式，被證明是從土壤環(huán)境中消除有機(jī)磷農(nóng)藥的最可行且有效的選擇。如利用黃桿菌（Flabnobacterium sp.）、節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）、糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、鞘胺醇單胞菌（Sphingomonas sp.）、克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）和蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）等細(xì)菌降解土壤、水體中的毒死蜱殘留，降解率最高接近 100%（Shamsa，2016；Khalid，2016；Feng，2017；李曉慧等，2007；段海明，2012）。筆者從寧夏土壤中分離篩選出一株毒死蜱降解菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化（東秀珠等，2002）和基因測(cè)序，將其鑒定為短波單胞菌屬（Brevundimonas sp.）A1A18，NCBI編號(hào)為MK110476。該屬細(xì)菌曾被發(fā)現(xiàn)對(duì)多種有機(jī)磷農(nóng)藥具有降解作用（Deshpande et al.，2004；Chanika et al.，2011；Li et al.，2008）。

土壤中毒死蜱的降解速率除了與農(nóng)藥初始質(zhì)量濃度有關(guān)，還與復(fù)雜的土壤性質(zhì)，如酸堿度、溫度、濕度、質(zhì)地、有機(jī)質(zhì)含量、微生物活性和數(shù)量等密切相關(guān)（Singh et al.，2003；Getzin et al.，1981；Racke et al.，1996；Das et al.，2015）。研究表明，無(wú)機(jī)肥或有機(jī)肥對(duì)土壤微生物和降解菌的活性具有顯著促進(jìn)作用，繼而促進(jìn)對(duì)目標(biāo)降解物的降解（Das et al.，2015；Zhang et al.，2012；Chen et al.，2015）。然而，二者配施對(duì)農(nóng)藥降解率及施藥后土壤微生物的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。

為此，本研究在探究毒死蜱降解菌短波單胞菌A1A18菌株對(duì)堿性砂壤中毒死蜱降解動(dòng)態(tài)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究不同肥料與降解菌配施、不同濃度降解菌劑對(duì)土壤毒死蜱殘留降解動(dòng)態(tài)的影響，以及降解菌施用對(duì)土壤微生物的影響，以期為堿性土壤毒死蜱污染的微生物修復(fù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試溫室及土壤

試驗(yàn)地點(diǎn)位于寧夏大學(xué)農(nóng)科試驗(yàn)基地。試驗(yàn)土壤來(lái)自銀川市軍馬場(chǎng)未施用過(guò)毒死蜱的農(nóng)田，取 0－20 cm的表層土，剔除其中的石塊與植株殘?bào)w，自然風(fēng)干，過(guò)2 mm篩。一部分用于毒死蜱加標(biāo)回收試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)；另一部分用于土壤基本理化性質(zhì)測(cè)定。試驗(yàn)土壤為干旱土土綱，正常干旱土亞綱，鈣積正常干旱土土類(lèi)，質(zhì)地砂壤，基本理化性質(zhì)如表1。

表1 試驗(yàn)土壤基本理化性質(zhì)Table1 Physicochemical properties of the tested soil

1.2 試驗(yàn)材料

黃瓜品種為津優(yōu)35號(hào)。40%毒死蜱乳油（永農(nóng)生物科學(xué)有限公司“巨雷”牌），原藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)為39.6%，推薦劑量為1500 mL·hm-2。毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品為色譜純。

毒死蜱降解菌為短波單胞菌A1A18，由寧夏大學(xué)農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境實(shí)驗(yàn)室從毒死蜱污染土壤中分離篩選獲得。

有機(jī)肥為羊糞基有機(jī)肥，主要原料為羊糞和秸桿，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)45.7%，全氮、全磷、全鉀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為28、11、15 g·kg-1。尿素為分析純（AR），粉狀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化與增殖

從菌種管中挑取單菌落，劃線(xiàn)接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)16－18 h。挑取活化后的菌落，接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng) 16－18 h，檢測(cè)菌液濃度后，用無(wú)菌生理鹽水稀釋?zhuān)瞥捎行Щ罹鷶?shù)為2.0×108CFU·mL-1的菌懸液，備用。

1.3.2 試驗(yàn)1

設(shè)置滅菌土（A1）、滅菌土+滅活降解菌（A2）、滅菌土+降解菌（A3）、未滅菌土（A4）、未滅菌土+滅活降解菌（A5）、未滅菌土+降解菌（A6）6個(gè)處理。取部分試驗(yàn)土壤和菌懸液，于121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min，制備成滅菌土和滅活降解菌。在滅菌土和未滅菌土中分別拌入毒死蜱 800倍稀釋液，用量為5 mL·kg-1（干土，下同），制備成污染土。將相同濃度的已滅活和未滅活的菌懸液分別與兩種污染土充分混勻，使A3、A6處理土壤中降解菌密度為4×107CFU·g-1（干土，下同）。將土壤分裝至營(yíng)養(yǎng)缽（上口直徑16 cm，底直徑11 cm，高14 cm），裝量為每缽1.0 kg，添加無(wú)菌水，使土壤含水量保持在20%。試驗(yàn)期間，根據(jù)日蒸發(fā)量補(bǔ)充無(wú)菌水。每處理設(shè)置10個(gè)重復(fù)。于施藥后第0（施藥后4 h）、1、3、5、7、14、21天分別取各處理0－10 cm深度的土壤樣品。采用多點(diǎn)混合取樣法采集土樣，每處理取混合土樣10 g，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，檢測(cè)各處理土壤樣品中的毒死蜱殘留量。

1.3.3 試驗(yàn)2

將不同肥料、降解菌與未滅菌土混合，設(shè)7個(gè)處理，分別為添加尿素（B1）、有機(jī)肥（B2）、尿素+降解菌（B3）、有機(jī)肥+降解菌（B4）、尿素+有機(jī)肥+降解菌（B5），以不施肥只加降解菌為對(duì)照（B0），以不施肥不加菌為絕對(duì)對(duì)照（CK1）。土壤中尿素和有機(jī)肥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.2%和1%。將菌懸液與土壤充分混勻，使降解菌密度為4×107CFU·g-1。將土壤分裝至營(yíng)養(yǎng)缽中（同1.3.2）。每缽移栽1株三葉一心期、健康的黃瓜苗，培養(yǎng) 3 d。待植株適應(yīng)后，選取長(zhǎng)勢(shì)均一的瓜苗，用小型噴灑器將 5 mL毒死蜱800倍稀釋液均勻噴施于缽中土壤，不沾染葉片。每處理30株。于施藥后第0（施藥后4 h）、1、3、5、7、14、21天分別取各處理0－10 cm深度的根周土壤樣品。采用多點(diǎn)混合取樣法采集土樣，每處理取混合土樣10 g，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，檢測(cè)各處理土壤樣品中的毒死蜱殘留量。

1.3.4 試驗(yàn)3

在自然土中添加 1%有機(jī)肥和不同數(shù)量的降解菌，設(shè)置6個(gè)處理，土壤中降解菌的初始密度分別為 2×107（C1）、4×107（C2=B4）、6×107（C3）、8×107CFU·g-1（C4），以不施降解菌為對(duì)照（C0=B2），不施毒死蜱不施菌為絕對(duì)對(duì)照（CK2）。土壤分裝、瓜苗移栽、毒死蜱噴施和取土樣方法同1.3.2。每處理 30株。一部分根周土壤樣品用于檢測(cè)毒死蜱殘留量；另一部分根周土壤樣品用于檢測(cè)土壤微生物數(shù)量。

表2 堿性土壤中毒死蜱的加標(biāo)回收率Table2 Recovery of standard addition of chlorpyrifos standard in alkaline soil

1.4 測(cè)定方法

菌體濃度：采用平板傾注法。取搖勻的 1 mL待測(cè)菌液，用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行適量稀釋。將1 mL稀釋菌液注入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，倒入約 50 ℃的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，與菌液混勻，靜置，冷凝后倒置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，計(jì)算菌液的活菌濃度。

土壤理化性質(zhì)：含水量檢測(cè)采用烘干法；pH值檢測(cè)采用電位法；有機(jī)質(zhì)檢測(cè)采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法（鮑士旦，2000）。

土壤中毒死蜱殘留量檢測(cè)：從土壤中提取毒死蜱（Fang et al.，2006），采用氣相色譜分析法進(jìn)行檢測(cè)。儀器條件為 Agilent 7980A-ECD；色譜柱HP-5石英毛細(xì)柱，30 m×0.32 mm×0.25 μm；進(jìn)樣口溫度220 ℃，檢測(cè)器溫度320 ℃；程序升溫測(cè)定，初始柱溫80 ℃保持1 min，以15 ℃·min-1上升至 150 ℃保持 2 min，再以 6 ℃·min-1上升至270 ℃保持 2 min；載氣為高純氮?dú)猓兌?9.999%），流速為1.0 mL·min-1。進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為 1 μL。采用外標(biāo)法計(jì)算土壤樣品中毒死蜱的殘留量。

土壤微生物數(shù)量：鮮土樣過(guò)篩（1 mm），采用土壤懸液稀釋平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)土壤中可培養(yǎng)微生物的數(shù)量。使用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基和高氏I號(hào)培養(yǎng)基分別進(jìn)行細(xì)菌、真菌和放線(xiàn)菌的選擇性培養(yǎng)（沈萍等，2007）。

1.5 毒死蜱加標(biāo)回收試驗(yàn)

取土壤樣品，添加毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品，混合均勻，制成毒死蜱質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 0.1、0.5、1.0、5.0 mg·kg-1的施藥土壤，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)，以不添加毒死蜱為空白對(duì)照。按照1.4方法步驟檢測(cè)土壤中毒死蜱殘留量，計(jì)算其加標(biāo)回收率。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用Excel 2010和Origin 9.0軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖；運(yùn)用Origin 9.0進(jìn)行農(nóng)藥降解動(dòng)力學(xué)方程擬合；運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析，在P＜0.05水平上進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性砂壤中毒死蜱加標(biāo)回收率

毒死蜱在堿性土壤樣品中的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差如表2所示?？瞻讓?duì)照中未檢測(cè)出毒死蜱殘留。毒死蜱在堿性土壤樣品中的平均加標(biāo)回收率為91.04%－100.70%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.91%－4.42%。表明該方法檢測(cè)堿性土壤中的毒死蜱，回收率高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小，符合《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》（劉光學(xué)等，2004）中農(nóng)藥殘留檢測(cè)加標(biāo)回收率70%－110%的要求。

2.2 堿性土壤中毒死蜱的降解動(dòng)態(tài)

毒死蜱的降解動(dòng)態(tài)特征如圖1所示。施藥后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤中的毒死蜱殘留量呈降低趨勢(shì)。其降解過(guò)程可分為兩個(gè)階段。初始階段，即施藥后至第5天，為快速降解期。滅菌土中添加降解菌（A3），毒死蜱殘留的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由2.505 mg·kg-1降至1.437 mg·kg-1，降解率為42.63%。未加菌的滅菌土（A1）中，毒死蜱殘留的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由 2.527 mg·kg-1降至 1.670 mg·kg-1，降解率僅為 33.91%。滅菌土加滅活菌（A2）中，毒死蜱殘留的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由 2.518 mg·kg-1降至 1.675 mg·kg-1，降解率為33.38%。未滅菌土中添加降解菌（A6），毒死蜱殘留的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由 2.439 mg·kg-1降至 0.902 mg·kg-1，降解率為 63.02%。但是，該階段未滅菌土不加菌（A4）和未滅菌土加滅活菌處理（A5），毒死蜱降解率分別僅為38.72%和39.00%。說(shuō)明土壤微生物參與下的毒死蜱生物降解速率顯著高于非生物降解速率，降解菌的施用可顯著加速毒死蜱的降解。無(wú)論是滅菌土還是未滅菌土，添加滅活菌對(duì)土壤毒死蜱降解的影響與未添加處理均無(wú)顯著差異。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，土壤毒死蜱殘留量的變化曲線(xiàn)趨于平緩，降解過(guò)程逐漸進(jìn)入慢速階段。

圖1 滅菌和未滅菌堿性土壤中添加滅活、未滅活降解菌對(duì)毒死蜱殘留量的影響Fig.1 Effects of inactivated and active degrading bacteria on chlorpyrifos residues in autoclaved and non-autoclaved alkaline soil

利用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型（孔德洋等，2014）對(duì)毒死蜱在堿性土壤中的降解過(guò)程進(jìn)行擬合：

式中，t為采樣距離施藥的時(shí)間差，d；Ct為經(jīng)t時(shí)間降解的毒死蜱殘留量，mg·kg-1；C0為施藥后毒死蜱的初始沉積量，mg·kg-1；k為降解速率常數(shù)，d。由表3可知，決定系數(shù)R2為0.9775－0.9872，均大于0.9500，試驗(yàn)濃度下的毒死蜱在堿性土壤中的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。

試驗(yàn)結(jié)果表明，毒死蜱在滅菌土壤中的降解速率明顯低于未滅菌土壤，在未添加降解菌土壤中的降解速率顯著低于添加降解菌土壤。至施藥后第21天，無(wú)菌土 A1和 A2處理的毒死蜱降解率僅為68.98%和71.09%，半衰期分別為10.74 d和10.30 d。滅菌土加降解菌（A3）的毒死蜱半衰期為7.04 d。有菌土（A4）的降解率為76.40%－88.81%，半衰期為 4.09－8.17 d。土壤中天然生存著大量土著微生物，可分解利用土壤中的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等物質(zhì)，并成為土壤自身凈化能力的主要生物因素。滅菌土壤與未滅菌土壤相比，毒死蜱殘留降解速率顯著下降，半衰期延長(zhǎng)，表明土壤中的土著微生物對(duì)毒死蜱具有一定降解能力。土壤中添加毒死蜱降解菌，顯著提高了土壤中毒死蜱的降解速率，縮短了半衰期，說(shuō)明無(wú)論是土著微生物還是施加降解菌對(duì)毒死蜱的降解均具有顯著促進(jìn)作用。其中，滅菌土添加降解菌（A3）的毒死蜱降解率比未滅菌土（A4）的稍高，但差異未達(dá)到顯著水平，說(shuō)明單獨(dú)依靠土著微生物或降解菌 A1A18，對(duì)土壤中毒死蜱的降解作用均是有限的。土壤中添加滅活菌對(duì)毒死蜱半衰期的影響與不添加處理無(wú)顯著差異。降解菌作為生物體，添加量較少，故土壤中有機(jī)物含量變化幅度較小，對(duì)土壤中毒死蜱的吸附和降解無(wú)顯著影響。

表3 堿性土壤中毒死蜱降解的動(dòng)力學(xué)方程與半衰期Table3 Dynamics equation and half-life of chlorpyrifos degradation in alkaline soil

表4 尿素、有機(jī)肥與降解菌的不同配施處理下堿性土壤中毒死蜱降解的動(dòng)力學(xué)方程與半衰期Table4 Dynamics equation and half-life of chlorpyrifos degradation in alkaline soil of different fertilization treatments of urea, organic fertilizer and degrading bacteria

2.3 不同施肥處理對(duì)堿性土壤中毒死蜱降解動(dòng)態(tài)的影響

為接近實(shí)際耕作條件，試驗(yàn)2采用噴施法施用毒死蜱。由表4可知，該噴施方法使表層0－10 cm土壤中毒死蜱的初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2.508－2.592 mg·kg-1，略高于試驗(yàn) 1土壤混勻法（2.499－2.506 mg·kg-1）。

施藥后，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，各處理的土壤毒死蜱殘留量逐漸下降，通過(guò)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型計(jì)算出的半衰期具有差異。由圖2可知，在毒死蜱快速降解期，單施 0.2%尿素（B1）、1%有機(jī)肥（B2）的毒死蜱降解率分別為41.46%和42.73%，降解速率常數(shù)為0.085和 0.090，較未施肥 CK1的農(nóng)藥降解率（38.36%）和降解速率常數(shù)（0.082）有所提高，且二者之間無(wú)顯著差異。施用降解菌各處理，無(wú)論是否與肥料配施，均對(duì)毒死蜱的降解具有顯著促進(jìn)作用。單施降解菌B0，降解菌與肥料配施的B3、B4、B5降解率分別為57.32%，69.08%、74.55%、72.89%，降解速率常數(shù)為0.148，0.221、0.252、0.257，顯著高于CK1和單一施肥處理。與單施降解菌B0比較，降解菌與不同肥料配施對(duì)毒死蜱的降解具有更強(qiáng)的促進(jìn)作用。因此，圖2中毒死蜱的降解動(dòng)態(tài)可分為3組。第1組最慢，包括未施肥CK1和單施肥的B1、B2，半衰期為7.73－8.17 d；第2組為單施菌的B0，半衰期為4.69 d，降解較快；第3組為降解菌與肥料配施的B3、B4和B5，半衰期為2.69－3.13 d，降解最快。可見(jiàn)，將尿素、有機(jī)肥與降解菌配施可顯著提高土壤中毒死蜱的降解速率。在堿性土壤中施用 0.2%尿素、1%有機(jī)肥，對(duì)土壤酸堿度調(diào)節(jié)，有機(jī)質(zhì)含量、速效養(yǎng)分提升等方面具有積極的影響，可以促進(jìn)土著微生物和降解菌的代謝，與未施肥處理相比，加速了土壤中毒死蜱的降解，對(duì)堿性土壤毒死蜱污染具有較好的消除作用。

圖2 尿素、有機(jī)肥與降解菌的不同配施處理對(duì)堿性土壤中毒死蜱殘留量的影響Fig.2 Effects of different fertilization treatments of urea, organic fertilizer and degrading bacteria on chlorpyrifos residues in alkaline soil

表5 降解菌不同施用量對(duì)堿性土壤中毒死蜱殘留量的影響Table5 Effects of different application rates of degrading bacteria on chlorpyrifos residue in alkaline soil mg·kg-1

2.4 降解菌不同施用量對(duì)堿性土壤中毒死蜱降解動(dòng)態(tài)的影響

堿性土壤中施用不同數(shù)量的降解菌 A1A18，毒死蜱殘留的降解動(dòng)態(tài)具有差異。如表 5所示，施菌各處理的毒死蜱殘留量較未加菌的CK0減少。施藥后第 1天，除最低施用量（初始菌落密度為 2×107CFU·g-1）C1的農(nóng)藥殘留量與C0無(wú)顯著差異外，其他各處理均顯著低于C0。隨著降解菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)和降解作用的發(fā)揮，施藥后第 3－21天，各處理的農(nóng)藥殘留量均顯著低于CK0。尤其在第3－14天，土壤毒死蜱殘留量與降解菌施用量呈反比。最低施用量 C1處理，毒死蜱一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程為Ct=2.573e-0.159t，半衰期為4.33 d；C2的半衰期為2.74 d。施用降解菌的初始密度分別為 6×107CFU·g-1（C3）和8×107CFU·g-1（C4）的處理毒死蜱降解速率最快，半衰期分別為1.87 d和1.70 d，至施藥后21 d，降解率分別達(dá)到90.71%和91.65%，差異不顯著。由此可知，堿性土壤中毒死蜱殘留降解的快慢與降解菌施用量在一定范圍內(nèi)具有相關(guān)性。

2.5 降解菌不同施用量對(duì)堿性土壤微生物的影響

施用農(nóng)藥后，土壤中的可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌和放線(xiàn)菌的數(shù)量受到不同的影響。施用不同濃度的降解菌，對(duì)土壤微生物也具有一定的影響，如圖3所示。

試驗(yàn)環(huán)境涉及毒死蜱和作物栽培、有機(jī)肥的施用，因此，土壤細(xì)菌數(shù)量變化是多因素綜合表現(xiàn)的結(jié)果，如圖3A所示。未施用毒死蜱的CK2，由于作物生長(zhǎng)和有機(jī)肥雙重影響，土壤細(xì)菌數(shù)量呈增加趨勢(shì)。施用毒死蜱后，C0的細(xì)菌數(shù)量顯著下降，至第5天較對(duì)照降低65.14%。隨后，細(xì)菌數(shù)量緩慢回升，至第 21天恢復(fù)至正常水平。加降解菌的各處理，土壤細(xì)菌數(shù)量在前期均表現(xiàn)為不同程度的下降。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，各處理的細(xì)菌數(shù)量趨于穩(wěn)定。添加降解菌數(shù)量越大，土壤中細(xì)菌總數(shù)越多，且都高于CK2的水平。

圖3 降解菌不同施用量對(duì)堿性土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌（A）、真菌（B）和放線(xiàn)菌（C）數(shù)量的影響Fig.3 Effects of different application rates of degrading bacteria on the number of culturable bacteria (A), fungi(B) and actinomycetes (C)in alkaline soil

施藥后1 d，土壤真菌數(shù)量較CK2顯著增加，如圖 3B 所示，增幅大小順序?yàn)椋篊0＞C1＞C2＞C3＞C4，其中單施農(nóng)藥未施降解菌的 C0增幅最高（26.05%）。隨著降解菌施用量的增加，C1至C4處理增幅逐漸減小，分別為21.01%、15.97%、13.45%和7.56%。說(shuō)明細(xì)菌型降解菌的施用，對(duì)土壤真菌數(shù)量的增加具有一定抑制作用。土壤真菌大量增加的持續(xù)時(shí)間較短，到第 3－5天各處理已基本恢復(fù)至初始水平。隨著施藥后天數(shù)的增加，真菌數(shù)量呈緩慢降低的趨勢(shì)，至21 d，各處理的土壤真菌數(shù)量與對(duì)照組無(wú)顯著差異。

如圖3C所示，施用毒死蜱后，土壤放線(xiàn)菌的數(shù)量變化可分為3個(gè)階段。第1個(gè)階段是施藥后至第1天，放線(xiàn)菌受到抑制而數(shù)量下降。第2階段，第 2－7天，在毒死蜱的刺激下，放線(xiàn)菌數(shù)量快速增長(zhǎng)至最高值。比較第7天的放線(xiàn)菌數(shù)量，未加菌C0較 CK2增加了31.51%，而加菌各處理較 CK2增加了37.68%－48.06%，即隨著降解菌施用數(shù)量的提高，放線(xiàn)菌數(shù)量有增加的趨勢(shì)。隨后進(jìn)入第3階段，放線(xiàn)菌數(shù)量緩慢下降，至21 d各處理均降至對(duì)照水平。放線(xiàn)菌數(shù)量的增加，可能是因?yàn)槠渌⑸飻?shù)量下降，為其提供了更多的生存空間；或是受堿性環(huán)境中毒死蜱及其分解產(chǎn)物的刺激，出現(xiàn)增殖現(xiàn)象，相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3 討論

試驗(yàn)用土壤樣品為堿性砂壤，有機(jī)質(zhì)含量低，組成成分較為簡(jiǎn)單，毒死蜱在其中的平均加標(biāo)回收率為91.04%－100.70%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤4.42%，表明試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度、精確度可用于檢測(cè)堿性砂壤中毒死蜱的殘留量。

毒死蜱是二烷基磷酸酯類(lèi)農(nóng)藥，其水解反應(yīng)是親核加成反應(yīng)，反應(yīng)速度隨著介質(zhì)中 OH-基團(tuán)濃度的增加而增加。因此，毒死蜱在中性和弱酸性環(huán)境中較為穩(wěn)定，而在堿性環(huán)境中易降解（方華，2007）。試驗(yàn)結(jié)果表明，毒死蜱在堿性土壤中的降解包括非生物降解過(guò)程和生物降解過(guò)程，后者主要是土壤微生物作用，與已有研究結(jié)果一致（Chishti et al.，2013）。從動(dòng)力學(xué)角度分析，在pH為8.57的強(qiáng)堿性土壤中，毒死蜱的降解過(guò)程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，由模擬方程可知毒死蜱的半衰期，非生物降解過(guò)程為10.74 d，生物降解與非生物降解綜合過(guò)程為8.17 d。Racke（1996）研究表明，不同土壤中毒死蜱的半衰期差異很大，土壤的物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)都會(huì)影響其降解速率，同樣是砂壤，堿性環(huán)境中的毒死蜱半衰期顯著低于酸性和中性環(huán)境，半衰期為17－126 d。李界秋等（2007）在pH為6.02的酸性砂壤土施用毒死蜱，其半衰期僅為9.8 d。由于試驗(yàn)土壤和試驗(yàn)條件等各方面均存在差異，如土壤機(jī)械組成、酸堿度、含水率、微生物類(lèi)群和底物初始質(zhì)量濃度、光照條件、是否種植作物等多種因素影響，本試驗(yàn)土壤中毒死蜱殘留的半衰期與他人研究結(jié)果不同，但處于較低水平，可能與毒死蜱施用環(huán)境為強(qiáng)堿性、砂壤且農(nóng)藥初始質(zhì)量濃度較低等因素有關(guān)。

從降解機(jī)制上看，土著微生物和降解菌可將毒死蜱快速降解為中間產(chǎn)物3, 5, 6-三氯-2-吡啶酚（3,5, 6-trichloro-2-pyridinol，TCP），并最終代謝成為簡(jiǎn)單的小分子化合物（?abar et al.，2016；John et al.，2015）。Dumas（1989）從缺陷短波單胞菌（B.diminuta）中提取獲得磷酸三酯酶，該酶可降解多種有機(jī)磷農(nóng)藥。Gorla et al.（2009）利用分子生物學(xué)技術(shù)，證明該菌的有機(jī)磷水解酶定位于細(xì)胞內(nèi)膜的周質(zhì)一側(cè)，通過(guò)雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)通路進(jìn)行有機(jī)磷水解，故推測(cè)本試驗(yàn)菌株——短波單胞菌 A1A18降解毒死蜱的機(jī)制可能與此有關(guān)。本試驗(yàn)中未滅菌土毒死蜱殘留的降解率較滅菌土高出7.42%；施用降解菌A1A18的毒死蜱降解速率常數(shù)為0.170，半衰期縮減至4.09 d，降解率達(dá)88.81%。由此進(jìn)一步證實(shí)微生物降解作用是土壤中毒死蜱殘留降解的重要途徑之一。

毒死蜱可以作為部分微生物的唯一碳源（Silambarasan et al.，2013；Deng et al.，2015），但是大部分微生物的降解作用屬于共代謝作用（Sethunathan et al.，1973；錢(qián)博等，2007），需要從毒死蜱外的其他物質(zhì)中獲得能量。因此，人為添加外源營(yíng)養(yǎng)物可以支持土著微生物和降解菌的增殖與活性需求。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，尿素或有機(jī)肥的添加對(duì)毒死蜱的降解具有一定促進(jìn)作用，但外源降解菌的促進(jìn)作用更強(qiáng)，使毒死蜱的降解速率常數(shù)由 0.082（對(duì)照）增至0.148（單施降解菌），說(shuō)明該毒死蜱降解菌的功能特性較強(qiáng)，具有較好的田間應(yīng)用潛力。

尿素、有機(jī)肥及二者配施可以促進(jìn)土壤微生物的增殖與活性（Tejada et al.，2014；姬興杰等，2008），其中有機(jī)質(zhì)對(duì)毒死蜱具有一定吸附作用（Singh et al.，2003）。本試驗(yàn)土為砂壤，有機(jī)質(zhì)含量低，尿素或有機(jī)肥的施用對(duì)土著微生物和降解菌的數(shù)量增加及其功能發(fā)揮都具有顯著促進(jìn)作用。綜合表現(xiàn)為，在施用降解菌 A1A18時(shí)，與有機(jī)肥配施提高了農(nóng)藥降解率，且效果優(yōu)于無(wú)機(jī)肥。但是，兩種不同肥料混合配施與有機(jī)肥配施對(duì)毒死蜱降解過(guò)程的影響差異不顯著，說(shuō)明兩種肥料對(duì)土壤毒死蜱降解的促進(jìn)作用不具有疊加效應(yīng)。另一方面，降解菌A1A18施用濃度與目標(biāo)降解物的降解速率在一定范圍內(nèi)具有相關(guān)性?？赡苁墙到饩鷿舛冗^(guò)低，對(duì)農(nóng)藥的整體降解效率也較低。反之，降解菌濃度過(guò)高，受土壤營(yíng)養(yǎng)和目標(biāo)降解物濃度的限制，農(nóng)藥的整體降解效率也受到限制。因此，對(duì)土壤中殘留毒死蜱進(jìn)行微生物修復(fù)需添加適宜濃度的降解菌。本試驗(yàn)條件下，降解菌A1A18初始密度為6×107CFU·g-1時(shí)，與1%有機(jī)肥或與0.2%尿素+1%有機(jī)肥配施，毒死蜱的降解效率達(dá)到最高。

由上可知，在堿性砂壤中施用低濃度的毒死蜱，一方面砂質(zhì)土壤結(jié)構(gòu)、強(qiáng)堿性環(huán)境和土著微生物都有利于毒死蜱的降解，另一方面，適宜濃度的降解菌在外加碳源、氮源的促進(jìn)下，較充分地發(fā)揮了毒死蜱降解作用。因此，在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中添加降解菌 A1A18并配施有機(jī)肥，對(duì)毒死蜱具有較好的降解效率。

在一般施藥水平下，隨著施藥后時(shí)間的延長(zhǎng)，受抑制的微生物數(shù)量會(huì)逐漸恢復(fù)至正常水平（Shan et al.，2006；劉新等，2004；Pozo et al.，2010）。本研究中，毒死蜱施用初期，細(xì)菌數(shù)量出現(xiàn)不同程度的下降。降解菌不是試驗(yàn)用土的土著細(xì)菌，一方面受堿性環(huán)境的影響，另一方面，施入土壤的降解菌濃度越高，細(xì)菌死亡的數(shù)量越多。至于毒死蜱對(duì)土壤細(xì)菌是否具有毒性，還有待進(jìn)一步研究。試驗(yàn)中真菌和放線(xiàn)菌數(shù)量顯著增加，其中真菌對(duì)毒死蜱的反應(yīng)較快但增幅較小，放線(xiàn)菌的反應(yīng)較慢但增幅較大，變化趨勢(shì)與已有研究結(jié)果相似（Chen et al.，2014；Dua et al.，2015）。究其原因，一方面由于真菌數(shù)量的下降，導(dǎo)致其他微生物獲得更多的生存空間；另一方面，放線(xiàn)菌和真菌的某些種類(lèi)在堿性環(huán)境中對(duì)低濃度毒死蜱具有較好的抗性，在毒死蜱刺激下出現(xiàn)增殖現(xiàn)象，相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。隨著施藥后時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤中毒死蜱殘留量逐漸減少，各類(lèi)微生物數(shù)量逐漸趨于正常水平。作物栽培和有機(jī)肥施用有利于土壤微生物多樣性，抑制土壤“真菌化”趨勢(shì)（Hartmann et al.，2015）。至施藥后第 21天，細(xì)菌和放線(xiàn)菌數(shù)量較絕對(duì)對(duì)照多，真菌數(shù)量呈降低趨勢(shì)。因此，當(dāng)降解菌與肥料配施，總體表現(xiàn)為隨著施菌濃度的增加，毒死蜱殘留降解加速，有助于快速消除環(huán)境中毒死蜱殘留對(duì)土壤微生物的影響。

4 結(jié)論

（1）堿性土壤中毒死蜱的降解過(guò)程分為生物降解過(guò)程和非生物降解過(guò)程，其降解動(dòng)態(tài)可采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型（Ct=C0·e-kt）進(jìn)行模擬研究。

（2）不同濃度的降解菌和不同肥料施用，主要改變毒死蜱的降解速率，直接導(dǎo)致不同處理?xiàng)l件下毒死蜱半衰期發(fā)生變化，最終影響毒死蜱在土壤中的累積效應(yīng)。

（3）短波單胞菌 A1A18對(duì)強(qiáng)堿性土壤中殘留毒死蜱的降解能力較好，可作為相關(guān)土壤修復(fù)劑的功能菌株。

（4）降解菌A1A18初始密度為6×107CFU·g-1時(shí)，與 1%有機(jī)肥配施或與 0.2%尿素+1%有機(jī)肥配施，可顯著促進(jìn)堿性土壤中殘留毒死蜱的降解速率，快速消除毒死蜱對(duì)土壤微生物的影響，可作為毒死蜱污染土壤的微生物修復(fù)實(shí)施方案。