代謝組學(xué)技術(shù)在肺癌早期診斷方面的研究進(jìn)展

李 鑫，王 猛

(天津市胸科醫(yī)院胸外科，天津 300350)

肺癌是起源于呼吸道上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，根據(jù)美國(guó)癌癥研究協(xié)會(huì)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示， 2017年全球預(yù)計(jì)新增癌癥病例16.8萬，癌癥死亡60萬例，其中肺癌死亡人數(shù)占全部癌癥死亡總數(shù)的12%左右[1]。由于肺癌早期無特異性癥狀，患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，影響療效和預(yù)后[2]。為提高肺癌的早期診斷率，增加患者生存率，迫切需要探尋一種高敏感性、高特異性、低創(chuàng)傷性的肺癌診斷方法[3-4]。代謝組學(xué)又稱代謝輪廓分析，通過對(duì)各種生物樣品中小分子化合物(分子量<1 000)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量測(cè)量和定性分析，監(jiān)測(cè)不同代謝物的水平及變化，全面了解不同生物系統(tǒng)復(fù)雜的生理和病理狀態(tài)[5]。由于代謝標(biāo)志物能夠敏感地反映機(jī)體的不同生理病理狀態(tài)，因此可通過分析肺癌患者與健康人的代謝輪廓得到肺癌特異性代謝產(chǎn)物，分析這些代謝產(chǎn)物在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中涉及的代謝通路有助于肺癌的早期診斷。雖然代謝組學(xué)已廣泛應(yīng)用于各種惡性腫瘤的代謝組特征研究[6-8]、生物標(biāo)志物的挖掘以及診斷模型的建立[9]，但將研究結(jié)論應(yīng)用于臨床上肺癌的早期診斷還存在很多問題?，F(xiàn)就代謝組學(xué)技術(shù)在肺癌早期診斷中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為尋找肺癌早期生物標(biāo)志物和進(jìn)行病因研究提供依據(jù)。

1 代謝組學(xué)技術(shù)

基因組學(xué)是從分子生物學(xué)水平研究疾病狀態(tài)下基因的排列、順序、數(shù)量等變化找出與疾病可能相關(guān)的基因。蛋白質(zhì)組學(xué)則是從蛋白質(zhì)水平研究疾病狀態(tài)下蛋白質(zhì)水平、含量的變化，找出與正常生理狀態(tài)下相比表達(dá)有差異的蛋白質(zhì)，作為潛在的生物標(biāo)志物應(yīng)用于疾病的診斷、治療和預(yù)后。與基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)不同，代謝組學(xué)的研究對(duì)象是內(nèi)源性代謝物質(zhì)(中間或代謝終產(chǎn)物)，通過分析這些代謝物質(zhì)在體液及組織內(nèi)的變化規(guī)律，可以從生物整體分析基因表達(dá)，蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)等內(nèi)外因素對(duì)機(jī)體狀態(tài)的影響[10]，機(jī)體內(nèi)任何生理、病理或其他因素的變化都會(huì)影響代謝物的濃度或使代謝流發(fā)生改變[11]，因此代謝組學(xué)技術(shù)能更真實(shí)地反映機(jī)體的實(shí)際情況。目前主要的技術(shù)包括核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)技術(shù)、液相色譜-質(zhì)譜法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)技術(shù)等。NMR是第一個(gè)用于全面測(cè)量生物樣品中代謝物的分析平臺(tái)。這種技術(shù)具有許多優(yōu)勢(shì)：①無損傷性；②可進(jìn)行生理?xiàng)l件或模擬機(jī)體生理?xiàng)l件的體外實(shí)驗(yàn)；③與特定干預(yù)手段相結(jié)合，研究不同動(dòng)態(tài)系統(tǒng)中機(jī)體的化學(xué)交換、運(yùn)動(dòng)等代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律；④實(shí)驗(yàn)方法靈活，而且需要的樣本量較小[12]，被認(rèn)為是代謝物結(jié)構(gòu)分析的金標(biāo)準(zhǔn)[13]。目前，基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)已成功應(yīng)用于尋找各種癌癥的生物標(biāo)志物，包括前列腺癌、胃癌、腎癌、宮頸癌、口腔黏膜鱗狀細(xì)胞癌和其他癌癥[14-17]。另外，一些研究結(jié)果顯示了NMR在不同癌癥患病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)[18-19]、早期診斷[20]和分期[17,21]等方面的應(yīng)用。NMR的主要缺點(diǎn)是其化學(xué)位移有限，導(dǎo)出的圖譜中可能出現(xiàn)數(shù)百種化合物的峰，這些峰在圖譜中相互重疊、干擾，導(dǎo)致圖譜解析困難，因此NMR相對(duì)于LC-MS敏感性相對(duì)較低[22]?；贚C-MS的代謝組學(xué)技術(shù)具有較高的敏感性和特異性，能夠?qū)Υx物進(jìn)行定量分析，鑒別代謝物的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)。但LC-MS也具有局限性，并不是對(duì)所有的化合物都敏感。由于LC-MS技術(shù)沒有商業(yè)化的圖譜庫可以對(duì)比查詢，需要研究者建立圖庫或分析圖譜。為解決這一問題，氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)、LC-MS等高敏感性和高分辨率的分析技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于不同腫瘤的代謝組學(xué)分析研究。

2 代謝組學(xué)技術(shù)與肺癌診斷

不同癌癥患者的癌細(xì)胞和組織基因組存在某些差異。由于癌細(xì)胞的異質(zhì)性，許多基因和蛋白質(zhì)診斷標(biāo)志物的敏感性和特異性都大大降低，這些基因和蛋白質(zhì)的標(biāo)志物可能在一些患者中能有效識(shí)別腫瘤，而在另一些患者中無效[23]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程涉及機(jī)體的多個(gè)系統(tǒng)，代謝組學(xué)通過定性和定量的分析腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的所有代謝產(chǎn)物，多角度地尋找肺癌的標(biāo)志物，識(shí)別未知代謝產(chǎn)物，可以全面地反映機(jī)體的狀態(tài)[24]。雖然目前代謝組學(xué)在許多方面還不成熟，對(duì)肺癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制、代謝特征等認(rèn)識(shí)不夠全面，但隨著研究目標(biāo)的確定、研究方法的不斷完善和更新，代謝組學(xué)在肺癌的早期診斷方面得到很大發(fā)展。

2.1 呼氣代謝組學(xué) 揮發(fā)性有機(jī)化合物(volatile organic compounds,VOCs)是常溫下以蒸汽形式存在于空氣中的一類有機(jī)物的總稱[25]。血液中經(jīng)肺代謝后排出的產(chǎn)物稱為內(nèi)源性VOCs，而人體暴露于環(huán)境中，直接吸入肺部后呼出的稱為外源性VOCs[26]。內(nèi)源性VOCs是人體內(nèi)新陳代謝的產(chǎn)物，其濃度和成分的改變與人體的健康或疾病相關(guān)[27]。Pauling等[28]首次采用氣相色譜儀對(duì)人體呼出氣成分進(jìn)行研究，并統(tǒng)計(jì)了200多種VOCs，發(fā)現(xiàn)其中一些VOCs與不同病理狀態(tài)存在相關(guān)性。Phillips等[29]采集肺癌患者和健康人的呼出氣樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)22種VOCs可以作為肺癌的生物標(biāo)志物。O′Neill等[30]采集肺癌患者和健康人的呼氣樣本利用GC-MS進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)28種以烷烴和苯的衍生物為代表的VOCs作為肺癌疑似生物標(biāo)志物。Corradi等[31]采用固相微萃取法對(duì)肺癌患者、吸煙者、不吸煙者及健康人呼出氣進(jìn)行采樣，進(jìn)行GC-MS分析發(fā)現(xiàn)與吸煙者和非吸煙者相比，非小細(xì)胞肺癌患者呼出的空氣中戊烷、2-甲基戊烷、2,4-二甲基庚烷的含量更高；與肺癌組、不吸煙組及健康人組相比，吸煙者BTEX(苯、甲苯、乙苯和二甲苯)濃度較高，這些差異可以用來鑒別各種肺部疾病的特征指紋。Deng等[32]和Phillips等[33]對(duì)肺癌患者的呼氣用GC-MS技術(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)與健康人相比，肺癌患者的呼氣中還有己醛和庚醛。Gaspar等[34]應(yīng)用固相微萃取氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)肺癌患者和健康人的呼氣代謝物組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)C14～C24直鏈和支鏈烷烴與肺癌相關(guān)性較強(qiáng)，能較靈敏地將化療肺癌患者與未治療的肺癌患者和健康人區(qū)分開。Bajtarevic等[35]用固相微萃取法和質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜技術(shù)分析肺癌患者和健康人呼氣中的VOCs，確定醇、醛、酮、烴為肺癌潛在的標(biāo)志物。Fuchs等[36]用頂空固相微萃取在線衍生化GC-MS對(duì)肺癌患者、吸煙者和健康人呼出氣中的C1～C10醛類有機(jī)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)戊醛、己醛、辛醛和壬醛在肺癌患者呼氣中的濃度更高。胡燕婕[37]對(duì)肺癌患者、良性腫瘤患者和健康人呼氣中的VOCs進(jìn)行了系統(tǒng)分析，確定了29種特征性VOCs，以長(zhǎng)鏈烷烴類及甲基化衍生物，醛、酮、醇等含氧有機(jī)物等為主。這些研究利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)人體不同生理病理狀態(tài)下VOCs的成分進(jìn)行檢測(cè)分析，得到了可用于肺癌早期鑒別診斷的可能代謝標(biāo)志物，認(rèn)可了VOCs在肺癌早期診斷方面的應(yīng)用價(jià)值。但是由于缺乏統(tǒng)一的采樣標(biāo)準(zhǔn)和樣本儲(chǔ)存方法等，目前尚無商業(yè)化產(chǎn)物應(yīng)用于臨床。

2.2 血液代謝組學(xué) 在代謝組學(xué)研究中，血液標(biāo)本因其低成本、采集方便的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)而應(yīng)用廣泛。Hori等[38]用GC-MS技術(shù)對(duì)29例健康人、33例早期和晚期肺癌患者的血清樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)23種代謝物的水平在肺癌組和健康組有顯著差異，不同病理分型(小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌)和不同病程(早期、晚期)的肺癌患者血清中代謝物水平和濃度具有特征性的變化。牛艷潔等[39]采用GC-MS技術(shù)對(duì)肺癌患者和其他肺部感染患者的血清小分子代謝物質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了13種差異代謝物。Miyamots等[40]用氣相色譜-飛行質(zhì)譜技術(shù)分析了非小細(xì)胞肺癌和其他肺癌患者的血液樣本，發(fā)現(xiàn)甘油、乙醇胺、麥芽糖、棕櫚酸、谷氨酸和乳酸的濃度在非小細(xì)胞肺癌患者中明顯升高，而色氨酸、組氨酸和賴氨酸的濃度明顯降低。Chen等[41]運(yùn)用液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)和GC-MS技術(shù)結(jié)合的方法對(duì)健康人和肺癌患者的血清進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，α-羥基異丁酸的含量在肺癌患者中升高，而硫酸普拉睪酮和2，3，4-三乙基丁酸的含量降低。Musharraf等[42]采用GC-MS技術(shù)對(duì)肺癌患者、慢性阻塞性肺疾病患者、健康吸煙者和健康不吸煙者的血漿進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，肺癌患者血漿中脂肪酸、葡萄糖和酸的水平較其他組均升高。田舍等[43]利用核磁共振氫譜檢測(cè)肺癌和正常體健者血清中小分子代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清丙氨酸、谷氨酸鹽、丙三醇、蘇氨酸以及異亮氨基酸可能成為原發(fā)性肺癌的診斷標(biāo)志物。腫瘤在肺部的生長(zhǎng)過程中攝取了血清中大量的能量，機(jī)體通過增加有氧氧化途徑中“原材料”來保證其他器官的正常能量代謝，出現(xiàn)糖代謝增強(qiáng)和脂肪代謝的減弱，一些氨基酸代謝相關(guān)的酶的代謝狀態(tài)也發(fā)生改變，導(dǎo)致氨基酸異常表達(dá)。上述研究通過不同的代謝組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了不同的潛在肺癌診斷標(biāo)志物，通過對(duì)相應(yīng)物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的代謝通路研究，可對(duì)肺癌在早期做出診斷和治療，延長(zhǎng)患者的生存期。

2.3 組織代謝組學(xué) 由于不同個(gè)體之間差異較大，不同病理類型的肺癌對(duì)血液中代謝物濃度的影響也較大，與血液標(biāo)本相比，組織標(biāo)本受外界因素影響較小，組織代謝物代表的是不同組織和器官的總變化水平。隨著生物科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，利用代謝組學(xué)技術(shù)從組織樣本中篩選腫瘤潛在生物標(biāo)志物已經(jīng)取得快速發(fā)展。Wu等[44]對(duì)肺癌組織和正常肺組織中的代謝產(chǎn)物采用LC-MS技術(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)279肽和90肽為可能的肺癌生物標(biāo)志物，并最終驗(yàn)證了一個(gè)12肽的標(biāo)志物。與正常組織相比，該標(biāo)志物在肺癌組織中的豐度更高。Jordan等[45]對(duì)肺癌患者和健康人的肺組織進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織中乳酸、磷酸膽堿和甘油磷酸膽堿的濃度升高，葡萄糖、肌醇和乙酸的濃度下降。陳文學(xué)等[46]以肺癌患者不同部位(腫瘤邊緣、腫瘤中心和腫瘤實(shí)質(zhì))的組織萃取液進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與鄰近非侵入肺組織相比，肺癌組織中乳酸含量顯著升高，而肌醇、谷氨酰胺和纈氨酸的含量顯著下降。Rocha等[47]用NMR技術(shù)對(duì)鱗癌和腺癌患者的癌組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)?；撬?、尿苷核苷酸水平在腺癌組織中顯著升高，而肌酸、谷胱甘肽在鱗癌組織中顯著升高，這些差異代謝物對(duì)腺癌和鱗癌的區(qū)分度可達(dá)94%。Mathé等[48]采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)肺癌患者與健康者的癌組織及癌旁組織樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)肌酸核苷與N-乙酰神經(jīng)氨酸的濃度在癌組織中顯著增加，提示它們可用于肺癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)判。組織作為臨床上診斷肺癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于獲取較困難，不利于作為肺癌早期篩查手段進(jìn)行推廣，在后續(xù)的研究中可將其結(jié)果與其他樣本代謝組學(xué)結(jié)果結(jié)合，互相驗(yàn)證，探索敏感性高、特異性強(qiáng)的肺癌早期診斷生物標(biāo)志物。

2.4 尿液代謝組學(xué) 與其他標(biāo)本相比，尿液標(biāo)本具有獲得便捷、無創(chuàng)的特點(diǎn)，更易被大眾所接受。與血液標(biāo)本相同，尿液也包含許多因?yàn)榘l(fā)生肺癌而改變的代謝信息，另外，尿液經(jīng)過腎小球過濾后，可以使氨基酸、有機(jī)酸等成分得到濃縮，方便檢測(cè)，是代謝組學(xué)分析中最典型的生物樣本。牛艷潔等[39]用GC-MS技術(shù)對(duì)肺癌患者和其他肺部疾病患者的尿液小分子代謝物質(zhì)進(jìn)行代謝組學(xué)研究，確定了7種差異代謝物。許國(guó)旺等[49]對(duì)肺癌患者和健康人尿液中核苷酸含量進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，肺癌患者尿液中13種核苷酸明顯升高。王文昭等[50]對(duì)肺癌患者與健康者尿樣中修飾核苷代謝輪廓譜采用二維液相色譜在線分析系統(tǒng)結(jié)合最小二乘判別分析法進(jìn)行了分析，初步鑒定出具有顯著變化的修飾核苷。An等[51]采用大氣壓光離子化、大氣壓化學(xué)離子化和電噴霧離子化3種電離方式的“組合式”分析方法結(jié)合多變量生物信息學(xué)數(shù)據(jù)處理方法，對(duì)肺癌患者與健康人的尿液進(jìn)行代謝組學(xué)分析，鑒定出11個(gè)代謝物在肺癌患者尿液中濃度明顯增高。Yang等[52]對(duì)肺癌患者與健康志愿者的尿液進(jìn)行分析，在肺癌患者尿液中鑒定出11個(gè)以氨基酸及其代謝產(chǎn)物為主發(fā)生上調(diào)的代謝物結(jié)構(gòu)。Carrola等[53]采用核磁共振氫譜技術(shù)對(duì)肺癌患者與健康者尿液中的小分子化合物進(jìn)行了代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)馬尿酸鹽和葫蘆巴堿在肺癌患者尿液中含量顯著降低，而肌酐、ɑ-羥基異丁酸、β-羥基異戊酸、N-乙酰谷氨酷胺的含量顯著升高。

2.5 細(xì)胞代謝組學(xué) 由于血液和尿液等生物樣本容易受飲食、環(huán)境、年齡和其他疾病等因素干擾，而以腫瘤細(xì)胞為研究對(duì)象，通過研究不同細(xì)胞代謝物的差異表達(dá)尋找潛在的生物標(biāo)志物可以避免常規(guī)實(shí)驗(yàn)中其他因素的干擾。Filipiak等[54]用GC-MS技術(shù)對(duì)肺癌細(xì)胞株CALU-1(人肺癌細(xì)胞系)和空白組上空的空氣成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)4種代謝物濃度在肺癌細(xì)胞株組升高，而部分醛類濃度降低，采集肺癌細(xì)胞株NCI-H2087和A549的培養(yǎng)液上方空氣進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)醇和甲基化烷烴的濃度明顯升高，而醛類和丁基酯的濃度有所下降，證明肺癌細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中可能會(huì)產(chǎn)生某些特定的揮發(fā)性有機(jī)物，同時(shí)也可能會(huì)消耗某些特定的揮發(fā)性有機(jī)物[55-56]。余欣尉等[57]用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)分別對(duì)肺癌細(xì)胞與正常細(xì)胞產(chǎn)生的極性代謝物和非極性代謝物進(jìn)行了指紋圖譜分析，并采用生物信息學(xué)分析方法對(duì)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行多維的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞存在異常的蛋白質(zhì)、脂肪酸和磷脂代謝，并確定了31種對(duì)分類有貢獻(xiàn)的潛在小分子代謝標(biāo)志物，證明通過研究細(xì)胞代謝物的差異表達(dá)尋找肺癌特征標(biāo)志物是可行的、有前景的新手段，并可以與傳統(tǒng)以患者血液、尿液和組織為樣本的代謝組學(xué)研究相互佐證和補(bǔ)充，為研究肺癌的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防和治療提供新思路和新方法。

2.6 其他 除以上幾種常見的生物樣本外，其他生物樣本也被學(xué)者采集進(jìn)行研究。Wen等[58]采用LC-MS技術(shù)研究膽紅素水平與吸煙者肺癌的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膽紅素水平與男性吸煙者肺癌的發(fā)生率及病死率呈負(fù)相關(guān)，提示低水平的膽紅素可以作為男性吸煙者發(fā)生肺癌的潛在預(yù)警標(biāo)志物。Callejón-Leblic 等[59]收集肺癌患者與健康者的支氣管肺泡灌洗液，采用GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)分析結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，建立偏最小二乘判別分析模型，經(jīng)進(jìn)一步的代謝通路分析發(fā)現(xiàn)左旋肉堿、膽堿、磷酸、甘油、腺嘌呤5種代謝物在肺癌患者中存在差異。

3 小 結(jié)

肺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)漸進(jìn)的過程，隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展、肺癌基礎(chǔ)研究的不斷深入，更多的物質(zhì)將被揭示出與肺癌的診斷、治療和預(yù)后的關(guān)系，為肺癌的診斷與治療提供新的研究思路和方向。代謝組學(xué)作為一門新興的學(xué)科，在分子水平輔助診斷肺癌，未來作為新技術(shù)應(yīng)用于肺癌的診斷具有一定的應(yīng)用前景。代謝組學(xué)和其他組學(xué)相結(jié)合是目前多組學(xué)研究的趨勢(shì)，在科學(xué)技術(shù)的推動(dòng)下，通過整合代謝組學(xué)和其他組學(xué)(基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等)的數(shù)據(jù)和資源，建立完善可靠的肺癌生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)庫，有利于提升對(duì)肺癌系統(tǒng)生物學(xué)的認(rèn)識(shí)，從而能夠更全面和深刻地揭示肺癌生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。