海南東寨港海水和沉積物中抗生素抗性基因污染特征研究

姜春霞 ，黎 平 ，李森楠 ，刁曉平, *，黃 煒 ，王道儒，葉翠杏

1. 海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南 ?？?570228；2. 海南大學(xué)南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 570228；3. 熱帶島嶼生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571158；4. 海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，海南 ?？?570125

抗生素作為養(yǎng)殖業(yè)防治細(xì)菌性疾病和刺激生長(zhǎng)的重要助力，常作為防病藥物及飼料添加劑而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。有研究報(bào)道，抗生素被攝入動(dòng)物體內(nèi)后，有近85%以上的原藥會(huì)隨著動(dòng)物糞便或尿液排除體外，進(jìn)入自然環(huán)境（Hartmann et al.，1998）。殘留在環(huán)境中的抗生素會(huì)對(duì)環(huán)境中微生物產(chǎn)生選擇壓力，從而誘導(dǎo)抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes，ARGs）產(chǎn)生。ARGs可以通過(guò)轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等可移動(dòng)遺傳元件（Mobile Genetic Elements，MGEs）在不同菌株之間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移（Gogarten et al.，2005；Schlüter et al.，2007），從而使得更多微生物獲得抗生素抗性。相關(guān)研究表明，在使用過(guò)抗生素的養(yǎng)殖環(huán)境中，攜帶ARGs的耐藥性菌株的種類(lèi)和數(shù)量日益增加，ARGs將通過(guò)食物鏈最終進(jìn)入人體，這將給人類(lèi)健康帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)隱患。Pruden et al.（2006）認(rèn)為ARGs是一種新型污染物，世界衛(wèi)生組織（WHO）也已將 ARGs列為21世紀(jì)威脅人類(lèi)健康的最重大挑戰(zhàn)之一（王麗梅等，2010)，其污染問(wèn)題也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

針對(duì)磺胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、氯霉素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)抗生素的耐藥菌通常攜帶有一種或多種耐藥機(jī)制的ARGs。包括介導(dǎo)藥物靶位點(diǎn)改變機(jī)制的基因 sul1、sul1、dfrA1，介導(dǎo)抗生素外排機(jī)制基因cmle1、cmle3、tetA、tetC、tetG，介導(dǎo)藥物靶位點(diǎn)保護(hù)機(jī)制基因tetM、qnrS，介導(dǎo)藥物活性位點(diǎn)失活的耐藥基因cata1、cata2。這些基因在人體、畜禽及多重環(huán)境介質(zhì)分離菌中均被定性檢出（李壹等，2016）。研究表明，水產(chǎn)養(yǎng)殖是ARGs的重要來(lái)源，許多ARGs在中國(guó)乃至世界各地的水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境或飼養(yǎng)對(duì)象中都有檢出（Muziasari et al.，2016；Stalin et al.，2016）。然而，目前的研究大多針對(duì)畜禽及淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素及ARGs的檢測(cè)（Wang et al.，2016；Qian et al.，2017；Czekalski et al.，2014；Harnisz et al.，2015；Marti et al.，2018），而對(duì)海水水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境關(guān)注較少。

海南省抗生素排放在中國(guó)處于中等偏高水平（Zhang et al.，2015），抗生素的高水平排放將會(huì)給當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境帶來(lái)挑戰(zhàn)。東寨港位于海南省東北部，是國(guó)家級(jí)紅樹(shù)林濕地自然保護(hù)區(qū)，已列入世界重要濕地保護(hù)名錄，具有重要的生態(tài)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。同時(shí)，東寨港海水養(yǎng)殖區(qū)是海南重要的灘涂養(yǎng)殖基地，其周邊陸地區(qū)域也存在大量的養(yǎng)殖塘，該區(qū)域抗生素及其引起的ARGs污染不容小覷。在以往的研究中，有關(guān)該區(qū)域抗生素及ARGs的研究未見(jiàn)報(bào)道。基于此，本研究將對(duì)該區(qū)域抗生素及ARGs進(jìn)行調(diào)查，具體內(nèi)容包括：（1）分析沉積物和海水中12種 ARGs的豐度、分布特征及；（2）16種抗生素的殘留狀況；（3）比較東寨港海水和沉積物中ARGs的分布差異；（4）初步分析ARGs豐度與抗生素殘留的關(guān)系。本研究旨在為規(guī)范當(dāng)?shù)厮a(chǎn)養(yǎng)殖管理和評(píng)估生態(tài)環(huán)境現(xiàn)狀提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

圖1 采樣點(diǎn)分布圖Fig.1 Location of sampling sites

1 材料與方法

1.1 樣品采集

東寨港形似漏斗，屬溺谷型港灣，海岸線總長(zhǎng)84 km，灘涂水域面積5400 hm2（李仕平等，2017）。本研究于2016年6月進(jìn)行樣品采集，采樣點(diǎn)如圖1所示，共設(shè)置 10個(gè)采樣點(diǎn)（S1－S10），采集海水和沉積物樣品。其中，S1靠近內(nèi)陸；S2－S5淺海區(qū)域均有灘涂養(yǎng)殖區(qū)，且周?chē)０毒嬖陴B(yǎng)殖塘；S6、S7靠近養(yǎng)殖塘；S8、S9靠近鋪前碼頭；S10靠近外海，是鋪前出海要塞。采樣區(qū)域由內(nèi)港向入?？诜较蜓由欤赏暾尸F(xiàn)該區(qū)域內(nèi)港至外港抗生素及ARGs的污染趨勢(shì)及水平。使用采水器采集表層0－0.5 m海水并裝入滅菌采樣瓶中；用采泥器采集表層沉積物并裝入鋁盒（121 ℃濕熱滅菌）中；所采集樣品用于ARGs及抗生素檢測(cè)。樣品采集完畢后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，水樣于4 ℃冷藏，沉積物于-20 ℃保存，盡快進(jìn)行樣品處理。

1.2 抗生素的檢測(cè)

本研究對(duì)東寨港沉積物及海水中4類(lèi)15種抗生素（磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺吡啶、磺胺異惡唑、四環(huán)素、金霉素、土霉素、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星）進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法及分析條件如下：

1.2.1 沉積物抗生素檢測(cè)

將沉積物樣品冷凍干燥48 h，過(guò)0.30 mm孔徑篩，準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g沉積物至錐形瓶中，向錐形瓶中加入 V(甲醇)：V(EDTA-Mcllvaine緩沖液)=1∶1 混合液（10 mL），振蕩30 min，超聲提取10min，靜置，收集提取液。殘?jiān)蒙鲜龇椒ǚ磸?fù)提取兩次，合并提取液。將提取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（水浴40 ℃）、濃縮至約10 mL。將LC-SAX（500 mg/3 mL）與LC-18（500 mg/3 mL）進(jìn)行串聯(lián)，固定在萃取儀上，萃取富集。用3 mL甲醇（色譜純）洗脫LC-18小柱，收集洗脫液。氮吹濃縮洗脫液至近干。用流動(dòng)相95%A[0.1%甲酸(1∶1，V/V)-1 g·L-1甲酸銨水溶液]和5%B[甲醇-乙腈(1∶1，V/V)]定容至 1 mL，過(guò) 0.22 μm尼龍濾膜，待測(cè)。

1.2.2 海水抗生素檢測(cè)

取1 L已過(guò)濾水樣，用鹽酸-水溶液（1∶1，V/V）調(diào)節(jié)pH至2.5。依次用20 mL甲醇、6 mL超純水、6 mL鹽酸對(duì)SPE柱進(jìn)行活化。用已活化的SPE柱對(duì)水樣進(jìn)行富集，流速控制在 10 mL·min-1左右。富集完成后用氮?dú)廨p柔吹干富集小柱，將氮吹干燥后的小柱與填有無(wú)水硫酸鈉的小柱串聯(lián)，用 6 mL甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。洗脫液氮吹（水浴40 ℃）濃縮至近干。用流動(dòng)相95%A和5%B定容至1 mL，過(guò)0.22 μm尼龍濾膜，待測(cè)。

1.2.3 抗生素分析條件

色譜柱為：ACQUITY UPLC? BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm，美國(guó)waters公司）；進(jìn)樣量：10 mL；柱溫：40 ℃；流速為0.30 mL·min-1。流動(dòng)相A為含0.2%甲酸銨的超純水；流動(dòng)相B為含有甲醇和乙腈的混合物（1∶1，V/V）。梯度洗脫程序?yàn)椋浩鹗?% B 3 min，然后在18 min內(nèi)從5% B線性變化至88% B。質(zhì)譜離子源為：ESI+/ESI-切換，MRM數(shù)據(jù)采集模式。

本研究采用外標(biāo)法對(duì)抗生素進(jìn)行定量，用流動(dòng)相配制一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線以抗生素濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線判定系數(shù)均在0.998之上。水樣中抗生素的回收率為71.6%－112%，檢出限范圍為0.10－4.20 ng·L-1。沉積物中抗生素的回收率為 62.1%－95%，檢出限范圍為0.12－6.3 ng·g-1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用序列及PCR反應(yīng)條件Table1 Sequence of primer and condition of PCR reaction in this study

1.3 樣品總DNA的提取

1.3.1 沉積物

每個(gè)樣點(diǎn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)稱(chēng)取0.25－0.35 g新鮮樣品，采用 PowerSoilTMDNA Isolation Kit試劑盒（MoBio，美國(guó)）進(jìn)行沉積物總DNA提取，所得DNA用NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）測(cè)其含量及純度。DNA樣品于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 海水

于24 h內(nèi)將獲得的水樣依次過(guò)8 μm、5 μm無(wú)菌濾膜以除去雜質(zhì)，之后用0.22 μm濾膜過(guò)濾并收集濾膜，用無(wú)菌鋁箔包裹，-20 ℃下保存。用液氮將濾膜研磨成粉末狀，用PowerSoilTMDNA Isolation Kit試劑盒（MoBio，美國(guó)）提取總DNA，并使用NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）測(cè)定DNA含量及純度。DNA樣品于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 質(zhì)粒制備

選取 ARGs（sul1、sul2、dfrA1、tetA、tetC、tetG、tetM、cata1、cata2、cmle1、cmle3、qnrS）和16s rRNA作為目的基因，引物設(shè)計(jì)詳見(jiàn)表1。對(duì)樣品中12種ARGs目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)。擴(kuò)增體系為：14.5 μL Green Master Mix，上下游引物各1.5 μL，2 μL DNA模板（質(zhì)量濃度范圍：10－50 mg·L-1），5.5 μL 無(wú)酶水。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，退火溫度（見(jiàn)表1）30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（生工，上海）對(duì)正確的片段進(jìn)行膠回收。將目的基因連接到PGEM-Teasy載體后導(dǎo)入商品化感受態(tài)Trans5α（全氏金，北京）進(jìn)行克隆。每個(gè)平板挑選 40個(gè)克隆子進(jìn)行培養(yǎng)。裂解細(xì)菌，使用SanPrep柱式質(zhì)粒提取試劑盒（生工，上海）進(jìn)行質(zhì)粒抽提。抽提得到的質(zhì)粒使用微量分光光度計(jì)測(cè)其濃度，保存于-80 ℃下備用。

1.5 RT-PCR

利用一系列稀釋后的質(zhì)粒作為 RT-PCR模板DNA測(cè)定其每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Cycle threshold，tC），以拷貝數(shù)對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，tC值作為縱坐標(biāo)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。RT-PCR 反應(yīng)體系為：5 μL SYBR Green Master Mix，上下游引物（表1）各0.5 μL，2 μL DNA模板（質(zhì)量濃度范圍：10－50 mg·L-1），2 μL 無(wú)酶水。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)孵育10 min，95 ℃變性30 s，退火溫度（表1）30 s，共45個(gè)循環(huán)。溶解條件為：95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s?？截悢?shù)計(jì)算公式如下：

式中，C0為質(zhì)粒初始濃度；C為質(zhì)粒拷貝數(shù)（copies·g-1或 copies·μL-1）；3015 為 PGEM-Teasy載體長(zhǎng)度；L代表目的基因長(zhǎng)度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示判定系數(shù)R2均大于0.99，線性關(guān)系良好，可用于各 ARGs拷貝數(shù)計(jì)算。使用RT-PCR對(duì)樣品中12種抗性基因和16S rRNA進(jìn)行絕對(duì)定量。將樣品得到的tC值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終計(jì)算出基因絕對(duì)豐度。

基因豐度表達(dá)有兩種表達(dá)方式：絕對(duì)豐度、相對(duì)豐度。絕對(duì)豐度表示目的基因在某一環(huán)境介質(zhì)中的含量；而相對(duì)豐度表示目的基因的絕對(duì)豐度相對(duì)于內(nèi)參基因16S rRNA的變化，可定量表示抗生素對(duì)ARGs的誘導(dǎo)率（冀秀玲等，2011），同時(shí)ARGs的相對(duì)豐度更能反映ARGs在樣本中的分布狀況。相對(duì)豐度計(jì)算如下：

式中，Ar為抗性基因相對(duì)豐度；Aa為抗性基因絕對(duì)豐度；Aa-16SrRNA為16S rRNA基因絕對(duì)豐度。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)及One-way ANOVA進(jìn)行差異顯著性分析，采用Pearson相關(guān)性分析法分析ARGs間或ARGs與抗生素間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 抗生素殘留情況

2.1.1 海水中抗生素的殘留及分布

本研究 10個(gè)采樣點(diǎn)總抗生素質(zhì)量濃度范圍為0.168－12.963 ng·L-1。不同點(diǎn)位抗生素質(zhì)量濃度高低順序?yàn)椋篠4 (12.963 ng·L-1)＞S5 (7.545 ng·L-1)＞S3(6.619 ng·L-1)＞S2 (6.274 ng·L-1)＞S7 (5.368 ng·L-1)＞S9 (5.300 ng·L-1)＞S1 (4.910 ng·L-1)＞S6 (4.460 ng·L-1)＞ S8 (3.828 ng·L-1)＞S10 (0.168 ng·L-1)。15 種抗生素中有 5種抗生素（諾氟沙星、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺吡啶、磺胺異惡唑）被檢出，檢出率分別為 70%、80%、100%、60%、20%。其中諾氟沙星質(zhì)量濃度范圍為 ND（未檢出）－6.170 ng·L-1；磺胺二甲基嘧啶質(zhì)量濃度為 ND－0.925 ng·L-1；磺胺甲惡唑質(zhì)量濃度范圍為 0.168－5.735 ng·L-1；磺胺吡啶質(zhì)量濃度范圍為 ND－0.375 ng·L-1；磺胺異惡唑質(zhì)量濃度范圍為ND－0.133 ng·L-1。

2.1.2 沉積物中抗生素的殘留及分布

沉積物抗生素檢測(cè)中，各樣點(diǎn)總抗生素質(zhì)量濃度范圍為 ND－1.240 ng·L-1，其中 S5（1.240 ng·L-1）質(zhì)量濃度最高，S1、S7、S8（低于檢出限）最低。15種目標(biāo)抗生素中，僅有磺胺吡啶、磺胺異惡唑兩種抗生素被檢出，檢出率分別為50%、60%，其濃度范圍分別為 ND－0.6、ND－0.64 ng·g-1。

2.2 ARGs豐度及分布特征

2.2.1 海水中ARGs豐度及分布特征

海水中ARGs及16S rRNA絕對(duì)豐度及分布特征見(jiàn)圖2a。由圖可以看出，海水∑ARGs、16S rRNA絕對(duì)豐度分別為 8.68×103－1.37×109copies·L-1、1.01×1010－1.37×1011copies·L-1；∑ARGs相對(duì)豐度為 8.57×10-7－3.45×10-2，最高∑ARGs 相對(duì)豐度（3.45×10-2）出現(xiàn)在S4號(hào)采樣點(diǎn)，S3次之（2.68×10-2），S10 最?。?.57×10-7）。在 12 個(gè) ARGs中，sul1、sul2、dfrA1、tetA、tetC、tetG、tetM、cata2、cmle1、cmle3檢出率為90%，cata1檢出率為80%，qnrS檢出率為100%，在樣點(diǎn)S10處僅有qnrS被檢出。在海水樣品中，sul2絕對(duì)豐度最高（5.13×108copies·L-1），sul1 次之（1.21×108copies·L-1），tetM最低（1.16×105copies·L-1）。

2.2.2 沉積物中ARGs豐度及分布特征

沉積物ARGs絕對(duì)豐度以樣品干重進(jìn)行計(jì)量，詳見(jiàn)圖2c。由圖可知，沉積物中∑ARGs和16S rRNA絕對(duì)豐度分別為 1.13×108－5.34×108copies·g-1、1.33×109－1.24×1010copies·g-1；ARGs 相對(duì)豐度為1.57×10-2－1.08×10-1。由圖 2c、圖 2d 可知，各 ARG在沉積物樣品中均有檢出，且檢出率為 100%，說(shuō)明檢測(cè)的 ARGs在沉積物樣品中廣泛存在。ARGs含量水平表現(xiàn)為：磺胺類(lèi)抗性基因＞氯霉素類(lèi)抗性基因＞四環(huán)素類(lèi)抗性基因＞喹諾酮類(lèi)抗性基因，其中sul2豐度在所有采樣點(diǎn)中均為最高，絕對(duì)豐度高達(dá)5.05×107－2.17×108copies·g-1，cmle3 次之，絕對(duì)豐度為 2.73×107－1.40×108copies·g-1。

3 討論

3.1 東寨港抗生素含量水平及分布

各檢出抗生素質(zhì)量濃度差異不明顯（P＞0.05）。與高橋紅樹(shù)林區(qū)（Li et al.，2016）、渤海灣（Zou et al.，2011）及珠江（He et al.，2012)、漢江（Hu et al.，2018）相比，東寨港抗生素的質(zhì)量濃度及檢出率都處于較低水平。這可能與東寨港區(qū)域抗生素間斷性輸入有關(guān)，同時(shí)，抗生素自身性質(zhì)也可能是重要原因之一，比如磺胺類(lèi)及喹諾酮類(lèi)抗生素具有光敏感性（Thiele-Bruhn，2003；Park et al.，2002）而四環(huán)素類(lèi)抗生素存在吸附-解析行為（Tenenbaum et al.，2014）。

抗生素在海水和沉積物中的殘留量均表現(xiàn)為內(nèi)港區(qū)域高于臨海區(qū)域，這可能與內(nèi)灣區(qū)域海水養(yǎng)殖和養(yǎng)殖塘排污有關(guān)；對(duì)各點(diǎn)抗生素質(zhì)量濃度進(jìn)行差異分析發(fā)現(xiàn)，各采樣點(diǎn)抗生素的污染差異不明顯（P＞0.05）。此外，海水中抗生素殘留量高于沉積物，可能與抗生素的水溶性有關(guān)。

3.2 東寨港ARGs污染分析

3.2.1 海水中ARGs豐度及分布特征分析

內(nèi)港區(qū)域∑ARGs絕對(duì)豐度高于入?？凇＠肙ne-way ANOVA對(duì)海水中不同點(diǎn)ARGs進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)各采樣點(diǎn)之間并無(wú)顯著性差異（P＞0.05），這可能是當(dāng)?shù)睾Ｋl繁交替而加速各樣點(diǎn)微生物擴(kuò)散導(dǎo)致的。采用相對(duì)豐度進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)東寨港的sul1、sul2檢出豐度（圖2b）比山東地區(qū)海水養(yǎng)殖區(qū)高（李壹等，2016），與海河河水檢出豐度相近（Luo et al.，2010），說(shuō)明該地受到了磺胺類(lèi)抗生素抗性基因的污染。高拷貝數(shù)的sul1和sul2可能是微生物受到磺胺類(lèi)藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的，同時(shí)也與 sul基因在環(huán)境中代謝速度慢有關(guān)（Mckinney et al.，2010）。此外，sul1經(jīng)常與一類(lèi)整合子結(jié)合在一起（Sk?ld，2000），兩者之間的緊密關(guān)系也可能是sul1基因表現(xiàn)出高豐度的原因之一。

3.2.2 沉積物中ARGs豐度及分布特征分析

就絕對(duì)豐度而言，內(nèi)港區(qū)域∑ARGs豐度高于入?？趨^(qū)域；而相對(duì)豐度呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)（圖2c、圖2d）。內(nèi)港區(qū)域高水平的ARGs絕對(duì)豐度可能與該區(qū)域大面積的海水養(yǎng)殖有關(guān)；而其較入海口區(qū)域低的相對(duì)豐度說(shuō)明內(nèi)港ARGs在微生物群落中的表達(dá)低于入?？趨^(qū)域。對(duì)沉積物中不同采樣點(diǎn) ARGs進(jìn)行差異分析，發(fā)現(xiàn)各采樣點(diǎn)間的ARGs豐度差異并不明顯（P＞0.05），這可能與該區(qū)域抗生素的污染源分布及當(dāng)?shù)仡l繁的水流交換有關(guān)。與長(zhǎng)江口（Guo et al.，2018）和北江流域（Ling et al.，2013）的研究結(jié)果相比，東寨港沉積物中ARGs豐度較高，與灞河相當(dāng)（Jia et al.，2018）。在研究區(qū)域，磺胺類(lèi)抗性基因（sul1、sul2）含量較其他基因處于較高水平，這與珠江水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)調(diào)查結(jié)果一致（梁惜梅等，2013）。sul1和 sul2的高水平表達(dá)，說(shuō)明這兩種基因的宿主菌對(duì)各種環(huán)境的耐受能力強(qiáng)，從而促進(jìn)了這兩種基因在環(huán)境中的擴(kuò)散與傳播。

本研究表明，東寨港海水和沉積物均受到12種ARGs的影響，與前人研究相比，其豐度處于較高水平。氯霉素是一類(lèi)廣譜性藥物，曾被廣泛用于畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)，而由于其具有誘發(fā)再生障礙性貧血癥和致畸等強(qiáng)毒副作用（Turton et al.，2000），中國(guó)已于1999年禁止此類(lèi)抗生素藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的使用。但近年來(lái)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶類(lèi)耐藥基因（cata1、cata2）及編碼氯霉素外排泵蛋白類(lèi)基因（cmle1、cmle3）在海水養(yǎng)殖區(qū)仍屢屢被檢出（Hu et al.，2008；李壹等，2016），說(shuō)明歷史背景誘導(dǎo)產(chǎn)生的 ARGs仍廣泛存在于養(yǎng)殖環(huán)境中。在東寨港海水和沉積物中氯霉素類(lèi)抗性基因（cata1、cata2、cmle1、cmle3）分布極為廣泛，與山東地區(qū)海水養(yǎng)殖區(qū)相比（李壹等，2016），該區(qū)域氯霉素類(lèi)抗性基因相對(duì)豐度較高。四環(huán)素外排基因（tetA、tetC、tetG）及核糖體保護(hù)外排基因（tetM）常常在海水養(yǎng)殖環(huán)境及自然環(huán)境水體中被檢出（Ling et al.，2013；Luo et al.，2010；Mackie et al.，2006），同時(shí)也廣泛存在于東寨港區(qū)域。在東寨港海水和沉積物中，tetC基因含量均比其他四環(huán)素類(lèi)抗性基因豐度高，這一結(jié)果與對(duì)洪澤湖的研究結(jié)果相似（羅方園等，2017）。此外，喹諾酮類(lèi)抗生素是近年來(lái)使用的一類(lèi)抗生素類(lèi)藥物，但喹諾酮類(lèi)耐藥菌已在多種環(huán)境中被檢測(cè)到。喹諾酮類(lèi)抗性基因（qnrS）東寨港海水和沉積物中檢出率均為100%，其帶來(lái)的污染不容小覷。

3.2.3 海水和沉積物中ARGs差異分析

采用t檢驗(yàn)對(duì)兩種介質(zhì)中ARGs進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在明顯的差異（P＜0.05），其中沉積物的ARGs豐度顯著高于海水。這說(shuō)明抗性基因在沉積物樣品中的污染比海水嚴(yán)重，即沉積物中ARGs在微生物群落中的表達(dá)高于海水。這一現(xiàn)象可能與沉積物對(duì)污染物的強(qiáng)貯存能力和海水的強(qiáng)擴(kuò)散能力有關(guān)，同時(shí)也可能與沉積物中較為活躍的微生物基因交流有關(guān)。東寨港生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，為全面了解當(dāng)?shù)匚廴厩闆r，還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

圖3 海水及沉積物中ARGs絕對(duì)豐度及抗生素含量的相關(guān)分析Fig.3 Correlation analysis of ARGs in seawater and sediment.

3.3 海水/沉積物中ARGs、抗生素相關(guān)性分析

對(duì)東寨港海水/沉積物中ARGs進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖3。海水中SA與∑ARGs之間存在顯著的相關(guān)性（r=0.990，P＜0.01）；海水中16S rRNA與sul1和 drfA1均存在顯著相關(guān)性（r=0.882和 0.799，P＜0.01），而與其他基因相關(guān)性較弱。在沉積物中，介導(dǎo)抗生素外排機(jī)制基因tetC、cmle1、cmle3兩兩之間存在顯著相關(guān)性（r=0.731－0.958，P＜0.01或P＜0.05）。忽略ARGs的作用機(jī)制不談，在海水樣品中，sul1、sul2、tetA、tetG與∑ARGs、SA之間顯著相關(guān)（r=0.657－0.976，P＜0.1或P＜0.05）。沉積物中sul1及sul2分別與另外5種ARGs（tetC、tetM、cata1、cmle1、cmle3）存在顯著相關(guān)性（r=0.674－0.964，P＜0.01或P＜0.05）。此外，sul1、sul2、tetC、tetM、cata1、cmle3與∑ARGs、SA、TA、CA 均存在顯著或極顯著相關(guān)性（r=0.756－0.997，P＜0.01或P＜0.05），∑ARGs、SA、TA、CA兩兩之間呈極顯著相關(guān)（r=0.838－0.986，P＜0.01）。根據(jù)以上分析結(jié)果可知，東寨港海水/沉積物中不同或相同類(lèi)別的ARGs之間都可能存在相關(guān)性，這與灞河的結(jié)果類(lèi)似（Jia et al.，2018），而抗生素產(chǎn)生的選擇壓力和 ARGs在環(huán)境中的轉(zhuǎn)移機(jī)制可能是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的重要原因。為更全面了解各ARG之間的關(guān)系，進(jìn)一步研究環(huán)境中ARGs的轉(zhuǎn)移機(jī)制十分有必要。

對(duì)已檢出的不同類(lèi)型的抗生素分別進(jìn)行加和統(tǒng)計(jì)，并與ARGs進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖3所示?？股嘏cARGs之間相關(guān)性較弱（P＞0.05），這可能與抗生素的物理化學(xué)性質(zhì)及ARGs在環(huán)境中的轉(zhuǎn)移機(jī)制有關(guān)（Jia et al.，2018）。此外，天氣狀況和水溫等環(huán)境因素也對(duì)抗生素及 ARGs造成影響（Cesare et al.，2017；Peak et al.，2007）。同時(shí)，抗生素的低水平及ARGs的高水平檢出說(shuō)明：由歷史背景誘導(dǎo)產(chǎn)生的ARGs可進(jìn)行自我擴(kuò)增而持續(xù)存在于環(huán)境中（Ling et al.，2013）。

4 結(jié)論

（1）東寨港海水和沉積物的ARGs豐度處于較高水平，這將給當(dāng)?shù)匚⑸锶郝浞€(wěn)定性帶來(lái)考驗(yàn)。

（2）沉積物中抗性基因污染比海水嚴(yán)重，說(shuō)明沉積物是東寨港區(qū)域重要的ARGs儲(chǔ)存介質(zhì)。

（3）東寨港抗生素檢出率較低，殘留較少，與ARGs相關(guān)性較弱。