太湖沉積物反硝化功能基因豐度及其與N2O通量的關(guān)系

劉德鴻 ，文帥龍，龔琬晴，鐘繼承*，鐘文輝

1. 南京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2. 湖泊與環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所，江蘇 南京 210008；3. 洛陽(yáng)市共生微生物與綠色發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023

隨著人類社會(huì)的快速發(fā)展，大量氮素進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)，打破了原有生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)的平衡，導(dǎo)致一系列環(huán)境問(wèn)題的發(fā)生。湖泊生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)作為生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其重要性不容忽視，尤其是近年來(lái)，湖泊富營(yíng)養(yǎng)化程度的加劇，已成為氧化亞氮（N2O）排放研究的新熱點(diǎn)（Yao et al.，2016）。而反硝化作用作為生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)中重要的組成部分，早在上個(gè)世紀(jì) 70年代已受到研究者的廣泛關(guān)注（Koike et al.，1978）。

反硝化過(guò)程產(chǎn)生的N2O逐年增多（Bouwman et al.，2013），加劇溫室效應(yīng)，有關(guān)反硝化的機(jī)制、影響因素以及N2O排放及機(jī)制等研究，在農(nóng)田（李飛躍等，2012）、森林（Groffman et al.，1989）、海洋（Singh et al.，2010）、濕地（Burgin et al.，2015）、湖泊（Myrstener et al.，2016）等生態(tài)系統(tǒng)中被廣泛開(kāi)展。反硝化作用主要由反硝化微生物驅(qū)動(dòng)完成，依次經(jīng)過(guò)硝酸還原酶、亞硝酸還原酶，一氧化氮還原酶以及氧化亞氮還原酶催化，最終被還原為N2，對(duì)應(yīng)基因編碼分別為：narG或napA，nirS或nirK，norB及nosZ。反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)及功能與外界環(huán)境因子密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，氮素含量和pH對(duì)反硝化細(xì)菌豐度有顯著影響（鮑林林等，2016），沉積物有機(jī)質(zhì)與nirS豐度呈正相關(guān)（Hou et al.，2013），反硝化細(xì)菌豐度存在明顯的季節(jié)變化（Lisa et al.，2014），添加生物炭的土壤N2O排放與nosZ關(guān)系密切（Cayuela et al.，2013），N2O排放量隨施用硝態(tài)氮量增加而顯著增加，但與反硝化基因豐度之間并沒(méi)有顯著相關(guān)性（鄭燕等，2012）。因此，反硝化功能微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度及其對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)與N2O排放的關(guān)系，由于生態(tài)環(huán)境的不同而存在較大差異。為此，本研究選取太湖不同生態(tài)類型湖區(qū)沉積物為研究對(duì)象，分析了不同季節(jié)沉積物化學(xué)性質(zhì)、N2O通量以及反硝化功能基因豐度，并探討了它們之間的關(guān)系，旨在探明太湖沉積物反硝化功能基因豐度的季節(jié)變化，及其與環(huán)境因子的關(guān)系，初步揭示影響太湖沉積物N2O排放的微生物學(xué)機(jī)理，為進(jìn)一步深入研究太湖沉積物N2O排放機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持和理論基礎(chǔ)。

圖1 太湖采樣點(diǎn)位分布圖Fig.1 Distribution of sampling sites in Taihu Lake

1 材料方法

1.1 采樣區(qū)域概況

太湖是中國(guó)第三大淡水湖，地處亞熱帶，氣候溫和濕潤(rùn)，屬季風(fēng)氣候，湖水面積2338 km2，平均水深 1.9 m，是典型的大型淺水型湖泊，其位于經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的長(zhǎng)三角地區(qū)，水體具有供水、漁業(yè)、航運(yùn)、旅游等重要功能，對(duì)該區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要作用，受人為活動(dòng)影響很大，過(guò)量氮磷的輸入導(dǎo)致水體持續(xù)富營(yíng)養(yǎng)化（Xu et al.，2016）。太湖有著復(fù)雜的生態(tài)類型，具有草型、藻型及敞水區(qū)。采樣點(diǎn)S1位于梅梁彎為典型的藻型湖區(qū)，一年中多數(shù)月份藍(lán)藻占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，平均水深約3 m，無(wú)沉水植物，底部沉積有較多的淤泥，是太湖富營(yíng)養(yǎng)化最嚴(yán)重的湖區(qū)；S2位于中部較開(kāi)闊區(qū)域，無(wú)大型水生植物，仍以藻類居多，底部是有機(jī)質(zhì)含量較少的沙質(zhì)沉積物；S3和S4位于太湖東部區(qū)域，以大型水生植物為主，水環(huán)境質(zhì)量較好（劉新等，2017），其中S3以挺水植物居多，S4以沉水植物為主，沉積物為含較多有機(jī)碎屑的軟泥。具體點(diǎn)位見(jiàn)圖 1，沉積物理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 沉積物理化參數(shù)（以干質(zhì)量計(jì)）Table1 Physicochemicalproperties of sediment (dry mass)

1.2 沉積物樣品采集

使用GPS定位，于2014年8月（夏）、2014年11月（秋）、2015年2月（冬）以及2015年5月（春）分別在點(diǎn)位S1、S2、S3和S4用重力采樣器采集沉積物柱樣3根，然后取表層2 cm沉積物放入自封袋，排出空氣以保持厭氧環(huán)境，樣品盡快帶回實(shí)驗(yàn)室，分析沉積物基礎(chǔ)化學(xué)指標(biāo)，此外從各樣品袋中取出部分沉積物樣品供DNA提取之用。采樣在每個(gè)月中旬，盡量在天氣晴好、風(fēng)浪較小的情況下進(jìn)行，采樣的同時(shí)使用多參數(shù)水質(zhì)儀（YSI，USA）現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定水溫等參數(shù)。

1.3 沉積物理化性質(zhì)及N2O通量測(cè)定

沉積物經(jīng)冷凍干燥后過(guò)0.15 mm篩，采用堿性過(guò)硫酸鉀消解-紫外分光光度法測(cè)定總氮（TN），采用鉬酸鹽分光光度法測(cè)定總磷（TP）（魏復(fù)盛，2002），氨氮（）采用KCl浸提-蒸餾法測(cè)定，硝氮（）采用酚二磺酸光度法測(cè)定，亞硝氮（）采用鹽酸萘乙二胺分光光度法測(cè)定，有機(jī)碳（Org-C）采用重鉻酸鉀氧化法測(cè)定，磷酸根（）采用NaHCO3浸提-鉬酸鹽分光光度法測(cè)定（鮑士旦，2002）。沉積物N2O通量的測(cè)定可參照文獻(xiàn)（鐘繼承等，2009）。具體操作如下：稱取3 g左右的沉積物樣品于50 mL血清瓶中，加入10 mL事先用高純N2曝氣過(guò)的原位湖水，然后再用高純N2吹掃10 s，立即蓋上橡膠塞以維持厭氧環(huán)境。每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)處理，第一組處理為對(duì)照，用來(lái)采集0時(shí)刻氣體樣品，第二組處理振蕩（70 r·min-1）避光培養(yǎng)4 h，用來(lái)測(cè)定沉積物N2O的通量，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。采集氣體樣品前，劇烈搖晃血清瓶，以使頂空氣體達(dá)到平衡，然后注射18 mL 3 mol·L-1NaCl溶液于血清瓶中，同時(shí)用另一支注射器收集置換出的氣體，然后注入事先抽真空的氣體樣品瓶中。N2O采用帶電子捕獲器的氣相色譜儀（Agilent 7890B）測(cè)定。沉積物N2O通量以單位時(shí)間內(nèi)干質(zhì)量沉積物的N2O生成量計(jì)。

1.4 沉積物DNA提取

沉積物DNA采用FastDNA SPIN Kit for Soil（MP，Biomedicals，USA）試劑盒提取，參照試劑盒內(nèi)存放的DNA提取操作步驟，進(jìn)行DNA提取和操作。用 SmartSpecTMPlus Spectrophotometer（BIO-RAD，USA）測(cè)定DNA的純度及濃度，將提取好的DNA稀釋10倍后保存于-20 ℃冰箱，原樣保存于超低溫冰箱備用。

表2 qPCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)Table2 Amplification primer and reaction programs of qPCR

1.5 反硝化功能基因測(cè)定

反硝化功能基因nirK、nirS、norB、nosZ的豐度采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（qPCR）測(cè)定，采用SYBR green染料法，在CFX96 Real-Time System（BIO-RAD，USA）儀器上運(yùn)行檢測(cè)。選取環(huán)境樣品中得到的nirK、nirS、norB、nosZ的重組質(zhì)粒，根據(jù)已知質(zhì)粒濃度和阿伏伽德羅常數(shù)（6.02×1023），配置標(biāo)準(zhǔn)曲線模板，最終得到的擴(kuò)增效率分別為115.2%（R2=99.5%）、86.8%（R2=99.1%）、100.6%（R2=99.5%）、101.7%（R2=99.4%），符合實(shí)驗(yàn)要求。qPCR反應(yīng)采用20 μL體系，包括10 μL 2×SYBR premix Ex TaqTM（TaKaRa Shuzo，Shiga，Japan），20 μmol·L-1上下游引物、2 μL 模板 DNA（6－10 ng）以及7.6 μL滅菌超純水。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)和1個(gè)陰性對(duì)照(以滅菌超純水代替DNA作為反應(yīng)模板)，其qPCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)程序見(jiàn)表2。

1.6 數(shù)據(jù)分析與處理

qPCR數(shù)據(jù)采用 CFX ManagerTM軟件進(jìn)行分析，沉積物理化性質(zhì)、沉積物N2O通量與反硝化功能基因豐度的 Pearson相關(guān)性分析采用 SPSS 19.0處理，Origin 8.5制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 沉積物氮磷及有機(jī)碳

各樣點(diǎn)沉積物基礎(chǔ)理化指標(biāo)如表1所示。沉積物TN和TP全年變幅較小，其中位于梅梁彎的S1點(diǎn)位是典型的藻型湖區(qū)，富營(yíng)化程度最高，TN明顯高于其他點(diǎn)位，其次是位于草型湖區(qū)的S3和S4；TP是S1點(diǎn)位最高，其次是位于敞水區(qū)的S2，草型湖區(qū)的S3和S4最低。沉積物無(wú)機(jī)氮僅占TN含量的0.8%－4.42%。秋季沉積物氨氮含量最高，均值為(42.63±15.46) mg·kg-1，這是由于秋季水生植物和藻類逐漸死亡沉積于沉積物表層，分解礦化釋放出氨，加之利用率低，進(jìn)而導(dǎo)致氨氮升高（朱夢(mèng)圓等，2011）。硝態(tài)氮是本研究湖區(qū)無(wú)機(jī)氮的主要形態(tài)，其 夏 季 均 值 為 (20.32±1.98) mg·kg-1， 與 秋 季[(19.67±1.31) mg·kg-1]無(wú)明顯差異。冬季硝態(tài)氮含量最高[(24.31±4.29) mg·kg-1]，春季最低[(14.22±2.66)mg·kg-1]。亞硝態(tài)氮在沉積物中無(wú)積累，均值為(0.21±0.06) mg·kg-1。PO43-含 量 較 低 ， 均 值 為(0.41±0.19) mg·kg-1。沉積物有機(jī)碳存在明顯的季節(jié)變化規(guī)律，整體表現(xiàn)為夏秋季節(jié)低、冬春季節(jié)高的趨勢(shì)。大型水生植物與藻類相比有更高的生物量，更有利于所在區(qū)域有機(jī)碳的積累，故S3和S4有機(jī)碳含量明顯高于S1和S2。

2.2 沉積物N2O通量

沉積物N2O通量季節(jié)變化如圖2所示。各樣點(diǎn)沉積物N2O通量季節(jié)變化規(guī)律基本一致，夏秋沉積物 N2O整體表現(xiàn)為負(fù)排放，其通量為-0.12－0.04 nmol·g-1·h-1，均值為-0.05 nmol·g-1·h-1。夏秋季沉積物的厭氧環(huán)境使對(duì)厭氧高敏感的Nos基因合成酶的活性顯著增強(qiáng)并超過(guò)其他3種，有利于反硝化的徹底進(jìn)行并最終生成N2（Souza et al.，2017），反硝化消耗N2O而導(dǎo)致N2O產(chǎn)生負(fù)排放。冬春季整體表現(xiàn)為排放，通量為-0.05－0.48 nmol·g-1·h-1，均值為 0.27 nmol·g-1·h-1。各樣點(diǎn)沉積物 N2O 通量均在冬季達(dá)到全年最高，冬季沉積物氨氧化細(xì)菌（AOB）豐度高于夏秋季（程建華等，2016），冬季較高的有機(jī)碳含量有利于異養(yǎng)硝化細(xì)菌進(jìn)行異氧硝化而生成N2O，而且AOB的反硝化也能產(chǎn)生N2O（Peng et al.，2015），這都可導(dǎo)致冬季沉積物產(chǎn)生較高的N2O通量。

圖2 沉積物N2O通量季節(jié)變化Fig.2 Seasonal variation of sediment N2O flux

圖3 沉積物反硝化功能基因豐度Fig.3 Denitrification function gene abundance in sediment

2.3 沉積物反硝化功能基因豐度

沉積物反硝化功能基因豐度季節(jié)變化如圖3所示，各功能基因均大致表現(xiàn)為夏秋季節(jié)高、冬春季節(jié)低的特點(diǎn)，各樣點(diǎn)夏秋季節(jié)差異較大，而冬春季節(jié)差異較小，與太湖西部區(qū)域沉積物nirS基因豐度季節(jié)變化（羅躍輝等，2017）規(guī)律相同。從年均值來(lái)看，各樣點(diǎn)沉積物中 norB基因豐度最高，為9.03×109copies·g-1，其次為 nirS 基因（1.14×109copies·g-1），nirK 和 nosZ基因豐度均值分別為3.04×108copies·g-1和 1.09×108copies·g-1，S1 和 S2反硝化功能基因豐度整體大于S3和S4。

表3 反硝化功能基因豐度與沉積物化學(xué)性質(zhì)Pearson相關(guān)性Table3 Pearson correlation analysis between denitrification function gene abundance and chemical properties of sediment

3 討論

3.1 沉積物中反硝化功能基因豐度變化及其對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)

環(huán)境因子的變化可影響微生物的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)（Bostr et al.，1989）。沉積物理化性質(zhì)與反硝化功能基因相關(guān)性分析結(jié)果如表 3所示，除 nosZ外，其余各反硝化功能基因均與沉積物含量呈極顯著正相關(guān)，沉積物 TN與 nosZ呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與 norB 呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），表明這兩種沉積物環(huán)境因子可以用來(lái)作為影響部分反硝化功能基因豐度的指示因子，這與孫許超等（2018）的部分研究結(jié)果一致。與奉化江底泥（顧卿等，2016）和蔬菜地（王軍等，2016）反硝化功能基因豐度相比，本研究太湖沉積物中，nosZ基因豐度較低，原因可能在于總氮水平較低，但也有研究發(fā)現(xiàn)，反硝化功能基因豐度與總氮呈負(fù)相關(guān)（高嵩涓等，2017）。在本研究中，盡管反硝化功能基因豐度與亞硝態(tài)氮關(guān)系密切，但太湖沉積物中亞硝態(tài)氮幾乎無(wú)積累，且無(wú)明顯四季波動(dòng)（表1），故其對(duì)nirS和nirK基因豐度影響有限；與銅陵市河流沉積物中 nirS和 nirK基因豐度相當(dāng)，季節(jié)變化部分一致（程建華等，2016），但與長(zhǎng)江濕地（Hou et al.，2014）和美國(guó)河口（Lisa et al.，2014）沉積物反硝化細(xì)菌豐度的季節(jié)變化不一致，由于沉積物及土壤中的反硝化種群具有很高的多樣性，且組成差異很大（Grntzig et al.，2001；Henry et al.，2004），同時(shí)受 pH（Cavigelli et al.，2000）、季節(jié)變化（Mishra et al.，2012）、土地利用方式（Rich et al.，2003）等因素影響，因而導(dǎo)致不同環(huán)境條件下反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)及豐度差異很大。此外，本研究中各反硝化功能基因豐度間均呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），表明它們對(duì)外界環(huán)境因子的變化有基本一致的響應(yīng)。

3.2 沉積物N2O通量與反硝化功能基因豐度的關(guān)系

反硝化過(guò)程可以是生成N2O的源，同時(shí)也可能是消耗N2O的匯，是這兩個(gè)過(guò)程平衡的結(jié)果（Bange et al.，1996）。亞硝酸鹽還原酶（nirK和 nirS）是反硝化過(guò)程中的關(guān)鍵酶，主導(dǎo)亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為氧化氮這一步反應(yīng)，也是反硝化脫氮過(guò)程的限速步驟。研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽的積累可直接導(dǎo)致 N2O的排放，N2O排放量隨亞硝酸鹽氮的增加而增大（張靜蓉等，2010），其原因在于高濃度的亞硝酸鹽抑制了N2O還原酶的活性導(dǎo)致N2O的釋放（Itokawa et al.，2001；Alinsafi et al.，2008）。本研究中夏秋季節(jié)nirK和nirS基因豐度高于冬春季，故夏秋季亞硝酸鹽的消耗量大于秋冬季，從而降低了N2O的生成量，這可能是太湖沉積物N2O釋放表現(xiàn)為夏秋季較低、冬春季較高的主要原因。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)（表4），夏秋季沉積物nirS和nirK基因豐度與N2O通量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），也符合上述推斷。夏秋季沉積物反硝化功能基因豐度高且與 N2O通量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），這在一定程度也表明反硝化過(guò)程進(jìn)行徹底，整體表現(xiàn)為對(duì)N2O的消耗而產(chǎn)生負(fù)排放，而且N2O被同化還原為NH4+也會(huì)被消耗，導(dǎo)致N2O的負(fù)排放（Vieten et al.，2008）。此外，當(dāng)土壤或沉積物的pH值在6－8，nosZ基因表達(dá)的酶活性不受抑制，產(chǎn)物主要是 N2（馮潔等，2014），太湖夏秋季沉積物間隙水pH值范圍在6.7－7.2（王福芳等，2012），有利于反硝化徹底進(jìn)行，這也是太湖沉積物 N2O在夏秋季表現(xiàn)為負(fù)排放的原因。冬春季沉積物N2O整體表現(xiàn)為排放（圖2），而反硝化功能基因豐度明顯低于夏秋季（圖3），且N2O通量與各反硝化功能基因均不具顯著相關(guān)性（表4），這表明反硝化并不是沉積物N2O產(chǎn)生的主要過(guò)程（Liu et al.，2013），這也與 Liu et al.（2018）研究結(jié)果一致。N2O可產(chǎn)生于硝化、反硝化、氨化以及一些化學(xué)過(guò)程，同時(shí)也會(huì)被反硝化等過(guò)程消耗，N2O通量則取決于這些過(guò)程中N2O的生成量和消耗量的差減。盡管N2O的生成與反硝化功能微生物關(guān)系密切，但僅從此方面去解釋其與N2O的通量的關(guān)系，以及對(duì)反硝化過(guò)程影響的機(jī)制仍存在局限性（鄭燕等，2012）。微生物DNA中反硝化功能基因的存在可指示該類微生物的反硝化能力，但并不能認(rèn)為該微生物都能進(jìn)行反硝化基因的表達(dá)（Nogales et al.，2002），因此，盡管大量微生物具有反硝化功能基因，但是否表達(dá)，什么特定條件下能表達(dá)，仍有待進(jìn)一步研究。然而，由于樣品中RNA提取和保存相對(duì)困難，相關(guān)研究仍鮮見(jiàn)報(bào)道。

表4 沉積物N2O通量與反硝化功能基因Pearson相關(guān)性Table4 Pearson correlation analysis betweenN2O flux and denitrificationfunction gene abundance

4 結(jié)論

太湖沉積物反硝化功能基因豐度呈現(xiàn)夏秋季高冬春季低，具有明顯的季節(jié)變化特征。各反硝化功能基因季節(jié)變化規(guī)律一致，表明它們對(duì)外界環(huán)境因子的變化有基本一致的響應(yīng)。沉積物TN和NO2-是影響反硝化功能基因豐度的重要環(huán)境因子。反硝化作用并不是沉積物N2O產(chǎn)生的主要過(guò)程。