某豬場高致病性豬藍耳病和胸膜肺炎放線桿菌混合感染的診斷分析

張 森，石遠菊，湯德元，葉 麗，楊 偉，廖少山，郭倩妤

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

貴州省某豬場從湖北引進后備母豬500多頭，引進后部分豬只出現(xiàn)咳嗽、喘氣、呼吸困難、體溫升高、耳朵部位皮膚發(fā)紺等臨床癥狀，且免疫豬瘟疫苗后病癥加重。引進1周左右，死亡6頭，發(fā)病期間該豬場曾使用過泰樂菌素、氨芐西林，阿莫西林等抗生素進行治療，但大部分豬病情未見好轉，發(fā)病率反而上升。

1 臨床癥狀

病豬精神沉郁，食欲減少或廢絕，體溫升高，出現(xiàn)不同程度的呼吸困難，喘氣和咳嗽，鼻部間可見明顯出血，被毛粗亂，共濟失調，漸進性消瘦，眼瞼水腫，少數(shù)病豬表現(xiàn)出咳嗽及雙耳背面、邊緣、腹部及尾部皮膚發(fā)紺，部分后備母豬于發(fā)病后2～4?d內死亡。

2 剖檢變化

發(fā)病豬肺臟淤血、出血、壞死、有纖維素性滲出物（圖1），肝臟腫大，淤血（圖2），胃底部彌漫性出血（圖3）

3 實驗室診斷

3.1 細菌的分離培養(yǎng)

用滅菌接種環(huán)無菌取病變肝臟直接涂片后，經革蘭氏染色于油鏡下觀察，有少量長絲狀的紅色桿菌（圖4-A）。無菌接種于血清營養(yǎng)瓊脂平板上，于37?℃、CO2需氧/厭氧條件培養(yǎng)24～48?h，分離菌株在含F(xiàn)BS的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)約12?h后形成表面光滑、圓形、凸起、濕潤、灰白色帶金黃色熒光且不透明的菌落，結構細致，在菌落上面似有一層白色云霧（圖4-B），用滅菌接種環(huán)挑取培養(yǎng)約12?h后的單個菌落，經革蘭氏染色于油鏡下觀察，可見革蘭氏陰性球桿菌，菌體細小，也可見桿狀、絲狀散在菌體（圖4-C），培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及革蘭氏染色鏡檢結果與胸膜肺炎放線桿菌的基本特性相符。

圖1 肺臟淤血、出血、壞死、有纖維素性滲出物

圖2 肝臟臟淤血、腫大

圖3 胃底部彌漫性出血

3.2 細菌的生化特性鑒定

按照細菌生化鑒定管的說明書，將疑似菌落的純培養(yǎng)物分別接種于 5?μL?FBS的生化鑒定管中，置于 37?℃?5?% 的 CO2培 養(yǎng) 箱 中， 培 養(yǎng)24～48?h后觀察結果。生化鑒定結果顯示：分離菌株能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、木糖和甘露醇，尿素酶、H2S陽性；吲哚試驗、甲基紅試驗、VP試驗、衛(wèi)矛醇試驗、KCN試驗陰性。以上生化結果參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》上的判斷標準，與胸膜肺炎放線桿菌的生化特性基本相符。

圖4 分離菌株的形態(tài)學觀察

3.3 ?豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的PCR鑒定

參照馬曉平[1]建立的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的PCR檢測方法，用煮沸法提取純化的菌液的DNA為模板，用生物公司的APP引物（dsbE-F：5'-GCTTCCATACTTGCCTTATTCG-3'；dsbER：?5'-TCGGTTGATCGGAATAGGTAAG-3'）進行PCR擴增，預擴增片段為374?bp。反應結束后取PCR產物5?μL，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查，擴增的片段與預期目的片段374?bp接近（圖5），將分離菌株的目的片段回收純化后送華大基因公司測序。測序結果分析表明：分離的菌株與NCBI上的胸膜肺炎放線桿菌菌株有99.1?%～99.6?%的同源性。

3.4 ?豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的藥敏試驗

圖5 分離菌株APP dsbE基因的PCR擴增結果

圖6 藥敏試驗結果

挑取含F(xiàn)BS的LB瓊脂平板上的單個菌落于LB液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)， 約 12?h 后 取 0.5?mL 菌 液 均 勻 涂布于含F(xiàn)BS的LB瓊脂平板表面，待菌液吸收后貼上鏈霉素、磺胺甲基異唑、卡那霉素、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素、阿莫西林、青霉素、慶大霉素、頭孢曲松等9種藥敏紙片，置37?℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24?h，用直尺測量抑菌圈直徑，參考藥敏試驗抑菌圈直徑判定標準(WS-T125-1999)?判定藥敏試驗結果。藥敏試驗結果顯示（圖6）：分離的APP對磺胺甲基異唑的抑菌圈直徑為17?mm，高敏；對頭孢曲松的抑菌圈直徑為11?mm，中敏；對鏈霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素、阿莫西林、青霉素、慶大霉素等抗生素的抑菌圈直徑在10?mm以下，敏感性低或不敏感。

3.5 動物致病性試驗

挑取含F(xiàn)BS的LB瓊脂平板上的單個菌落于5?mL?含F(xiàn)BS的LB液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)，約12?h后分別吸取菌液原液、用LB液體進行1：1稀釋、1：10稀釋、1：20稀釋，最后用注射器分別吸取4個梯度的菌液，對4組小白鼠進行腹腔注射，每組雌雄小白鼠各一只，每組小白鼠分別注射1?mL菌液原液、1?mL1：1 稀釋的菌液，1?mL?1：10 稀釋的菌液，1?mL?1：20稀釋的菌液，最后用兩只小白鼠分別腹腔注射1?mL?LB液體作正常對照，注射10?h內每隔2?h觀察1次小白鼠的活動情況。

試驗組注射菌液1?h內小鼠不采食和飲水，喜用嘴啃食腹部，2?h后小鼠精神沉郁，不活動，8?h后注射原液的小鼠死亡，24?h后注射1：1稀釋菌液的小鼠也死亡，72?h后注射1：10稀釋菌液的小鼠死亡，剖解死亡的小鼠，發(fā)現(xiàn)腹腔中有大量膿液，腸壁變薄，腸腔充滿黃色內容物，肺臟出血，肝臟淤血、壞死，脾臟淤血、壞死（圖7）。無菌采取小鼠的肺臟進行涂片，革蘭氏染色鏡檢出現(xiàn)大量革蘭氏陰性長短不一的紅色桿菌（圖8），與豬肺臟組織涂片的染色鏡檢結果相同。

3.6 高致病性豬藍耳病RT-PCR檢測

采集送檢豬的肺臟、肝臟及胃黏膜，取病變部位混合研磨，反復凍融3次，勻漿器磨20?min后收集勻漿液，12?000?r/min?離心 10?min，取上清液， 用 TaKaRa?MinBEST?Viral?DNA/RNA?Extraction?Kit?Ver.5.0?試 劑 盒 提取核酸。參照浙江省地方標準（DB?33/T?822—2011）中高 致病性豬 藍耳病RT-PCR檢測方法對提取的核酸進行RT-PCR檢測，引物序列（P1：5'-ATGGGCGACAATGTCCCTAAC-3'；P2：5'-GAGCTGAGTATTTTGGGCGTG-3'）， 待檢樣品出現(xiàn)421?bp的擴增條帶，為HPPRRSV 陽性 ；待檢樣品出現(xiàn) 511?bp?的擴增條帶，判定為美洲型PRRSV陽性。病變組織核酸經RT-PCR擴增出了421?bp的特異性條帶（圖 9）。

圖7 注射菌液后死亡小白鼠的剖解結果

圖8 小鼠肺臟涂片革蘭氏染色鏡檢結果（10×100）

圖9 豬高致病性藍耳病毒RT-PCR擴增結果

將G1號后備母豬的PCR產物膠回收克隆后送昆泰銳（武漢）生物技術有限責任公司測序，應用MegAlign和MEGA軟件把測序結果與GenBank上已收錄的國內毒株進行進行核苷酸同源性分析及構建遺傳進化樹。核苷酸同源性分析結果顯示（表1）：PRRSV-G1株與近幾年來國內各個地區(qū)流行的12株高致病性豬藍耳病毒株同源性較高，為99.0%～99.5%，其NSP2基因均缺失了30個氨基酸；與2005年以前的經典豬藍耳病流行毒株的同源性較低，為88.4%～93.1%。遺傳進化樹分析結果顯示（圖10）：PRRSV-G1株與2005以前的經典藍耳病流行毒株親緣關系較遠，與2008年之后流行的高致病性藍耳病毒株親緣關系較近，且與2012年湖北分離的YC1202株屬于同一遺傳進化分支。

3.7 ?HP-PRRSV-?G1 株的致病性試驗

將G1號后備母豬的肺臟、肝臟及胃黏膜的病變部位混合研磨，反復凍融3次，勻漿器研磨后收集勻漿液，用MEM按1∶5的比例進行稀釋，12?000?r/min?離心 10?min，取上清液用雙抗處理，再用0.22?μm的細菌濾器過濾除菌，取0.5?mL接種已長滿成單層Marc-145細胞，結果48?h后細胞出現(xiàn)變圓、固縮、折光性改變、聚集，最后脫落（圖11）。72?h收毒后反復凍融3次，提取病毒的核酸經RT-PCR檢測，檢測出HP-PRRSV的特異性條帶，說明該病毒能在Marc-145細胞上增值，且能產生CPE現(xiàn)象。

4 診斷結果與討論

根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀、病理解剖、細菌的分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化特性鑒定、藥敏試驗、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測、小鼠致病性試驗、豬高致病性豬藍耳病RT-PCR檢測及接種Marc-145細胞，確診該豬場患病死亡后備母豬為高致病性豬藍耳病和豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌混合感染，G1號后備母豬的核酸RT-PCR測序結果與2012年湖北分離的YC1202株（JX144928）屬于同一遺傳進化分支，且該豬場是從湖北引進的后備母豬，所以該豬場的高致病性豬藍耳病可能是從湖北引種的豬場傳染的。

此研究分離的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌對小鼠具有較強的致病性，而馬曉平[1]2005年分離的3株豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌注射小鼠后無明顯病變，但注射試驗豬后，3株分離的菌株均能導致豬出現(xiàn)體溫升高，呼吸極度困難，呈犬坐勢，耳朵、四肢等皮膚出現(xiàn)發(fā)紅，口鼻流出帶血的泡沫，雙側肺炎及肺臟大面積壞死，心臟血管充盈，腸系膜淋巴結腫大、充血，腸壁充血等癥狀。

隨著臨床生產實踐中抗菌藥物的大量使用，APP的耐藥性也越來越嚴重。余波等[2]采用藥敏紙片法對2014年3月份—2016年3月份在貴州省貴陽市、安順市、遵義市、凱里市、興義市、銅仁市、六盤水市、甕安縣15個規(guī)?；B(yǎng)豬場分離得到的31株豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌進行耐藥性檢測，結果18種抗生素中只有頭孢噻吩、頭孢拉定、氟苯尼考、泰樂菌素敏感。該研究從貴州福泉某豬場分離的菌株FA僅對磺胺甲基異唑和頭孢曲松敏感，對鏈霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素、阿莫西林、青霉素、慶大霉素等抗生素耐藥。菌株FA分離于貴州省某豬場病變豬的肺臟，該豬場用過泰樂菌素、氨芐西林，阿莫西林等藥物，這可能與養(yǎng)殖場在豬病的防治上濫用抗生素有關。

表1 PRRSV-G1株的核苷酸同源性分析

圖10 PRRSV-G1株的遺傳進化樹分析

圖11 HP-PRRSV-G1株在Mark-145細胞上的病變結果

2006年5 月，我國的江西省暴發(fā)了“豬高熱病”，仔豬發(fā)病率100%、死亡率達50%以上，母豬流產率達30%以上，育肥豬也可發(fā)病死亡是其一個特征。該病自首次暴發(fā)后便在我國主要養(yǎng)豬省份迅速暴發(fā)，導致超過100萬頭豬死亡，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經濟損失。經研究證實，引起此次疫病的主要病原是變異的美洲型PRRSV，稱為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒[3-4]。由其引起的疾病被稱為高致病性豬繁殖與呼吸 綜 合 征（Highly?pathogenic?porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome，HP-PRRS）。通過血清中和試驗和基因序列分析，確定高致病性豬藍耳病病毒為美洲型PRRSV。其蛋白（NSP2）存在2處不連續(xù)的缺失，其缺失位點為第481位和532～560位氨基酸；3’UTR非編碼區(qū)第17位堿基缺失；其他基因未見缺失[5]。此研究的HP-PRRSV-G1株與近幾年來國內各個地區(qū)流行的12株高致病性豬藍耳病毒株同源性較高，為99.0%～99.5%，其NSP2基因均缺失了30個氨基酸；與2005年以前的經典豬藍耳病流行毒株的同源性較低，為88.4%～93.1%。據(jù)原農業(yè)部統(tǒng)計，截至2007年12月9日，共有26個省份的310個縣市發(fā)生高致病性豬藍耳病疫情，發(fā)病豬31.26萬頭，死亡8.21萬頭[6]；并且在臨床表現(xiàn)上與以前一般的豬藍耳病有很大不同。有如下特征癥狀：高熱（40～42℃）、瘀點和紅疹等等。尤其在暴發(fā)期間，很多成年豬和一些懷孕母豬也死于感染。然而在以前PRRSV感染造成的死亡大部分是小豬。

該豬場應結合本場生產實際情況，緊急接種高致病性豬藍耳?。═JM-F92株）疫苗，同時根據(jù)藥敏試驗結果投喂敏感的藥物，磺胺甲基異唑和頭孢曲松，避免繼發(fā)感染。豬場最好堅持自繁自養(yǎng)的原則，創(chuàng)建穩(wěn)定的種豬群，不要隨意引種。如必須引種，首先要弄清所引豬場的疫情，此外，還應進行血清學檢測，陰性豬才可以引入，引入后必須建立適當?shù)母綦x區(qū)，做好監(jiān)測工作，一般需隔離檢疫4～5周，健康者才可混群飼養(yǎng)。最后，要定期對豬舍和環(huán)境進行消毒，保持豬舍、飼養(yǎng)管理器械及環(huán)境的清潔衛(wèi)生，做好其他疫病的免疫接種，控制好其他疫病，特別是豬瘟、豬偽狂犬病、豬傳染性胸膜肺炎、豬氣喘病的控制。