顳葉癲癇動物模型研究進展☆

王軍 李承宗 龍浩 楊開軍王克萬 漆松濤

顳葉癲癇是反復(fù)發(fā)作、以中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，多為海馬、內(nèi)嗅皮層或杏仁核起源的復(fù)雜部分性發(fā)作，常伴早期腦損傷（如高熱驚厥，癲癇持續(xù)狀態(tài)，腦炎、外傷），大部分顳葉癲癇患者通過外科手術(shù)結(jié)合藥物達到癲癇完全控制，但具體機制不明[1]。顳葉癲癇的主要病理改變包括神經(jīng)元顯著丟失，星形膠質(zhì)細胞大量增生和異常苔蘚纖維發(fā)芽。理想的顳葉癲癇動物模型應(yīng)具備顳葉癲癇的主要特征：以海馬和杏仁核為起源的癥狀學(xué)特征，病理上特異的海馬損傷和海馬硬化，自發(fā)性反復(fù)發(fā)作，對大部分抗癲癇藥物耐受等。本文就常見的顳葉癲癇動物模型的方法，癲癇機制的研究進行總結(jié)，以探究顳葉癲癇的細胞和分子機制，為研制新的靶向療法提供依據(jù)。

1 常見癲癇動物模型種類

1.1 持續(xù)性癲癇動物模型持續(xù)性癲癇 (status epilepticus,SE)動物模型是由局灶性或全身性癲癇發(fā)展而來，表現(xiàn)為5 min以上持續(xù)癲癇發(fā)作的癲癇模型。

1.1.1 電點燃動物模型 采用重復(fù)恒定的亞抽搐劑量的電刺激，造成癲癇活動強度逐漸增加，最終出現(xiàn)全身性癲癇發(fā)作。將雙極電極埋入邊緣系統(tǒng)，應(yīng)用閾下持續(xù)刺激邊緣，如杏仁核、海馬和內(nèi)嗅皮質(zhì)，可造成海馬角（cornu ammonis，CA）CAl、CA3、內(nèi)嗅皮層和神經(jīng)元密度降低，神經(jīng)膠質(zhì)增生，齒狀回細胞分散。該方法可以通過選擇特點腦區(qū)、調(diào)整刺激參數(shù)等方式造成特定區(qū)域的癲癇發(fā)作；然而，電點燃模型方法耗時[2]，無海馬硬化現(xiàn)象，其病理改變與人類顳葉不同，并且難以誘發(fā)自發(fā)性癲癇發(fā)作，故應(yīng)用有限。

1.1.2 海人酸動物模型 海人酸（kanic acid,KA）是一種具有很強興奮和致癇作用的離子型谷氨酸受體激動劑，作用于突觸后膜非NMDA受體，產(chǎn)生興奮性突觸后電位，導(dǎo)致癲癇發(fā)作。常見的給藥方式有系統(tǒng)給藥和局部給藥，均可造成CA3錐體細胞丟失，齒狀回顆粒細胞層的增大，GABA能中間神經(jīng)元的丟失。系統(tǒng)給藥無需進行手術(shù)操作，消除術(shù)后并發(fā)癥的影響。然而，無法控制大腦中KA的生物利用度，SE之前需多次全身注射，容易產(chǎn)生偏差，而且，系統(tǒng)給藥無法避免海馬外區(qū)域的損傷。局部給藥的則可避免海馬外區(qū)域的改變帶來的影響，但需進行腦部手術(shù)，且需間隔1 h多次持續(xù)3 h以上注射才可誘發(fā)自發(fā)性癲癇，操作復(fù)雜。局部給藥可用于研究腦電中的癲癇樣活動以及癲癇發(fā)作對周圍健康組織的影響，而全身給藥可用于研究不同腦區(qū)對藥物的選擇性差異[3]。

1.1.3 毛果蕓香堿動物模型 毛果蕓香堿是一種膽堿能受體激動劑，具有很強的神經(jīng)興奮作用。給藥方式分為局部給藥和系統(tǒng)給藥，可造成海馬中間神經(jīng)元受損（CA1/CA3層錐體），神經(jīng)膠質(zhì)增生等[4]。該模型的腦電圖特征和神經(jīng)病理學(xué)改變類似于KA動物模型，但毛果蕓香堿系統(tǒng)給藥誘發(fā)持續(xù)性癲癇發(fā)作的成功率高。然而，系統(tǒng)給藥受損范圍廣，且藥物致癇量與致死量較為接近，因此需嚴格控制劑量。

1.2 高熱驚厥癲癇動物模型高熱驚厥是癥狀性癲癇的一個危險因素，發(fā)熱性癲癇持續(xù)狀態(tài)或長期高熱驚厥可能導(dǎo)致顳葉癲癇。采用增加實驗動物大腦溫度的方法可誘發(fā)驚厥，長期的高熱驚厥實驗導(dǎo)致了短暫的神經(jīng)元損傷。損傷的神經(jīng)元位于顳葉內(nèi)側(cè)硬化患者細胞損失和膠質(zhì)細胞增生的位置。研究顯示：HCN通道和大麻素受體參與致癇[5]，然而驚厥是否直接由發(fā)熱所導(dǎo)致以及確切的發(fā)病機制目前尚不清楚。

1.3 微生物感染

1.3.1 小鼠腦脊髓炎病毒癲癇模型 Theiler小鼠腦脊髓炎病毒（Theiler's mouse encephalomyelitis，TMEV）是一種天然存在的小鼠腸道病原體，可用于制作一種病毒誘發(fā)的癲癇小鼠模型。腦室內(nèi)注射TMEV的DA菌株感染C57BL/6J小鼠可誘發(fā)急性行為性癲癇發(fā)作[6]，造成海馬CA1至CA2錐體神經(jīng)元的大量損失，小膠質(zhì)細胞被激活和星形膠質(zhì)細胞增生，其特征類似于顳葉癲癇。

1.3.2 破傷風(fēng)毒素癲癇模型 破傷風(fēng)毒素是一種由破傷風(fēng)梭菌產(chǎn)生的強神經(jīng)毒素，可抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。立體定向接種破傷風(fēng)毒素已被用于制作顳葉內(nèi)側(cè)癲癇（mesial temporal lobe epilepsy,MTLE）模型。在幼年大鼠中，在穿刺路徑刺激后，齒狀顆粒細胞過濾并阻止任何癲癇發(fā)作在顳葉內(nèi)的擴布。 破傷風(fēng)毒素阻斷GABAB受體，并降低齒狀顆粒細胞阻斷癲癇發(fā)作擴散的能力[7]。然而，由此產(chǎn)生的癲癇發(fā)作是微弱而短暫的，并且病變與持續(xù)性癲癇發(fā)作模型或人類MTLE患者的癲癇發(fā)作不同。盡管如此，該模型仍有助于研究GABAB受體在癲癇發(fā)生中的作用。

1.4 神經(jīng)損傷癲癇模型創(chuàng)傷性腦損傷伴有海馬體積減少，是人類顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy,TLE）最常見的原因之一?，F(xiàn)有的創(chuàng)傷后癲癇動物模型中已經(jīng)部分具備創(chuàng)傷相關(guān)MTLE的基本特征。與MTLE不同，創(chuàng)傷后癲癇模型中的癲癇發(fā)作起源于額、頂葉皮層并且進展至內(nèi)側(cè)顳葉皮層。液體沖擊損傷大鼠模型癲癇發(fā)作起源于損傷部位的新皮質(zhì)，逐漸惡化，并擴布至新皮質(zhì)其他部分。創(chuàng)傷后1周，齒狀神經(jīng)元數(shù)量明顯減少而沒有CA神經(jīng)元異常[8]；2至4周，同側(cè)丘腦存在顯著的神經(jīng)元丟失、鈣化，CA1和CA3中出現(xiàn)錐體神經(jīng)元，同側(cè)顳葉皮質(zhì)中膠質(zhì)增生。由于癲癇起源的差異，發(fā)展不一致，神經(jīng)創(chuàng)傷動物模型應(yīng)用范圍有限。

1.5 血腦屏障受損圍產(chǎn)期缺血卻氧性腦病 （hypoxie-ischemic encephalopathy,HI）與兒童早期或晚期癲癇風(fēng)險增加有關(guān)，然而，利用腦缺血缺氧制作的動物模型在產(chǎn)生自發(fā)性、運動性癲癇發(fā)作與組織病理學(xué)損傷不一致。在海馬的CA1至CA4區(qū)域，丘腦背側(cè)和丘腦的網(wǎng)狀核，紋狀體，內(nèi)側(cè)韁核和嗅結(jié)節(jié)中觀察到神經(jīng)元壞死，在齒狀回的內(nèi)分子層中觀察到增加的Timm染色（苔蘚纖維發(fā)芽的證據(jù)）[9]。易誘導(dǎo)是圍產(chǎn)期HI模型的優(yōu)點，然而，高死亡率與有限的自發(fā)性癲癇發(fā)作降低了該模型的應(yīng)用范圍。

2 常見顳葉癲癇動物模型特點

顳葉癲癇動物模型種類較多，不同模型具有不同的研究目的，在選擇的時候需具體考慮模型的特點，如動物種類，導(dǎo)致癲癇的可能機制與不足等（表1）。但是，對于顳葉癲癇的機制研究，進展有限，本文結(jié)合經(jīng)典的谷氨酸（Glu）/γ-氨基丁酸（GABA）調(diào)節(jié)及 mTOR 通路抑制重點介紹相關(guān)動物模型的特點。

2.1 Glu/GABA調(diào)節(jié)興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)失衡是導(dǎo)致后通路癇性發(fā)放的原因之一，GABA屬于抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，分布于丘腦、基底節(jié)、海馬、小腦等部位，大腦中約40%突觸是GABA能。GABA受體與海馬后放電關(guān)系密切，尤其是對海馬CAl區(qū)齒狀回細胞能產(chǎn)生后放電，從而產(chǎn)生抑制作用。GABA受體激活還可以降低海馬苔蘚纖維活性。

G1u是重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布于大腦皮層、小腦、基底節(jié)等部位，其含量遠遠超過GABA。Glu是GABA合成的前體物質(zhì)，腦內(nèi)Glu大部分為中間代謝產(chǎn)物，僅有小部分為中樞性遞質(zhì)。癲癇發(fā)作早期，Glu的大量釋放導(dǎo)致腦內(nèi)海馬等部位NOS異常增高，引起NO水平上調(diào)，加重癲癇發(fā)作。這種惡性循環(huán)導(dǎo)致腦內(nèi)特定部位內(nèi)源性NO及其前體消耗殆盡，并由此引起發(fā)作后短期認知功能障礙。

近年，有關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)新轉(zhuǎn)運體及受體的發(fā)現(xiàn)，為在細胞水平深入研究神經(jīng)遞質(zhì)的攝取、轉(zhuǎn)運、定位、循環(huán)等奠定了重要基礎(chǔ)[10]。

2.2 mTOR通路抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mam maliantarget of rapamycin,mTOR）是一種進化上相對保守的非典型絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，由mTORC1和mTORC2兩種蛋白質(zhì)復(fù)合體組成，主要參與細胞生長、分化增殖和維持代謝穩(wěn)態(tài)，以及參與如神經(jīng)細胞死亡、星形膠質(zhì)細胞增生，突觸可塑性改變等癲癇相關(guān)病理改變。

研究表明哺乳動物mTOR信號通路與癲癇的發(fā)生發(fā)展有著重要聯(lián)系，在多種類型癲癇及動物模型中mTOR通路異常激活。在動物模型中予以其抑制劑雷帕霉素干預(yù),不僅可控制癲癇癥狀，還可改善癲癇的分子病理如神經(jīng)細胞死亡、星形膠質(zhì)細胞增生、苔蘚樣纖維出芽等。mTOR信號通路的異常激活已被認為是癲癇發(fā)生發(fā)展的潛在機制，抑制mTOR信號通路將是治療癲癇的潛在靶

點[11]。

綜上所述，盡管多種物質(zhì)都可以一定程度上制作不同類型的顳葉癲癇動物模型，但較理想的主要是KA和毛果蕓香堿動物模型。主要由于二者具備以下特點：形成以海馬為起源的癇樣放電；出現(xiàn)以海馬、顳葉損傷為特征的改變；在SE之后出現(xiàn)慢性反復(fù)、自發(fā)發(fā)作；存在以海馬損害為主的神經(jīng)元變性、膠質(zhì)細胞增生及苔蘚纖維出芽，與人類顳葉癲癇特征相似。一方面，KA和毛果蕓香堿動物模型可用于探究MTLE的細胞和分子機制，闡明TLE的發(fā)病機制和病程；另一方面，KA和毛果蕓香堿動物模型可用于證明某種物質(zhì)是否有保護癲癇損傷的區(qū)域、減少氧化應(yīng)激、減弱神經(jīng)退行性變化的作用，以降低發(fā)作頻率，增加潛伏期時長來控制癲癇發(fā)作運動。研究表明，調(diào)節(jié)Glu/GABA平衡和抑制mTOR通路是抗癲癇物質(zhì)的主要機制。多數(shù)抗癲癇藥物通過阻斷或激活某一通路，從而調(diào)節(jié)細胞因子生成或細胞的生長、發(fā)育及凋亡，部分抗癲藥物通過直接作用于神經(jīng)元或小膠質(zhì)細胞，影響癲癇的發(fā)展。以上基于動物癲癇模型的研究提示，不同物質(zhì)抗癲癇作用的潛力。然而，絕大多數(shù)研究無法闡明其分子機制，需做進一步探究。

表1顳葉癲癇動物模型的特點