絲素蛋白/羥基磷灰石/聚多巴胺/BMP-2多孔支架的構(gòu)建及促進(jìn)BMSCs成骨分化的研究

劉 勇，張?jiān)茟c，鄔丹蓮

絲素蛋白（silk fibroin，SF）復(fù)合羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）多孔支架具有良好的生物學(xué)相容性、力學(xué)性能和骨傳導(dǎo)能力，但骨誘導(dǎo)能力不足[1]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2是目前已知最強(qiáng)的成骨活性因子之一，能夠顯著提高材料的成骨能力[2]，但制備BMP-2復(fù)合材料時(shí)傳統(tǒng)物理吸附或包裹方法存在結(jié)合率低、易早期爆釋的現(xiàn)象，難以滿(mǎn)足骨形成過(guò)程中的持續(xù)需求[3-4]。近年來(lái)有學(xué)者在材料表面構(gòu)建聚多巴胺（poly dopamine，PDA）涂層，不僅提高了材料的生物相容性，還能高效結(jié)合并緩釋生長(zhǎng)因子，為制備具有生物活性的組織工程骨提供了途徑[5]。本研究采用冷凍干燥法制備SF/HA 多孔支架，在其表面形成PDA 涂層，然后接枝BMP-2，構(gòu)建類(lèi)似天然骨成分、結(jié)構(gòu)和生理功能的SF/HA/PDA/BMP-2 支架，評(píng)估支架的表面特征、理化性質(zhì)及其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）體外成骨分化能力的影響，探討支架在組織工程骨領(lǐng)域應(yīng)用的可行性，為臨床新型人工骨修復(fù)骨缺損的研發(fā)提供可供選擇的支架材料。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

BMP-2（上海瑞邦生物科技有限公司），生蠶絲（江蘇如東新絲路有限公司），HA、無(wú)水LiBr、無(wú)水Na2CO3（上海阿拉丁試劑有限公司），透析袋、聚乙二醇（上海Biosharp 有限公司），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色試劑盒（上海Yeasen有限公司）。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco 公司，美國(guó)），CCK-8 試劑盒（Dojindo 同仁化學(xué)公司，日本），成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、BMSCs、茜素紅染液、細(xì)胞熒光染液熒光素雙醋酸脂（fluorescein diacetate，F(xiàn)DA）和 碘 化 吡 啶（propidium iodide，PI）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

主要儀器包括水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo 公司，美國(guó)），臨界點(diǎn)干燥儀（Leica 公司，德國(guó)），掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM，Hitach 公司，日本），水接觸角測(cè)量?jī)x（Data Physics 公司，德國(guó)），酶標(biāo)儀器（Bio-Red公司，美國(guó)），共聚焦顯微鏡（Leica公司，德國(guó)）。

1.2 支架制備方法

1.2.1 SF 溶液制備 取適量生蠶絲置于0.02 mol/L Na2CO3中脫膠，烘干后放入9.3 mol/L LiBr 溶液中，攪拌至完全溶解，經(jīng)透析、濃縮后得到質(zhì)量濃度6%的SF溶液，將其置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SF/HA 混懸溶液制備 將2 g HA 粉末加入10 mL PBS（0.001 M，pH=6.8）溶液中，采用超聲震蕩法制備HA 混懸液，質(zhì)量濃度為20%（W/V）。按照質(zhì)量比（1∶4）將SF 溶液與HA 混懸液混合，超聲震蕩3 min，制成均勻的SF/HA混合溶液。

1.2.3 SF/HA/PDA/BMP-2 支架制備及分組 取100 μL 適量SF/HA 混合液加入模具中，迅速置于液氮中冷凍，凍干過(guò)夜，甲醇浸泡30 min，再次凍干后制得SF/HA 多孔支架。將SF/HA 支架置入PDA 溶液中（2 mg/mL，pH=8.5），慢速（50 r/min）震蕩4 h，雙蒸水洗3 次，制得SF/HA/PDA 支架。將制得的SF/HA/PDA 支架置入BMP-2 溶液中（2 mg/mL，pH=8.5），慢速（50 r/min）震蕩4 h，雙蒸水洗3 次，最后制得SF/HA/PDA/BMP-2 支架。將制備好的支架分為SF/HA 支架組、SF/HA/PDA支架組和SF/HA/PDA/BMP-2支架組，以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 SF/HA/PDA/BMP-2 支 架 上BMP-2 釋 放 量 的檢測(cè)

采用ELASA法檢測(cè)SF/HA/PDA/BMP-2支架制成后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、28 d 的BMP-2累積釋放量。

1.4 支架表征和理化性質(zhì)

應(yīng)用水接觸角測(cè)量?jī)x檢測(cè)各組支架表面親水性變化，應(yīng)用SEM觀察支架表面形態(tài)。

1.5 BMSCs增殖檢測(cè)

分別在3 組支架上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將各組支架裁剪合適后鋪于96孔板底部，胎牛血清培養(yǎng)基浸泡過(guò)夜，PBS 清洗2 次，每個(gè)支架加入含有1 ×104個(gè)BMSCs 的細(xì)胞培養(yǎng)基200 μL，置入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于1、4、7 d 加入20 μL CCK-8 試劑，培養(yǎng)2 h，取100 μL 溶液移入新的96孔板中，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm吸光度。

細(xì)胞SEM 成像：細(xì)胞培養(yǎng)7 d，去除培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定1 h，乙醇梯度脫水，臨界點(diǎn)干燥后噴金處理，SEM觀察細(xì)胞形態(tài)。

細(xì)胞熒光染色：細(xì)胞培養(yǎng)7 d，取出上清液，PBS清洗2次，每孔分別加入100 μL FDA（5 μg/mL）和100 μL P（I5 μg/ mL），于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 min，PBS清洗，在共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.6 BMSCs成骨分化能力檢測(cè)

1.6.1 ALP活性檢測(cè) 細(xì)胞與3組支架共培養(yǎng)，14 d去除培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加入Triton X-100細(xì)胞裂解液，向細(xì)胞裂解液中加入ALP 染色試劑盒中的pNPP底物，在405 nm處檢測(cè)吸光度值。

1.6.2 茜素紅染色光鏡觀察 細(xì)胞與3 組支架共培養(yǎng)，方法同1.6.1。培養(yǎng)14 d 去除培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗2次，再加入2%茜素紅染液，室溫下染色20 min，去除染液，PBS 清洗2次，光鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 支架表面特征、理化性質(zhì)比較

SF/HA 支架、SF/HA/PDA 支架、SF/HA/PDA/BMP-2 支架接觸角分別為（54.7 ± 4.8）°、（43.7 ±3.7）°、（32.3 ± 2.4）°，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=180.526，P=0.001），提示在PDA 涂層及接枝BMP-2 后，支架的親水性逐漸增加（圖1）。SEM圖像可見(jiàn)SF/HA 支架表面相對(duì)光滑，SF/HA/PDA支架表面有顆粒物形成，SF/HA/PDA/BMP-2支架表面顆粒物明顯增多，說(shuō)明PDA 增加了支架表面的粗糙度，而接枝BMP-2后，支架表面的粗糙度進(jìn)一步增加（圖2）。

圖1 水接觸角測(cè)量?jī)x檢測(cè)3組支架親水性1A SF/HA支架1B SF/HA/PDA支架1C SF/HA/PDA/BMP-2支架

圖2 3 組支架掃描電鏡成像2A，2B SF/HA 支架2C，2D SF/HA/PDA 支架2E，2F SF/HA/PDA/BMP-2支架

2.2 SF/HA/PDA/BMP-2支架BMP-2釋放情況

ELASA 法檢測(cè)結(jié)果顯示支架上BMP-2 制備后在1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、28 d 累計(jì)釋放量分別為4.8%、9.2%、13.5%、18.4%、25.7%、31.6%、38.7%，呈緩慢持續(xù)釋放趨勢(shì)（圖3）。

圖3 ELASA 法檢測(cè)SF/HA/PDA/BMP-2 支架上BMP-2 累積釋放量

2.3 支架上BMSCs增殖和成骨能力檢測(cè)結(jié)果比較

2.3.1 BMSCs 增殖能力 電鏡和熒光染色結(jié)果顯示，SF/HA 支架上細(xì)胞數(shù)量稀少，形態(tài)呈多角形；PDA涂層后細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞鋪展良好；進(jìn)一步接枝BMP-2 后細(xì)胞數(shù)量明顯增多，局部呈片狀生長(zhǎng)，細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)能力更好（圖4）。

圖4 3組支架上細(xì)胞熒光染色及掃描電鏡成像4A，4B SF/HA支架4C，4D SF/HA/PDA支架4E，4F SF/HA/PDA/BMP-2支架

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示3組支架上BMSCs隨時(shí)間推移均呈增殖趨勢(shì)，其在SF/HA/PDA/BMP-2支架上的增殖能力優(yōu)于SF/HA/PDA 支架和SF/HA支架，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.637，P= 0.002，圖5）。

圖5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞在3組支架上的增殖能力

2.3.2 BMSCs 成骨能力 與細(xì)胞共培養(yǎng)2 周后，檢測(cè)3 組支架上BMSCs 的ALP 活性，結(jié)果顯示SF/HA 支架、SF/HA/PDA 支架、SF/HA/PDA/BMP-2支架ALP水平分別為（2.9±0.4）、（3.4±0.7）、（6.8±0.8）U/mg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=232.215，P=0.001）。茜素紅染色結(jié)果顯示SF/HA 支架呈淺色紅染，SF/HA/PDA 支架呈紅色染色，SF/HA/PDA/BMP-2支架呈深色紅染（圖6）。

圖6 3組支架茜素紅染色6A SF/HA支架6B SF/HA/PDA支架6C SF/HA/PDA/BMP-2支架（×10）

3 討論

3.1 SF/HA多孔支架在骨修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用

近年來(lái)陸續(xù)有研究以SF和HA為原料制成具有良好孔隙率和一定力學(xué)強(qiáng)度的復(fù)合支架，結(jié)構(gòu)上與天然骨組織相類(lèi)似[6-7]。由于生物學(xué)相容性良好，力學(xué)性能優(yōu)異，SF/HA多孔支架在骨組織工程領(lǐng)域有著較大的應(yīng)用潛力。Kweon 等[8]將SF/HA作為假體涂層植入兔脛骨內(nèi)，結(jié)果顯示涂層后假體具有促進(jìn)骨再生的作用。SF/HA支架還可作為藥物載體，負(fù)載并緩慢釋放BMP-2，體外研究證實(shí)其可促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，植入大鼠體內(nèi)后能加速大鼠顱骨缺損區(qū)的修復(fù)[9]；SF/HA 支架還可通過(guò)負(fù)載BMSCs，促進(jìn)兔橈骨缺損處的骨再生[10]。盡管目前基于SF/HA的骨組織工程支架材料尚處于基礎(chǔ)研究階段，但未來(lái)在骨科臨床有著廣闊的應(yīng)用前景。

3.2 PDA涂層在SF/HA支架中的應(yīng)用

單純SF/HA 材料缺乏生物活性因子，導(dǎo)致其誘導(dǎo)成骨能力弱，在骨修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制。為提高其與生物活性因子的結(jié)合率，有學(xué)者通過(guò)PDA 涂層方法將生物活性因子接枝在高分子材料表面，明顯提高了表面親水性和粗糙度，生物學(xué)相容性得到改善[11]；體內(nèi)外研究結(jié)果亦證實(shí)該方法能有效促進(jìn)細(xì)胞黏附和增殖[12-13]，明顯增強(qiáng)材料的成骨能力[14-15]。本研究結(jié)果表明，PDA涂層支架表面水接觸角較單純SF/HA 支架明顯增加，顆粒物逐漸增多，PDA 涂層支架上細(xì)胞的黏附和增殖能力均優(yōu)于單純SF/HA 支架，與現(xiàn)有研究結(jié)果相似[16]。

3.3 SF/HA/PDA/BMP-2支架促進(jìn)細(xì)胞增殖及成骨分化的作用

BMP-2 屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族成員，是一種疏水性酸性蛋白，具有強(qiáng)大的促成骨活性，能夠誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，在骨組織再生和修復(fù)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[17]。有研究者以SF/HA支架物理包裹BMP-2，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該支架能夠促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化[18]。也有學(xué)者通過(guò)物理混合法制備殼聚糖/磷酸鈣/BMP-2復(fù)合支架，結(jié)果表明支架能夠促進(jìn)兔脛骨缺損區(qū)的骨修復(fù)過(guò)程[19]。

盡管具有良好的骨再生作用，這些復(fù)合支架目前仍存在BMP-2 早期突釋現(xiàn)象，難以滿(mǎn)足骨骼再生過(guò)程中對(duì)BMP-2的持續(xù)需求[20]。本研究中采用PDA涂層方法接枝BMP-2，經(jīng)過(guò)4周觀察，支架上BMP-2 呈緩慢釋放趨勢(shì)，符合骨組織工程載藥支架的需要。此外，本研究結(jié)果顯示，SF/HA/PDA/BMP-2 支架上BMSCs 的黏附能力和增殖能力最佳，ALP活性及茜素紅染色均優(yōu)于其它兩組，提示該支架上釋放的BMP-2促進(jìn)了細(xì)胞的黏附增殖和成骨分化。

相對(duì)于鈦合金及天然高分子聚合物材料[21-22]，SF/HA多孔支架具有與天然骨組織類(lèi)似的成分和結(jié)構(gòu)，通過(guò)PDA涂層可進(jìn)一步提高SF/HA支架的生物學(xué)相容性，有效接枝并緩釋BMP-2 后可發(fā)揮其骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)作用?？傊?，本研究構(gòu)建的SF/HA/PDA/BMP-2多孔支架具有良好的生物學(xué)相容性和成骨活性，在骨組織工程領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。