間充質(zhì)干細(xì)胞與呼吸道變應(yīng)性疾病的相關(guān)研究進展

闞曉麗，李澤龍，王 予，陳穎坤，王嚴(yán)影，曹現(xiàn)寶※

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)研究生院，昆明 650500； 2.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院 a.耳鼻咽喉頜面外科b.臨床實驗科，昆明 650032)

近年來，呼吸道變應(yīng)性疾病的發(fā)病率呈上升趨勢，尤其是變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)、哮喘等嚴(yán)重威脅人類健康[1]。呼吸道變應(yīng)性疾病的發(fā)生發(fā)展伴隨復(fù)雜的病理改變，目前還未發(fā)現(xiàn)能夠徹底治療該類疾病的相關(guān)藥物或技術(shù)。但可以確定呼吸道變應(yīng)性疾病屬Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，主要包括早期炎癥級聯(lián)反應(yīng)和后期遲發(fā)相反應(yīng)，其中各型免疫細(xì)胞的活化是促進疾病發(fā)生、發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種多功能干細(xì)胞，已在骨、軟骨、脂肪、肌腱、韌帶和肌肉等組織的損傷修復(fù)方面表現(xiàn)出治療潛力。越來越多的動物實驗和初步臨床試驗證據(jù)表明，MSCs不僅具有多能分化潛能，還可通過與T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)的相互作用表現(xiàn)出強大的免疫調(diào)節(jié)潛能[2-3]。MSCs對機體的免疫調(diào)節(jié)作用使其成為治療變應(yīng)性疾病的理想藥物，通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化，抑制變態(tài)反應(yīng)，從而控制疾病進展?，F(xiàn)就近年來MSCs與呼吸道變應(yīng)性疾病的相關(guān)研究進展予以綜述。

1 MSCs調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的增殖和功能

T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫的主要執(zhí)行者，在促進變態(tài)反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，MSCs可調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的增殖，參與免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。Giuliani等[4]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)與T細(xì)胞共培養(yǎng)時，BM-MSCs可通過抑制T細(xì)胞進入細(xì)胞周期而影響T細(xì)胞增殖，并能有效地誘導(dǎo)白細(xì)胞介素(interleukin，IL)10的產(chǎn)生，促進T細(xì)胞的凋亡。Lim等[5]對延遲型變態(tài)反應(yīng)(delayed-type hypersensitive，DTH)小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs往往優(yōu)先聚集在引流淋巴結(jié)的副皮質(zhì)區(qū)及生發(fā)中心的邊緣處，并以劑量依賴性方式誘導(dǎo)引流淋巴結(jié)周圍免疫細(xì)胞的凋亡來減弱DTH。DTH過程中，炎癥反應(yīng)區(qū)域T細(xì)胞的浸潤明顯減少，而引流淋巴結(jié)中T細(xì)胞的凋亡顯著增加；進一步研究發(fā)現(xiàn)，MSCs引起T淋巴細(xì)胞凋亡的機制與其對一氧化氮的誘導(dǎo)有關(guān)，表明MSCs可通過直接影響T淋巴細(xì)胞的增殖與凋亡，抑制炎癥反應(yīng)，減輕局部組織損傷。

2 MSCs調(diào)節(jié)B細(xì)胞的增殖和功能

早期為研究MSCs對B淋巴細(xì)胞的相互作用，Corcione等[6]將人BM-MSCs與B淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，BM-MSCs能直接將B淋巴細(xì)胞阻滯于G0/G1期，從而抑制其增殖；進一步實驗發(fā)現(xiàn)，BM-MSCs發(fā)揮上述作用與其抑制免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)M、IgG和IgA的分泌，下調(diào)CXC趨化因子受體4、CXC趨化因子受體5、CC趨化因子受體7、CXC趨化因子配體12和CXC趨化因子配體13的表達有關(guān)。在粉塵螨誘導(dǎo)的小鼠特應(yīng)性皮炎的實驗研究中發(fā)現(xiàn)，人脂肪來源MSCs可以顯著促進特應(yīng)性皮炎小鼠毛發(fā)生長，并以劑量依賴性方式抑制病變處表皮增生和B淋巴細(xì)胞浸潤，降低血清IgE水平；并在隨后進行的共培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)，人脂肪來源MSCs通過抑制環(huán)加氧酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)信號通路實現(xiàn)對B淋巴細(xì)胞增殖和成熟的抑制[7]。另有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，人類臍帶及脂肪來源的MSCs均具有抑制B細(xì)胞增殖和分化的作用。可見，不同組織來源的MSCs均可通過抑制B細(xì)胞的增殖和分化來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[8-9]。

3 MSCs對DC的作用

MSCs對先天或后天免疫細(xì)胞均有抑制作用，DC是其中之一。在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型的研究中，腹腔注射從模型小鼠脾臟分離出的DC能夠加劇潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸的炎性病變，而BM-MSCs處理組小鼠脾臟分離出的DC則能顯著降低炎癥活動指數(shù)，改善組織病理學(xué)評分；進一步實驗發(fā)現(xiàn)，BM-MSCs可通過升高半乳糖凝集素3的表達，降低DC中IL-1β、IL-12和IL-6的濃度，并降低其膜表面抗原呈遞分子的表達[10]。除間接作用外，MSCs還能以直接接觸的方式抑制DC功能。Alidinucci等[11]發(fā)現(xiàn)，MSCs與DC接觸可改變其細(xì)胞骨架組織干擾激活過程，使DC在擴增的同時保留未成熟的特征，從而無法有效參與T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)。而Spaggiari等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs存在的條件下，即使補充外源性的粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和IL-4也不能使從外周血分離出的單核細(xì)胞中獲得典型成熟的DC表型并產(chǎn)生促炎介質(zhì)IL-12，更不能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化或增殖，證明MSCs具有抑制早期DC成熟的作用。綜上所述，MSCs除間接或直接接觸方式對DC的調(diào)控外，還可通過抑制DC的成熟，進而抑制下游炎性通路的活化。

4 MSCs與NK細(xì)胞的相互作用

MSCs與NK細(xì)胞的相互作用及其機制對MSCs的推廣應(yīng)用至關(guān)重要。Najar等[13]通過共培養(yǎng)包皮間充質(zhì)干細(xì)胞(foreskin mesenchymal stromal cells，F(xiàn)SK-MSCs)和NK細(xì)胞驗證其相互作用的研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞的活化對FSK-MSCs表現(xiàn)出不均勻的細(xì)胞毒性，最終導(dǎo)致其死亡。絲氨酸蛋白酶抑制劑是機體中絲氨酸蛋白酶的活性調(diào)控因子之一，可調(diào)節(jié)生物體中許多重要的生命過程(補體激活、炎癥和細(xì)胞遷移等)。在激活的NK細(xì)胞中，F(xiàn)SK-MSCs介導(dǎo)的C1和B9絲氨酸蛋白酶抑制劑的表達明顯降低。此外，F(xiàn)SK-MSCs能抑制NK細(xì)胞的增殖，但卻增加了γ干擾素和腫瘤壞死因子α的表達，并增強NK細(xì)胞的去顆?；饔靡约按┛姿睾皖w粒酶的分泌。Giuliani等[14]的研究同樣證實了MSCs對NK細(xì)胞增殖和溶解細(xì)胞功能具有顯著的抑制作用，MSCs可通過下調(diào)不同激活標(biāo)記和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2信號的表達，阻斷NK細(xì)胞的細(xì)胞溶解機制，從而使其與靶細(xì)胞形成免疫突觸，并分泌細(xì)胞毒物顆粒。其他類似研究也顯示，臍帶來源的MSCs與NK細(xì)胞接觸可引起IL-1途徑活化，隨后引起前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的大量分泌，導(dǎo)致NK細(xì)胞活性降低，并抑制其細(xì)胞毒作用[15]。由此可見，MSCs對NK細(xì)胞具有雙重作用，可通過多種機制抑制NK細(xì)胞活性，降低細(xì)胞毒作用，抑制炎癥反應(yīng)；并在一定程度上增強γ干擾素等因子的表達，發(fā)揮一定的促炎作用。

5 MSCs與呼吸道變應(yīng)性疾病

呼吸道的變應(yīng)性疾病主要包括上呼吸道的AR和下呼吸道的哮喘，上呼吸道和下呼吸道解剖學(xué)上的連貫性導(dǎo)致AR與哮喘經(jīng)常共存，稱為聯(lián)合氣道疾病[16]。近年來的研究也發(fā)現(xiàn)，慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的發(fā)病機制也與變態(tài)反應(yīng)性炎癥有關(guān)[17]。

5.1AR AR是一種慢性復(fù)發(fā)性過敏性炎癥，由變應(yīng)原接觸過度激活的輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)2引起，主要表現(xiàn)為流鼻涕、鼻癢、打噴嚏和鼻塞。病理組織學(xué)顯示，活動性AR患者的鼻黏膜上皮內(nèi)可見肥大細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞的浸潤，深部固有層也可見嗜酸粒細(xì)胞的積累[18]。隨著時間的推移，可出現(xiàn)網(wǎng)狀基膜的輕微增厚，較哮喘的下呼吸道黏膜輕微，病變范圍也較局限。

卵清白蛋白誘導(dǎo)的AR小鼠模型的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，MSCs治療可使小鼠從大多數(shù)過敏性的病理改變中獲得保護，包括抑制炎性細(xì)胞浸潤和肺部黏液生成，減少鼻內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞浸潤，減少支氣管肺泡和鼻腔灌洗液中的炎性細(xì)胞浸潤[19-22]。MSCs治療后AR小鼠血清中Th2細(xì)胞分泌IgE以及細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13的水平均明顯降低。Li等[23]在AR大鼠實驗中觀察到，與對照組相比，MSCs除可抑制鼻腔黏膜中的組胺表達和巨噬細(xì)胞聚集外，還能顯著降低大鼠血清中IL-4、腫瘤壞死因子、IgE等的水平。為了進一步驗證MSCs在AR患者中的作用，F(xiàn)u等[24]提取AR患者外周血單核細(xì)胞，將其與不同細(xì)胞來源的MSCs進行共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，各類MSCs不僅能抑制外周血單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞增殖，還能阻滯G1期T淋巴細(xì)胞的分化，從而抑制T淋巴細(xì)胞的成熟；進一步研究發(fā)現(xiàn)，MSCs可通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞反應(yīng)抑制T細(xì)胞表型向Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化，顯著降低Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13的產(chǎn)生，表明MSCs的管理可抑制Th2免疫反應(yīng)，減少鼻腔及氣道黏膜炎性細(xì)胞浸潤，有效降低AR的過敏癥狀和炎癥反應(yīng)參數(shù)，可作為AR的臨床治療方法，用于治療過敏性氣道疾病。

5.2哮喘 哮喘是一種慢性炎癥性下呼吸道疾病，主要表現(xiàn)為可逆的氣流阻滯、氣道高反應(yīng)性和間歇性呼吸反應(yīng)性癥狀，包括喘息、咳嗽、呼吸困難和胸悶。哮喘患者氣管支氣管樹發(fā)生的炎癥和結(jié)構(gòu)改變稱為重塑。目前，普遍認(rèn)為慢性嗜酸粒細(xì)胞性炎癥是重塑發(fā)生的先決條件[25]。氣道分泌物異常會導(dǎo)致哮喘的病理過程，尤其是嚴(yán)重的、危及生命的惡化。少數(shù)病例的死亡被認(rèn)為是氣道內(nèi)頑固黏稠的黏液與炎癥性嗜酸粒細(xì)胞滲出物混合導(dǎo)致的窒息所致。

MSCs在治療哮喘及并發(fā)癥方面具有重要作用。Li等[26]通過MSCs治療大鼠哮喘模型進行研究發(fā)現(xiàn)，移植MSCs的大鼠淋巴、外周血和肺組織標(biāo)本中IL-10、叉頭狀/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平均顯著升高；與對照組相比，移植MSCs大鼠肺組織中叉頭狀/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)水平有所增加，而IL-17、維甲酸孤兒核受體家族γt和Th17減少，炎性細(xì)胞浸潤也減少。近年來，關(guān)于MSCs治療小鼠哮喘模型的研究較多，通過溴脫氧尿苷標(biāo)記BM-MSCs對卵蛋白誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型進行治療發(fā)現(xiàn)，哮喘組較對照組的組織病理學(xué)改變更加明顯；白細(xì)胞計數(shù)及嗜酸粒細(xì)胞的比例亦明顯升高；在接受BM-MSCs治療的小鼠肺中可見大量含溴脫氧尿苷的BM-MSCs沉積，BM-MSCs治療可顯著降低氣道病理指標(biāo)、炎性細(xì)胞浸潤以及杯狀細(xì)胞增生[27-29]。Han等[30]用帶有促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染MSCs，成功構(gòu)建EPO-MSCs并用于治療發(fā)現(xiàn)，EPO-MSCs對哮喘局部氣道炎癥及肺組織IL-4、IL-5、IL-13水平的抑制作用強于MSCs；與哮喘組相比，治療組巨噬細(xì)胞的數(shù)量、平滑肌層厚度、膠原密度、增殖細(xì)胞核抗原陽性間充質(zhì)細(xì)胞和血管性血友病因子陽性血管的數(shù)量均明顯受到EPO-MSCs的抑制，且EPO-MSCs還下調(diào)了肺組織中轉(zhuǎn)化生長因子β1的表達，并活化轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1和p38促分裂原活化的蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK)的信使RNA(message RNA，mRNA)和蛋白水平。以上研究表明，MSCs能調(diào)節(jié)Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡，減少炎性因子生成，有效降低呼吸道炎性細(xì)胞浸潤，達到改善氣道高反應(yīng)性和調(diào)節(jié)氣道重構(gòu)的目的，且EPO-MSCs可更有效地減弱哮喘氣道重塑。

為進一步深入探討MSCs治療哮喘的機制，Tang等[31]采用微RNA(microRNA，miRNA)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)陣列分析MSCs治療前后哮喘小鼠體內(nèi)RNA的改變發(fā)現(xiàn)，共有296個miRNA在誘導(dǎo)哮喘和BM-MSCs治療后表達不同，其中14個miRNA在哮喘誘導(dǎo)和BM-MSCs移植之間呈現(xiàn)反向變異趨勢，通過增加樣本進一步證實了mmu-miR-21a-3p、mmu-miR-449c-5p和mmu-miR-496a-3p在實時定量PCR表達不同；同時發(fā)現(xiàn)了19個與誘導(dǎo)過敏和BM-MSCs治療有關(guān)的基因，目標(biāo)基因的分析顯示，mmu-miR-21a-3p與免疫調(diào)節(jié)劑活化素受體2A(activin receptor type 2A，Acvr2a)顯著相關(guān)，且在哮喘和BM-MSCs治療后與Acvr2a相關(guān)抗體表達相反；雙熒光素酶試驗報告也顯示，mmu-miR-21a-3p對Acvr2a的轉(zhuǎn)錄呈負(fù)性調(diào)控；此外，has-miR-21a抑制劑顯著增加了脂多糖刺激下人正常肺上皮細(xì)胞Acvr2a的mRNA表達。在此之后，Lin等[32]通過mRNA PCR芯片檢測發(fā)現(xiàn)了47個蛋白編碼mRNA表達差異，分級聚類分析證實包括趨化因子配體11、嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白2、IL-13、IL-33和嗜酸粒細(xì)胞相關(guān)的核糖核酸酶A家族成員11等5個mRNA在哮喘模型誘導(dǎo)后顯著上調(diào)，經(jīng)MSCs處理下調(diào)。哮喘誘導(dǎo)和MSCs治療后有不同miRNA和mRNA的表達，而這些RNA是變態(tài)反應(yīng)和MSCs介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)的潛在靶點。

5.3COPD COPD是臨床常見的慢性呼吸道疾病之一。吸煙是目前公認(rèn)的最重要的病因，但近年研究結(jié)果顯示，氣道高反應(yīng)性與循環(huán)中免疫細(xì)胞的改變與該疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[33-34]。臨床研究也觀察到，與正常人群相比，部分COPD患者血清中嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比例往往呈升高趨勢，且升高程度與疾病的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[35-36]?？梢?，過敏性炎癥反應(yīng)與COPD存在潛在相關(guān)性。

大量動物模型顯示了MSCs在COPD動物模型中的保護和修復(fù)作用。通過香煙煙霧誘導(dǎo)大鼠肺氣腫模型研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)尾靜脈MSCs移植可阻斷肺氣腫的進展，降低細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)機體氧化應(yīng)激[37]。而Gu等[38]實驗研究發(fā)現(xiàn)，MSCs通過下調(diào)COX-2和COX-2介導(dǎo)的PGE2生成可減輕氣道炎癥和肺氣腫，之后通過體外共培養(yǎng)實驗證明，抑制p38 MAPK和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶的活化及相關(guān)磷酸化可下調(diào)巨噬細(xì)胞COX-2/PGE2的分泌。Song等[39]的研究顯示，經(jīng)過MSCs治療的模型大鼠支氣管灌洗液中中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的百分比較未經(jīng)處理組(對照組)明顯降低，且支氣管周圍及肺泡結(jié)構(gòu)的感染細(xì)胞浸潤較少。對COPD模型小鼠治療前后進行基因表達譜分析發(fā)現(xiàn)，長期暴露于香煙煙霧的小鼠經(jīng)過MSCs系統(tǒng)注射后，具有氧轉(zhuǎn)運和抗氧化功能的基因Hbb及Hba增加，血清蛋白酶抑制劑在相應(yīng)的時間點也有所增加[40]。可見，MSCs一方面可通過抑制肺泡巨噬細(xì)胞中的COX-2/PGE2或p38 MAPK和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路，減輕COPD動物模型中的氣道炎癥；另一方面，也可通過降低中性粒細(xì)胞及嗜酸粒細(xì)胞水平，減少機體氧化應(yīng)激反應(yīng)，阻斷肺氣腫的進展，進而恢復(fù)部分受損的肺功能。

臨床前的體內(nèi)外研究都證明了MSCs可有效治療COPD。為進一步驗證MSCs治療的安全性及有效性，De Oliveira等[41]進行MSCs聯(lián)合單向支氣管內(nèi)瓣膜置入術(shù)(one-way endobronchial valves，EBV)治療肺氣腫Ⅰ期臨床試驗發(fā)現(xiàn)，EBV+MSC聯(lián)合治療并沒有導(dǎo)致急性給藥相關(guān)毒性、嚴(yán)重不良事件或死亡的發(fā)生；兩組所有不良事件、COPD加重的頻率或疾病惡化的發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；此外，患者在血液檢查、肺功能或放射學(xué)結(jié)果上也無統(tǒng)計學(xué)意義；且與EBV治療相比，EBV+MSC治療的生活質(zhì)量指標(biāo)更高，在30～90 d內(nèi),患者的循環(huán)C反應(yīng)蛋白水平下降，BODE(B：體質(zhì)指數(shù)，O：氣道阻塞，D：呼吸困難，E：運動指數(shù))和改良版英國醫(yī)學(xué)研究委員會呼吸困難問卷評分下降，說明MSCs治療是安全的，MSCs管理能夠減少系統(tǒng)炎癥和COPD預(yù)測因子，并在治療后改善患者的生活質(zhì)量。

6 小 結(jié)

隨著社會經(jīng)濟發(fā)展和空氣污染的加重，呼吸系統(tǒng)疾病問題越來越突出，尋找更有效的治療迫在眉睫。MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能給呼吸系統(tǒng)相關(guān)變應(yīng)性疾病的治療帶來了希望，為這類疾病的治療提供了新的策略。目前大量研究表明,MSCs在治療呼吸道變應(yīng)性疾病上有較好的作用，但絕大部分集中在動物實驗方面，MSCs的給藥劑量、治療頻率以及潛在的作用機制仍有待進一步闡明[42]。此外，關(guān)于現(xiàn)實中MSCs治療的應(yīng)用還需要進行創(chuàng)新和改進，如制訂合適、嚴(yán)格的MSCs基礎(chǔ)治療規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)，以成為未來患者更有效、更安全的治療選擇[43]。