EAG2在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展

李 敏，閆金玉，唐云飛，王 靜，杜東書(shū)，陳付學(xué)※

(1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院腦與心臟分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，上海 200444；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 205101)

離子通道是成孔的跨膜蛋白，通過(guò)控制跨膜離子流調(diào)節(jié)生物體的生命活動(dòng)，不僅參與細(xì)胞骨架的重塑和細(xì)胞之間的相互作用，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和侵襲性生長(zhǎng)等過(guò)程[1]。K+通道在調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性過(guò)程中具有重要作用[2]。人類(lèi)基因組編碼40個(gè)電壓門(mén)控K+通道，參與多種生理過(guò)程，如參與神經(jīng)元和心臟動(dòng)作電位的復(fù)極化、調(diào)節(jié)Ca2+信號(hào)和細(xì)胞體積、推動(dòng)細(xì)胞增殖和遷移，電壓門(mén)控K+通道是自身免疫疾病、神經(jīng)和心血管疾病及惡性腫瘤治療藥物的開(kāi)發(fā)研究熱點(diǎn)[3]。電壓門(mén)控K+通道的Ether-a-go-go(EAG)超家族由Eag、Elk、Erg 三個(gè)功能不同的基因家族組成，編碼各種低閾值K+電流，可在無(wú)脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物等生物體中的可興奮細(xì)胞廣泛表達(dá)[4-5]。激活EAG2電壓門(mén)控K+通道，可使K+流出細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)生命活動(dòng)。EAG通道及各亞型通常通過(guò)突變作用于神經(jīng)元，引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病，對(duì)維持正常生命活動(dòng)具有重要作用。

惡性腫瘤的病死率極高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010年美國(guó)確診惡性腫瘤患者1 529 560例，其中569 490例死亡[1]。離子通道參與惡性腫瘤的發(fā)生，腫瘤細(xì)胞可在低氧條件下無(wú)限增殖、遷移和存活。在細(xì)胞癌變過(guò)程中，某些惡性細(xì)胞Ca2+信號(hào)發(fā)生重塑，并通過(guò)抑制正常細(xì)胞增殖、逃避程序化細(xì)胞死亡、適應(yīng)缺氧環(huán)境、侵襲和擴(kuò)散到原發(fā)腫瘤部位，從而破壞正常生理功能[6]。離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和水通道蛋白可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞體積變化和調(diào)節(jié)Ca2+和H+信號(hào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[7]。在惡性腫瘤中，EAG電壓門(mén)控K+通道的異常表達(dá)可改變細(xì)胞周期的下游信號(hào)[8]。EAG通道可在多種器官腫瘤中表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程和增殖密切相關(guān)。Asher等[9]研究發(fā)現(xiàn)，EAG電壓門(mén)控K+通道調(diào)節(jié)劑是腫瘤發(fā)展的抑制劑，通過(guò)抑制EAG通道的表達(dá)可減少體外和體內(nèi)的腫瘤增殖。正常組織中，EAG通道呈限制性表達(dá)，故可能成為新的腫瘤標(biāo)志物?，F(xiàn)對(duì)EAG2在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 EAG2的結(jié)構(gòu)、生理特性和分布表達(dá)

1.1EAG2的結(jié)構(gòu)及電生理特征 EAG家族的結(jié)構(gòu)與其他電壓門(mén)控K+通道相同，由4個(gè)亞基以及位于胞內(nèi)的C端和N端組成，每個(gè)亞基由6個(gè)跨膜段(S1～S6)組成[10]。S1～S4是相對(duì)獨(dú)立的電壓傳感域，可將膜電位變化轉(zhuǎn)化為通道門(mén)控。K+選擇性透過(guò)孔位于S5～S6，門(mén)控電壓主要由S4結(jié)構(gòu)域內(nèi)兩個(gè)疏水殘基隔開(kāi)的陽(yáng)性精氨酸或賴(lài)氨酸殘基鏈作為電壓傳感器感測(cè)[11-12]。EAG2的N端保守結(jié)構(gòu)域由帶有端蓋結(jié)構(gòu)PAS結(jié)構(gòu)域組成，C端包含1個(gè)環(huán)核苷酸結(jié)合的同源結(jié)構(gòu)域。EAG2屬于EAG家族成員之一，與已知哺乳動(dòng)物同源基因EAG1非常相似，故被稱(chēng)為EAG2[13]。

EAG2和EAG1的氨基酸序列有70%的同源性[12]。相關(guān)研究表明，EAG2與EAG家族其他蛋白質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)相同，均具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，此外，EAG2還含有存在于S5～S6的特征孔(H5區(qū)域)，且不同EAG電壓門(mén)控K+通道成孔亞基中的特征孔(H5區(qū)域)高度保守，有助于形成通道K+選擇性透過(guò)孔[14]。EAG2通道的閉合通過(guò)鈣調(diào)素與通道 N端和C端的3個(gè)離散位點(diǎn)鈣調(diào)素依賴(lài)的結(jié)合實(shí)現(xiàn)，與電壓傳感器的激活無(wú)關(guān)[10]。

電壓門(mén)控EAG2通道含有環(huán)狀核苷酸結(jié)合同源結(jié)構(gòu)域和多種鈣調(diào)蛋白結(jié)合基序。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高可引起EAG2通道C端胞質(zhì)部分異源表達(dá)和原生EAG2通道的蛋白水解消化。Shimizu等[15]采用Ca2+載體A23187處理表達(dá)EAG2的細(xì)胞1 h發(fā)現(xiàn)，EAG2通道全長(zhǎng)蛋白質(zhì)減少約80%，并伴有分子量30 000～35 000肽的出現(xiàn)；用Ca2+-ATP酶抑制劑毒胡蘿卜素處理3 h可去除EAG2通道蛋白質(zhì)中約1/3的分子量為30 000～35 000的肽。由于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加可導(dǎo)致EAG2通道蛋白水解，故Ca2+誘導(dǎo)的EAG2通道蛋白水解切割是EAG2通道蛋白的正常生理或病理反應(yīng)。

EAG2通道對(duì)生理pH變化的敏感性較高，EAG2易受細(xì)胞膜外質(zhì)子的抑制。細(xì)胞膜外的酸性環(huán)境可使EAG2通道的電導(dǎo)電壓曲線(xiàn)向去極化方向移動(dòng)，導(dǎo)致電壓閾值下限降低，由此可見(jiàn)，EAG2通道對(duì)細(xì)胞膜外生理pH的變化高度敏感。EAG2通道的高pH敏感性有助于觀察體內(nèi)pH敏感的K+電流[4]。EAG2對(duì)細(xì)胞外Mg2+水平的變化敏感，當(dāng)細(xì)胞外Mg2+水平升高時(shí)，EAG2電導(dǎo)電壓的激活曲線(xiàn)降低[16]。當(dāng)細(xì)胞外無(wú)Mg2+時(shí)，EAG2對(duì)細(xì)胞外pH的變化更敏感。

Sch?nherr等[17]對(duì)比克隆人EAG(human EAG，hEAG)2與同工型hEAG1的研究發(fā)現(xiàn)，在非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，hEAG2激活的時(shí)間較hEAG1慢；對(duì)于hEAG2通道，亞基半最大激活所需電壓約為10 mV，但hEAG2激活對(duì)電壓的依賴(lài)性較小，電壓敏感性較低，故hEAG2通道可在較hEAG1電壓更低的電壓條件下開(kāi)放。對(duì)hEAG2和hEAG1共表達(dá)及其產(chǎn)生電流的動(dòng)力學(xué)分析表明，hEAG2和hEAG1可形成異源通道復(fù)合物。

1.2EAG2的分布表達(dá) Kcnh5編碼的EAG2(Kv10.2)蛋白主要在丘腦表達(dá)，在腦、睪丸、骨骼肌、心臟、胎盤(pán)、肺、肝臟亦有表達(dá)，在腎臟和胰腺的表達(dá)水平較低[18]。SD大鼠EAG2信使RNA主要在神經(jīng)組織中表達(dá)，在成人骨骼、心臟和平滑肌中未檢測(cè)到其表達(dá)。EAG2在腦中的分布與大鼠皮質(zhì)和嗅球內(nèi)EAG1的分布區(qū)域重疊，但其他部位的EAG2分布與EAG1存在差異，EAG2在小腦很少表達(dá)，但可在除紋狀體和腦垂體以外的大多數(shù)神經(jīng)組織表達(dá)，最主要的表達(dá)部位是丘腦、下丘腦和某些腦干核[19]。大鼠EAG2信使RNA在小腦、海馬、皮質(zhì)和髓質(zhì)少量表達(dá)，脾、肝、肺、腎、心臟、主動(dòng)脈未檢測(cè)到其表達(dá)。

Jow和Jeng[20]通過(guò)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色聯(lián)合激光掃描共聚焦顯微技術(shù)對(duì)視網(wǎng)膜EAG2表達(dá)的研究顯示，大鼠視網(wǎng)膜EAG1(rEAG1)和EAG2(rEAG2)的表達(dá)模式不同，視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層外半部分rEAG1免疫反應(yīng)最突出，而感光細(xì)胞、外叢狀層和內(nèi)核層外部和內(nèi)部段rEAG2的免疫反應(yīng)較強(qiáng)。由此可見(jiàn)，rEAG1和rEAG2 通道可能在視網(wǎng)膜神經(jīng)元電路的電信號(hào)傳輸中起重要作用。

Chuang等[21]對(duì)培養(yǎng)的幼齡海馬神經(jīng)元和成熟海馬神經(jīng)元的免疫熒光分析表明，樹(shù)突狀細(xì)胞和軸突區(qū)室中存在內(nèi)源性rEAG1和rEAG2電壓門(mén)控K+通道。海馬神經(jīng)元和視網(wǎng)膜樹(shù)突體細(xì)胞間的大鼠EAG1和EAG2通道的亞細(xì)胞定位不同[20]。rEAG1通道呈現(xiàn)點(diǎn)狀模式表達(dá)，與rEAG1相比，rEAG2 可能僅表達(dá)于培養(yǎng)7 d和12 d的體外神經(jīng)元軸突中，且表達(dá)水平較低，此外，rEAG2在幾乎所有神經(jīng)元樹(shù)突狀細(xì)胞或軸突均未顯示明顯的點(diǎn)狀分布[21]。

2 EAG2與惡性腫瘤

EAG2電壓門(mén)控K+通道主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，目前對(duì)EAG2電壓門(mén)控K+通道功能的研究較少。Yang等[22]的多態(tài)結(jié)構(gòu)模型研究發(fā)現(xiàn)，癲癇性腦病和具有自閉癥特征患兒的EAG2功能發(fā)生了獲得性突變。目前，尚無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)與EAG2電壓門(mén)控K+通道功能實(shí)例的相關(guān)報(bào)道，EAG電壓門(mén)控K+通道突變導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)性能受損不僅與EAG通道功能障礙有關(guān)，還可能與腦發(fā)育期間EAG通道的特殊作用有關(guān)。EAG2電壓門(mén)控K+通道可持續(xù)影響神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用不容忽視。與EAG2可在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮作用相似，EAG2電壓門(mén)控K+通道可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖起重要作用。

腫瘤的發(fā)生過(guò)程與遺傳物質(zhì)的改變相關(guān)，遺傳物質(zhì)的改變可能導(dǎo)致正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞惡化可引起多種信號(hào)分子異常，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞獲得許多特定能力，如增殖不受控制、抵抗細(xì)胞凋亡。據(jù)報(bào)道電壓門(mén)控K+通道在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲中發(fā)揮不同的作用[23]。此外，腫瘤細(xì)胞中的電壓門(mén)控K+通道可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[24]。EAG2電壓門(mén)控K+通道具有致癌性，不僅可參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，還可抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖[25]。離子通道阻滯劑在體外通?？梢种茞盒阅[瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，如非特異性EAG電壓門(mén)控K+通道阻滯劑可誘導(dǎo)細(xì)胞膜去極化，從而影響黑色素瘤細(xì)胞系的增殖[26]。此外，細(xì)胞外K+濃度升高引起的膜去極化也以類(lèi)似的方式抑制循環(huán)細(xì)胞的增殖[27]?，F(xiàn)對(duì)腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、胰腺癌與髓母細(xì)胞瘤中EAG2的異常表達(dá)予以闡述。

2.1EAG2與腎細(xì)胞癌 腎細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的腎癌類(lèi)型，占腎癌的90%～95%[28]。目前，全球腎癌的發(fā)病率每年增加約2%，男性與女性的發(fā)病比例約為1.5∶1，以60～70歲人群的發(fā)病率最高[29]。EAG1在大腦中廣泛表達(dá)，但在肝、肺、心臟和腎臟較少表達(dá)[30]。正常組織中EAG1的分布很少，惡性腫瘤細(xì)胞中EAG1的表達(dá)上調(diào)。已有研究證實(shí)，EAG1在多種腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)，其中包括腎細(xì)胞癌[31]。

與EAG1相同，EAG2也主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)。EAG2電壓門(mén)控K+通道在腎細(xì)胞癌中也呈過(guò)表達(dá)，Wadhwa等[24]比較腎細(xì)胞癌和正常腎組織中EAG和hEAG通道的研究發(fā)現(xiàn)，正常腎組織缺乏EAG2表達(dá)，而腎細(xì)胞癌中EAG2的表達(dá)明顯升高?？梢?jiàn)，EAG2是腎細(xì)胞癌的潛在診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。

2.2EAG2與黑色素瘤 黑色素瘤是從含有黑色素的細(xì)胞中發(fā)展而來(lái)的癌癥，又稱(chēng)惡性黑色素瘤。對(duì)黑色素瘤細(xì)胞功能特性的研究是制定抗腫瘤策略的重要前提。常利用電生理學(xué)和分子生物學(xué)方法表征人黑色素瘤細(xì)胞系的電壓門(mén)控K+通道，Meyer等[27]發(fā)現(xiàn)，所有黑素瘤細(xì)胞系均表達(dá)外向整流電壓門(mén)控K+通道，表明黑色素瘤中存在EAG1的表達(dá)，可見(jiàn)EAG電壓門(mén)控K+通道在黑色素瘤細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要功能[32]。黑色素瘤細(xì)胞系的增殖可能受非特異性電壓門(mén)控K+通道阻滯劑(細(xì)格孢氮雜酸、奎尼丁)的影響[33]。

EAG2通道可在惡性腫瘤細(xì)胞系(包括黑色素瘤)以及正常成人腦和胎盤(pán)中表達(dá)。由于惡性腫瘤中EAG2電壓門(mén)控K+通道的表達(dá)存在異常，且轉(zhuǎn)錄活躍的基因通常與啟動(dòng)子低甲基化和非活性啟動(dòng)子的DNA過(guò)甲基化有關(guān)，故可對(duì)EAG2電壓門(mén)控K+通道基因啟動(dòng)子的DNA甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究。Kcnh5 參與腫瘤的細(xì)胞周期調(diào)控及增殖，其甲基化狀態(tài)異常可能是黑色素瘤發(fā)生的標(biāo)志[23]。Macaulay 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，EAG2電壓門(mén)控K+通道的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因Kcnh5的甲基化程度較低，僅在人胎盤(pán)中表達(dá)。但可在黑色素瘤中檢測(cè)出來(lái)自胎盤(pán)特異性轉(zhuǎn)錄本的RNA[35]。因此，胎盤(pán)特異性Kcnh5 啟動(dòng)子的低甲基化通常與黑素瘤細(xì)胞中Kcnh5 表達(dá)相關(guān)。

2.3EAG2與胰腺癌 胰腺細(xì)胞繁殖失控并形成腫塊，導(dǎo)致胰腺癌的發(fā)生。電壓門(mén)控K+通道對(duì)調(diào)節(jié)胰腺內(nèi)分泌和外分泌功能十分重要。在內(nèi)分泌胰腺中，許多電壓門(mén)控K+通道在胰島細(xì)胞中表達(dá)，并參與胰島素分泌；在外分泌胰腺中，腺泡細(xì)胞中電壓門(mén)控K+通道的主要作用是調(diào)節(jié)電解質(zhì)和酶的分泌。電壓門(mén)控K+通道可以決定細(xì)胞的靜息膜電位，并為胰腺和唾液腺等上皮細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運(yùn)和液體分泌提供動(dòng)力[36]。電壓門(mén)控K+通道可調(diào)節(jié)細(xì)胞興奮性，參與上皮細(xì)胞的增殖、凋亡及離子轉(zhuǎn)運(yùn)，并對(duì)胰腺癌具有靶向治療作用(使用電壓門(mén)控K+通道開(kāi)放劑以維持或上調(diào)胰腺分泌)。胰管中電壓門(mén)控K+通道可使膜電位超極化，并為陰離子分泌提供驅(qū)動(dòng)力。胰管細(xì)胞功能性電壓門(mén)控K+通道的分子候選物包括Kcnn4 (KCa3.1)、Kcnma1 (KCa1.1)、Kcnq1 (Kv7.1)、Kcnh2 (Kv11.1)、Kcnh5 (Kv10.2)、Kcnt1 (KCa4.1)、Kcnt2 (KCa4.2)和Kcnk5 (K2P5.1)[12]。Kcnh5在嚙齒動(dòng)物和人胰管細(xì)胞中清晰表達(dá)，但EAG2通道的生理或潛在病理生理作用尚不清楚。一些EAG2電壓門(mén)控K+通道被認(rèn)為是惡性腫瘤的標(biāo)志物，將特定電壓門(mén)控K+通道開(kāi)放劑或抑制劑用于治療胰腺疾病仍需更深入的研究。

2.4EAG2與髓母細(xì)胞瘤 髓母細(xì)胞瘤是兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腦腫瘤，常沿腦和脊髓的軟腦膜轉(zhuǎn)移[37]。Huang和Jan[38]通過(guò)全基因組微陣列研究發(fā)現(xiàn)，不同分子和組織學(xué)亞群中EAG2的過(guò)表達(dá)是髓母細(xì)胞瘤的特征之一。對(duì)髓母細(xì)胞瘤的分子學(xué)和電生理學(xué)研究證實(shí)，髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞中存在過(guò)量的EAG2蛋白，且EAG2過(guò)表達(dá)是人類(lèi)髓母細(xì)胞瘤的重要特征[39]。EAG2表達(dá)水平下降不僅損害體外髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，還可降低體內(nèi)腫瘤負(fù)荷，并可提高其在異種移植研究中的存活率，表明EAG2電壓門(mén)控K+通道在促進(jìn)腦腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中具有進(jìn)化保守功能，進(jìn)一步說(shuō)明靶向EAG2電壓門(mén)控K+通道在惡性腫瘤治療中的潛力[40]。下調(diào)EAG2表達(dá)可抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的有絲分裂，增強(qiáng)p38促分裂原活化的蛋白激酶信號(hào)通路的活性，抑制腫瘤生長(zhǎng)。與此相反，異位膜EAG2可導(dǎo)致髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞體積減小、細(xì)胞間期分裂樣形態(tài)細(xì)胞明顯減少，伴細(xì)胞周期異常，并可出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，EAG2可能是重要的髓母細(xì)胞瘤治療藥物開(kāi)發(fā)靶點(diǎn)。

3 小 結(jié)

EAG1和EAG2是EAG通道家族成員，在惡性腫瘤中呈過(guò)表達(dá)，可作為惡性腫瘤的標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。EAG2電壓門(mén)控K+通道主要在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)。目前，對(duì)腫瘤中EAG2作用機(jī)制的相關(guān)研究較少。EAG2可在人類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，特別對(duì)惡性腫瘤的研究具有重要作用，但具體機(jī)制尚不清楚。探索EAG2與人類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系有助于加深對(duì)惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及診斷方法的認(rèn)識(shí)，為開(kāi)發(fā)有效治療惡性腫瘤的藥物及方法提供理論支持。