通腑平喘方對膿毒癥急性肺損傷大鼠Keap1-Nrf2/ARE信號通路的影響*

楊麗夢 熊旭東

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021）

膿毒癥（Sepsis）由于宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致生命危險(xiǎn)的器官功能障礙的臨床綜合征［1］。全世界范圍內(nèi)膿毒癥發(fā)病率越來越高，其總體死亡率仍高達(dá)25%～45%［2］。在人體的各個(gè)器官中，肺是膿毒癥多器官功能障礙綜合征中最容易受損，也是最早受損的器官，其常見表現(xiàn)為急性肺損傷（ALI）或急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），而這卻往往是患者的直接死亡原因［3］。 中醫(yī)經(jīng)典理論“肺與大腸相表里”是肺經(jīng)與大腸經(jīng)之間存在表里絡(luò)屬關(guān)系，疾病傳變上相互影響。通過對膿毒癥的長期臨床觀察及對其病因病機(jī)的認(rèn)識，學(xué)界認(rèn)為肺腸同治法對治療膿毒癥ALI患者有較好的臨床療效。本實(shí)驗(yàn)采用肺腸同治法，探討通腑平喘方對膿毒癥急性肺損傷大鼠抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，觀察其對KeapⅠ-Nrf2/抗氧化物反應(yīng)原件 （ARE）信號通路的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雄性清潔級SD大鼠40只，體質(zhì)量210～230 g。購于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號：SYXK（滬）2014-0008。

1.2 試劑與器材

血清丙二醛（MDA）（產(chǎn)品編號 S0131）、超氧化物歧化酶（SOD）（產(chǎn)品編號 S0101）、谷胱甘肽（GSH）（產(chǎn)品編號S0052）生化試劑盒，Nrf2酶聯(lián)免疫分析試劑盒（批次201612）均購于上海富樂生物有限公司。熒光定量PCR試劑盒于上海紐思格生物科技有限公司購置。通腑平喘方藥物組成：大黃10 g，芒硝10 g，桃仁10 g，葶藶子15 g，桑白皮10 g等。除芒硝和大黃外，用10倍體積的清水浸泡飲片30 min，用武火煮至沸騰后，再用文火煮20 min，最后加入大黃，煎10 min后熄火濾取煎液。第2煎加入6倍體積的清水，煮沸后文火再煎煮20 min，熄火濾取煎液。將2次煎煮的湯藥混合用5層醫(yī)用紗布濾渣，將芒硝加入濾液中，充分?jǐn)嚢柚寥芙猓詈髮帩饪s至含生藥1 g/mL。放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分組與造模

將40只成年雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、中藥組、模型組及假手術(shù)組4組，每組10只。采用CLP制備膿毒癥模型。正常組于6 h、12 h后予以0.9%氯化鈉注射液灌胃。假手術(shù)組開腹后將盲腸取出后再回納到腹腔，術(shù)后6 h、12 h予以0.9%氯化鈉注射液灌胃。模型組CLP術(shù)后立即予以0.9%氯化鈉注射液灌胃，術(shù)后6 h、12 h再次予以0.9%氯化鈉注射液灌胃。中藥組CLP術(shù)后立即予以通腑平喘方（9.9 g/kg）灌胃，術(shù)后6 h、12 h再次予以通腑平喘方（9.9 g/kg）灌胃。以上各組均在24 h后麻醉并行腹主動(dòng)脈采血致死，取出肺組織。

1.4 標(biāo)本采集與檢測

1.4.1 標(biāo)本采集 用10%水合氯醛 （0.5 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，打開腹腔，將腹腔內(nèi)腸腔等臟器撥開，打開后腹膜，暴露腹主動(dòng)脈，用10 mL無菌注射器抽取動(dòng)脈血，1 mL置入肝素化注射器，在室溫下行動(dòng)脈血?dú)夥治觯溆喾盅b于10 mL無菌試管中，待靜置30 min后放入水平離心機(jī)中，離心15 min（3 000 r/min），取上層血清，分別裝入1.5 mL eppendorf管內(nèi)，存放在-80℃冰箱待用。大鼠血標(biāo)本采集完畢后，立即打開大鼠胸腔，小心取出左肺組織，用于肺組織濕干重（W/D）比值測定。取出完整右肺，其中右肺上葉用生理鹽水漂洗后，置于10%甲醛中固定，備用于病理及免疫組化檢測。右肺中葉及下葉用生理鹽水漂洗后分置于eppendorf管內(nèi)，置入液氮罐中速凍后，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 各組一般情況觀察 CLP術(shù)后24 h內(nèi)觀察大鼠的一般情況，如大鼠的活動(dòng)度、毛發(fā)、呼吸、進(jìn)食飲水、分泌物、排便等情況。

1.4.3 血清MDA、GSH、SOD檢測 血清MDA的含量測定采用比色法進(jìn)行檢測；血清GSH的含量測定采用TBA法；血清SOD的含量測定采用WST-8法進(jìn)行檢測，具體步驟完全按照說明書操作。

1.4.4 血清Nrf2及Nrf2 mRNA的含量測定 血清MDA的含量測定采用雙抗體夾心法進(jìn)行檢測，具體步驟完全按照說明書操作。Nrf2 mRNA的含量測定采用RT-PCR法測定其表達(dá)水平，Real-timePCR反應(yīng)體系：Rat-GAPDH：NCBI Reference Sequence：NM_017008.4，擴(kuò)增長度：100 bp。 Sense：5′-GTATGACTCTACCCACG GCA-3′。Antisense：5′-ATCTCGCTCCTGGAAGATGG-3′。Rat-Nrf2：NCBI Reference Sequence：NM_031789.2，擴(kuò)增長度：106 bp。 Sense：5′-AGAAGGAACAGGAGAAG GCC-3′。 Antisense：5′-CCACTGGTGTCTGTCTGGAT-3′。1.4.5 肺組織病理結(jié)構(gòu)觀察 將經(jīng)固定修剪過的右肺組織經(jīng)脫水后行石蠟包埋，制作成蠟塊后于旋轉(zhuǎn)切片機(jī)上將肺組織蠟塊進(jìn)行切片（厚度5 μm），涂載玻片后，放置于烘片機(jī)上進(jìn)行烘干。烘干后行肺組織HE染色。

1.4.6 肺組織濕/干質(zhì)量比 用濾紙沾干左肺組織多余水分后稱重（濕質(zhì)量），后置于60℃烤箱內(nèi)干烤72 h，再次稱重（干質(zhì)量），計(jì)算肺濕/干質(zhì)量比（W/D）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以（x±s）來表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，如果方差齊應(yīng)用單因素方差分析，如果方差不齊采用秩和檢驗(yàn)，以α=0.05作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一情況比較

正常組與假手術(shù)組大鼠的活動(dòng)度、毛發(fā)、呼吸、進(jìn)食飲水、排便情況等均正常。模型組大鼠術(shù)后出現(xiàn)活動(dòng)減少，蜷縮，毛發(fā)豎立，呼吸頻率加快，不欲進(jìn)食，腹部膨隆，眼鼻口處可見分泌物，無大便等。中藥組大鼠術(shù)后一般情況均優(yōu)于模型組。術(shù)后解剖大鼠過程中，假手術(shù)組大鼠肺組織的大體外觀、顏色等與正常組無差別，而模型組與中藥組均可見肺組織不同程度的腫脹、淤點(diǎn)、淤斑。

2.2 各組大鼠肺組織病理切片比較

見圖1。正常組及假手術(shù)組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，腔內(nèi)清晰，未見炎癥細(xì)胞機(jī)漿液滲出，肺間質(zhì)未見明顯水腫；模型組大鼠肺組織中肺泡結(jié)構(gòu)均被破壞嚴(yán)重，肺泡及間質(zhì)可見明顯水腫，炎癥細(xì)胞浸潤明顯，肺毛細(xì)血管不同程度出現(xiàn)瘀血及出血改變；中藥組大鼠肺組織中亦可見肺水腫及炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺毛細(xì)血管少量的淤血及出血，與模型組相比，肺組織損傷相對較輕。

圖1 各組大鼠肺組織病理切片比較（HE染色，100倍）

2.3 各組大鼠肺肺組織W/D值比較

見表1。模型組和中藥組的W/D值高于正常組和假手術(shù)組（P＜0.01），模型組的W/D值高于中藥組（P＜0.01），正常組與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠肺肺組織W/D值比較（x±s）

2.4 各組大鼠動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）比較

見表2。模型組和中藥組的動(dòng)脈PaO2低于正常組和假手術(shù)組（P＜0.01），模型組的動(dòng)脈氧分壓低于中藥組（P＜0.01），正常組與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠動(dòng)脈血 PaO2比較（mmHg，x±s）

2.5 各組大鼠血清MDA、SOD、GSH水平比較

見表3。模型組大鼠血清MDA含量與正常組、假手術(shù)組及中藥組相比明顯升高（P＜0.01），中藥組與模型組相比，大鼠血清MDA含量明顯下降（P＜0.01）。中藥組與正常組及假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。模型組和中藥組的血清SOD、GSH含量低于正常組和假手術(shù)組（P＜0.01），模型組的血清 SOD、GSH含量低于中藥組（P＜0.01），正常組與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠血清MDA、SOD、GSH水平比較（x±s）

2.6 各組大鼠血清Nrf2、Nrf2 mRNA比較

見表4。模型組和中藥組的血清Nrf2含量高于正常組和假手術(shù)組（P＜0.01），中藥組的血清Nrf2含量高于模型組（P＜0.01），正常組與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組和中藥組的Nrf2 mRNA表達(dá)水平高于正常組和假手術(shù) （P＜0.01），中藥組的Nrf2 mRNA表達(dá)水平高于模型組（P＜0.01），正常組與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠血清Nrf2、Nrf2 mRNA比較（x±s）

3 討 論

通腑平喘方是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院急診科常用中藥制劑，方中大黃、芒硝及桃仁三者共為君藥，功可瀉熱攻下通里、釜底抽薪、通腑存陰。桑白皮性味甘、寒，歸肺經(jīng)，能瀉肺平喘、利水消腫。桑白皮湯治療膿毒癥呼吸衰竭（痰熱壅肺證）臨床觀察中發(fā)現(xiàn)桑白皮湯能提高患者氧合指數(shù)，降低急性生理與慢性健康情況評價(jià)Ⅱ（APACHEⅡ）評分，顯著改善患者的臨床癥狀［4］。葶藶子性味苦、辛、大寒，歸肺經(jīng)及膀胱經(jīng)，其具有瀉肺平喘、利水消腫的功效，而且專瀉肺中痰火及痰飲而平喘。其與桑白皮相須為用，增強(qiáng)瀉肺平喘之功，三者共為臣藥，三者共用可瀉肺平喘，清熱化痰止咳，與君藥相配，增強(qiáng)通腑瀉熱平咳喘之功效，也體現(xiàn)了“肺腸同治”的理論。加上活血通便的當(dāng)歸，涼血解毒、滋陰降火的赤芍與玄參同為佐藥；全方主以通腑瀉熱，輔以化痰平喘，同時(shí)加以活血清營，配伍恰當(dāng)。前期研究表明通過通腑瀉熱能改善膿毒癥ALI/ARDS患者喘促、憋悶、腹脹便秘等臨床癥狀，提高患者的氧合指數(shù)，縮短機(jī)械通氣治療，降低病死率［5］。

在膿毒癥的發(fā)病機(jī)制中，氧化應(yīng)激反應(yīng)與膿毒癥及膿毒癥ALI密切相關(guān)，是重要的發(fā)病機(jī)制之一。ALI是由創(chuàng)傷、燒傷和膿毒癥等應(yīng)激狀態(tài)下引起的急性并發(fā)癥［6-8］，目前研究表明氧化應(yīng)激在 ALI中起重要作用［9-10］。在正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)的氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體遭受各種有害的刺激時(shí)發(fā)生氧化應(yīng)激，體內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS），機(jī)體無法清除而導(dǎo)致組織損傷［11］。 Nrf2是與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子，Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap1）是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，其上的半胱氨酸殘基非常敏感，常常被看作是一個(gè)氧化應(yīng)激感受器。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2與Keap1相結(jié)合處于穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)氧化應(yīng)激發(fā)生后，Nrf2與Keap1解離進(jìn)入細(xì)胞核，Nrf2與抗氧化物反應(yīng)原件（ARE）相互作用，調(diào)控下游的抗氧化蛋白表達(dá)，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎與抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等功能［12］，在細(xì)胞的防御與保護(hù)中起著重要作用。在抗氧化的信號通路中，Keap1-Nrf2/ARE 是重要的信號通路［13-14］。

MDA是生物膜上不飽和脂肪酸受活性氧攻擊而發(fā)生脂質(zhì)過氧化后的產(chǎn)物。機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度及自由基水平通過它的含量來衡量［15］。SOD是在氧化應(yīng)激反應(yīng)中幫助機(jī)體清除氧自由基的一種重要的酶，是體內(nèi)重要的氧自由基清除劑，在生物體內(nèi)氧自由基清除系統(tǒng)中的一道重要防線。GSH是一種小分子三肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，它是體內(nèi)重要的抗氧化劑，在機(jī)體抗氧化損傷中起著重要的作用。Ji等用碳酰氯建立ALI模型研究中證實(shí)了Nrf2表達(dá)水平的升高，Nrf2在核內(nèi)積聚，GSH的表達(dá)水平上升從而降低碳酰氯對小鼠的氧化應(yīng)激損傷［16］。趙京禹等實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)ALI大鼠組中發(fā)生顯著的氧化應(yīng)激反應(yīng)，其MDA和髓過氧化物酶 （MPO）的水平顯著升高，SOD的水平顯著下降［17］。袁鼎山等在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)GSH干預(yù)組與假手術(shù)組中的PaO2和GSH含量均高于模型組，而且GSH干預(yù)組的肺損傷較模型組明顯減輕［18］。

本研究中藥組與正常組、假手術(shù)及模型組相比，血清Nrf2含量及肺組織中Nrf2 mRNA顯著升高，SOD和GSH也顯著升高，說明通腑平喘方可以上調(diào)Nrf2，啟動(dòng)ARE從而促使SOD和GSH的表達(dá)量增加，發(fā)揮抗氧化作用，從而防止組織損傷，而且中藥組中的血清MDA含量顯著低于模型組，中藥組中PaO2含量顯著高于模型組。本研究表明通腑平喘方能減輕大鼠肺水腫、肺病理損傷程度，上調(diào)肺組織Nrf2 mRNA表達(dá)及血清中Nrf2含量，啟動(dòng)ARE相關(guān)抗氧化蛋白SOD、GSH，從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善氧合功能，對膿毒癥大鼠肺組織具有保護(hù)作用，起到抗氧化應(yīng)激的作用?？梢?，抗氧化治療可以為以后臨床治療膿毒癥提供新的思路與方向。