微RNA在缺血性腦卒中的作用

汪普求,謝芬高，文航華，曹 俊，張希洲

(三峽大學(xué)人民醫(yī)院 宜昌市第一人民醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，湖北 宜昌 443000)

腦卒中是一種急性腦血管疾病，又名卒中、腦血管意外，由于腦部血管突然破裂或血管阻塞導(dǎo)致大腦嚴重缺血缺氧而引起腦組織損傷，并出現(xiàn)一系列臨床表現(xiàn)，如額紋消失、口角歪斜、吐詞不清、一側(cè)肢體癱瘓、感覺異常等，包括缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)和出血性腦卒中(hemorrhagic stroke，HS)，其中以IS最為常見，占腦卒中總數(shù)的60%～70%,是世界范圍內(nèi)致死和致殘的主要原因之一[1]。微RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼單鏈RNA小分子，由22～24個核苷酸組成，主要存在于真核細胞中，參與真核生物轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控[2]。miRNA是內(nèi)源性表達的RNA分子，在調(diào)控IS的病理生理過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在促進血管生成、神經(jīng)形成和神經(jīng)保護等方面可能具有重要作用，一些miRNA及其靶基因被認為參與神經(jīng)損傷修復(fù)[3]。miRNA最初從基因組DNA中轉(zhuǎn)錄，而RNA聚合酶Ⅱ負責(zé)初級miRNA的轉(zhuǎn)錄。miRNA的生物學(xué)功能非常依賴細胞背景，故miRNA與腦卒中之間的確切聯(lián)系應(yīng)該只在特定的細胞環(huán)境中討論。有研究表明，miRNA在腦缺血和相關(guān)疾病的分子過程中充當關(guān)鍵介質(zhì)作用[4]?，F(xiàn)對miRNA在IS的作用予以綜述。

1 IS的病理生理學(xué)改變

IS的病理生理學(xué)機制較為復(fù)雜，尚未完全清楚。目前研究較為明確的機制主要是缺血性興奮性毒性、相關(guān)的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細胞凋亡。當大腦供血障礙時，腦組織出現(xiàn)供能及供氧障礙，腦細胞進行無氧代謝并產(chǎn)生大量乳酸，過多的乳酸堆積導(dǎo)致代謝性酸中毒，最終導(dǎo)致腦細胞壞死。細胞缺氧及能量和ATP生成不足，Na+，K+-ATP泵功能異常，一方面，因細胞內(nèi)外離子及水平衡失調(diào)，細胞內(nèi)Na+增多、水鈉潴留而出現(xiàn)細胞水腫；另一方面，可出現(xiàn)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)(谷氨酸)釋放并激活相關(guān)受體，產(chǎn)生缺血性興奮性毒性作用，最終導(dǎo)致腦細胞死亡[2]。線粒體是細胞產(chǎn)能的主要細胞器，腦缺血時，機體產(chǎn)生過多氧自由基，并激活促分裂原活化的蛋白激酶信號通路，進而出現(xiàn)線粒體功能障礙，氧化呼吸鏈中關(guān)鍵酶活性降低，氧化呼吸鏈中斷，導(dǎo)致產(chǎn)能不足，最終出現(xiàn)腦細胞能量匱乏而死亡。

2 miRNA在干預(yù)IS中的作用

近幾十年，腦卒中的臨床診斷方法主要以CT、磁共振成像、腦血管造影、超聲等影像學(xué)檢查為主，其特異性和區(qū)分急性腦卒中及其相關(guān)危險因素的能力尚不清楚，診斷和判斷預(yù)后的能力有限且成本較高。腦卒中溶栓治療時間窗(6 h內(nèi))的限制使人們不斷探索新的可用于早期診斷及治療腦卒中的生物標志物。研究表明，miRNA有望成為符合要求的生物標志物[3]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些miRNA可用于IS的診斷及預(yù)后判斷。

2.1miRNA與缺血性興奮性毒性 缺血性興奮性毒性指組織在缺血后興奮性神經(jīng)遞質(zhì),如谷氨酸、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)等產(chǎn)生過多，造成神經(jīng)細胞死亡。IS最初腦組織損傷是由于缺血性興奮性毒性導(dǎo)致的。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量較高的最具代表性的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。IS早期，谷氨酸與突觸后非NMDA受體結(jié)合，引起Na+通道開放，大量Na+內(nèi)流，同時伴隨Cl-和水內(nèi)流，進而出現(xiàn)神經(jīng)細胞腫脹、溶解，甚至變性壞死。此外，谷氨酸與NMDA受體結(jié)合，Ca2+通道開放，大量Ca2+內(nèi)流，細胞內(nèi)Ca2+超載，激活相應(yīng)的Ca2+依賴型酶類及磷脂酶類，進而導(dǎo)致細胞膜性結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致細胞死亡。

星形膠質(zhì)細胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體1(glutamate transporter 1，GLT-1)負責(zé)大部分細胞外谷氨酸的清除，對預(yù)防大腦缺血性興奮性毒性具有重要作用[5]。體外實驗發(fā)現(xiàn)，抑制miR-124a表達可顯著降低GLT-1表達水平，使腦組織谷氨酸水平增加，間接說明miR-124a參與腦缺血性興奮性毒性作用調(diào)節(jié)[6]。動物實驗證明，miR-29a、miR-181a在星形膠質(zhì)細胞中含量較高且能調(diào)控GLT-1表達，能通過特殊的靶基因作用于一些重要的細胞生存/死亡通路，保護IS所致的神經(jīng)細胞損傷[7-8]。過量的谷氨酸通過激活突觸外NMDA受體亞基1/NMDA 2B亞基和代謝型谷氨酸受體1，導(dǎo)致鈣超載和細胞死亡[9]。過量表達的miR-223減輕NMDA誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，保護IS所致海馬神經(jīng)元興奮性神經(jīng)細胞死亡[10]。此外，還有一些miRNA參與缺血性興奮性毒性的調(diào)節(jié)，如miR-125b、miR-263a、miR-194等通過減少突出間隙谷氨酸的積累、抑制離子通道的開放等減輕缺血所致的興奮性毒性作用。

2.2miRNA與缺血性氧化應(yīng)激 氧化應(yīng)激參與機體許多生理病理過程，氧化應(yīng)激性損傷是缺血性腦損傷和神經(jīng)細胞死亡的基本機制之一。核轉(zhuǎn)錄因子2(nuclear transcription factor 2，Nrf2)/血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1，HO-1)是目前研究較多的信號通路，在調(diào)節(jié)機體氧化還原反應(yīng)平衡方面具有重要作用，同時也是腦組織缺血/再灌注損傷細胞防御氧化應(yīng)激的重要機制之一[11]。超氧化物歧化酶是一種內(nèi)源性抗氧化酶，可快速有效滅活超氧陰離子，減輕組織損傷，有助于促進IS再灌注損傷的恢復(fù)。谷胱甘肽是機體內(nèi)重要的小分子肽物質(zhì)，具有抗氧化和清除氧自由基的作用。目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNA直接或間接參與Nrf2信號通路的調(diào)節(jié)，miR-93拮抗劑通過激活Nrf2/HO-1抗氧化信號通路減輕缺血性腦組織損傷[12]。miR-210能提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽水平參與調(diào)節(jié)IS時的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕腦組織損傷[13]。腦缺血時，環(huán)加氧酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)可促進活性氧類的產(chǎn)生。正常情況下，COX-2表達量很少，腦缺血可誘導(dǎo)COX-2在神經(jīng)細胞中的表達。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a能抑制COX-2在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的表達[14]。動物實驗表明，miR-424的過度表達能保護短暫性局灶性腦缺血/再灌注損傷，同時抑制過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激造成的細胞損傷[15]。miRNA通過改變相關(guān)酶類表達，從而起到保護或促進缺血性腦損傷作用，使miRNA可能成為潛在的用于改善IS后氧化應(yīng)激的新型治療藥物。

2.3miRNA與缺血后炎癥反應(yīng) 炎癥反應(yīng)是IS病理生理過程的重要環(huán)節(jié)之一。缺血性腦損傷的炎癥反應(yīng)由多種細胞、炎性因子、趨化因子、活性氧類、損傷相關(guān)分子模式、自身抗體等共同參與[16]。研究表明，miR-424能抑制小膠質(zhì)細胞活化，從而保護缺血性腦卒中所致的神經(jīng)組織細胞損傷[17]。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是由小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞表達,能激活核因子κB信號通路，進而促進促炎基因、細胞因子和黏附分子的表達。目前，已發(fā)現(xiàn)多種TLR，并且發(fā)現(xiàn)TLR4信號通路參與缺血后炎性損傷的調(diào)節(jié)。TLR4是小膠質(zhì)細胞中miR-181c的直接作用靶點，可下調(diào)TRL4的表達，此外，miR-181c還可抑制核因子κB的活化以及促炎因子的產(chǎn)生[18]。miR-155通過上調(diào)TLR4表達同時抑制炎性介質(zhì)(細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1、髓系分化初級反應(yīng)基因88)表達,從而促進腫瘤壞死因子α和白細胞介素1β表達[19]。還有一些miRNA參與腦缺血后炎癥調(diào)控，如miR-146a、miR-106a、miR-124、miR-9和miR-219等，通過改變其表達水平調(diào)節(jié)相應(yīng)的炎性因子表達，起到促進或抑制炎癥反應(yīng)作用。

2.4miRNA與缺血細胞凋亡 凋亡、壞死和壞疽是IS發(fā)病的3種細胞死亡類型。細胞凋亡是基因控制下細胞自主有序的死亡，有助于維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，在某些病理情況(如卒中)可加速細胞凋亡。細胞凋亡機制復(fù)雜，涉及一系列的基因激活、表達等，其中有許多信號通路及化學(xué)途徑參與，如膜蛋白受體通路(Fas/FasL)、胱天蛋白酶(caspase)途徑。氧葡萄糖剝奪/再灌動物實驗?zāi)Ｐ捅砻鳎現(xiàn)as是miR-25作用靶點，且miR-25能抑制Fas/FasL途徑活化，從而減輕腦卒中后細胞凋亡[20]。caspase-3在細胞凋亡中起不可替代的作用，其表達量增加可促進細胞凋亡。動物研究發(fā)現(xiàn)，miR-99a抑制cspase-3前體蛋白表達及caspase-3的活化，同時預(yù)防IS后的神經(jīng)細胞凋亡[21]。miR-let-7c-5p能抑制caspase-3表達，從而減少腦缺血所致細胞凋亡[22]。B細胞淋巴瘤/白血病2(B cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2)基因可以抑制由多種細胞毒因素引起的細胞死亡。miR-9能特異性調(diào)控Bcl-2l11表達，從而減少細胞凋亡[23]。Bcl-2和Bcl-xL蛋白是減輕缺血后細胞凋亡和細胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。急性缺血性腦卒中后，miR-106b-5p表達量明顯增加，并直接作用于髓細胞白血病1蛋白。髓細胞白血病1蛋白是Bcl-2家族成員之一，是DNA損傷后調(diào)控細胞凋亡關(guān)鍵因子[24]。組蛋白去甲基化酶10是一種抗凋亡因子，其表達受miRNA調(diào)控，急性IS時，miR-146a表達量顯著下降，miR-146a能顯著上調(diào)組蛋白去甲基化酶10表達，從而減少神經(jīng)細胞凋亡[25]。熱激蛋白(heat shock protein，HSP)A12B是HSP70家族成員之一，參與缺血后神經(jīng)組織凋亡的調(diào)控[26]。有報道m(xù)iR-134在IS中起重要作用，可負向調(diào)控HSPA12B誘導(dǎo)的細胞凋亡[27]。此外，還有一些miRNA參與缺血后腦細胞凋亡的調(diào)控，如miR-323、miR-9、miR-124、miR-497等均通過改變其表達量參與細胞卒中后腦細胞凋亡。

2.5miRNA在腦卒中的潛在治療作用 IS發(fā)病率居高不下，且呈年輕化趨勢，針對IS的治療藥物十分有限，最有效的治療藥物主要是重組組織型纖溶酶原激活劑[28]。而重組組織型纖溶酶原激活劑只適用于急性IS的溶栓制劑，治療時間窗短，一般只用于IS發(fā)病6 h內(nèi)，因此僅適用于10%的IS患者。溶栓治療存在許多局限性和不良反應(yīng)，其中主要不良反應(yīng)是可增加出血風(fēng)險，故需要挖掘其他可用于治療IS的新制劑。miRNA是一種能調(diào)控機體某些潛在有毒基因表達的內(nèi)源性分子，故可作為一種潛在用于治療IS的生物制劑。miRNA參與神經(jīng)保護、促進神經(jīng)形成、血管生成等基因的表達，從而促進IS患者腦組織損傷修復(fù)，降低病死率，提高遠期生存質(zhì)量。

2.5.1神經(jīng)保護作用 水通道蛋白4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的通道蛋白。IS發(fā)作時，水通道蛋白4表達量增加，使大量水通道開放，過多水分子進入細胞內(nèi)，導(dǎo)致腦細胞水腫，最終出現(xiàn)細胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，過度表達的miR-29b能抑制水通道蛋白4的表達，從而縮小腦梗死面積，減輕腦水腫，減輕血腦屏障損傷[29]。動物實驗表明，抑制miR-497的表達，使腦缺血區(qū)Bcl-2及Bcl-W蛋白表達量增加，從而減輕IS，減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷，間接起到保護神經(jīng)組織的作用[30]。腫瘤壞死因子作用因子3已被證實為缺血性級聯(lián)信號中央調(diào)制器，包括神經(jīng)元死亡、神經(jīng)細胞凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激[31]。有實驗表明，miR-455通過抑制腫瘤壞死因子作用因子3表達，減輕大腦中動脈閉塞所致的神經(jīng)元細胞缺血缺氧性的腦組織損傷[32]。此外，其他miRNA(miR-181a、miR-21、miR-347、miR-124等)通過相應(yīng)的途徑直接或間接參與缺血后神經(jīng)保護，故這些miRNA有望成為潛在的診斷IS的生物標志物和治療腦缺血的生物制劑。

2.5.2神經(jīng)形成 神經(jīng)系統(tǒng)功能的維持依賴結(jié)構(gòu)的完整性，同時其增殖、分化、發(fā)育需多種重要物質(zhì)參與，其中神經(jīng)營養(yǎng)因子是重要小分子物質(zhì)之一。血管內(nèi)皮生長因子是一種促進血管生成的神經(jīng)形成營養(yǎng)因子，IS過度表達的miR-210能上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子表達，進而誘導(dǎo)成年小鼠腦內(nèi)神經(jīng)形成[33]。miR-124a通過激活Notch信號通路促進缺血后神經(jīng)形成[34]。其他一些miRNA也參與神經(jīng)形成，如miR-9可促進人類神經(jīng)祖細胞的增殖，miR-17-92通過糖皮質(zhì)激素信號通路影響神經(jīng)形成，可見，miRNA的藥理調(diào)控作用可能是缺血后神經(jīng)形成的潛在機制。

3 小 結(jié)

miRNA在IS的病理生理過程、診斷及潛在治療效果等方面均發(fā)揮重要作用，使基于miRNA的新型生物制劑具有很大的應(yīng)用前景。目前，miRNA的研究多停留在動物水平，如何成功將其轉(zhuǎn)化為人體水平的研究仍是一大難題。針對miRNA靶向劑的研發(fā)仍面臨較多困難，譬如,如何維持其在體內(nèi)的穩(wěn)定性、藥動學(xué)、定向有效組織分布等。隨著研究的不斷深入，期待miRNA靶向劑能順利生產(chǎn)并更好地應(yīng)用于臨床，挽救更多患者的生命。