自噬在膿毒血癥中的作用研究進展

吳 澤，付 斌，符策崗

(1.中南大學湘雅醫(yī)學院附屬海口醫(yī)院 海口市人民醫(yī)院急診科，?？?570208；2.上海市第六人民醫(yī)院 ?？谑泄强婆c糖尿病醫(yī)院骨科，?？?570300)

膿毒血癥是一種可以導致嚴重多器官功能障礙綜合征的致死性臨床疾病。雖然關(guān)于其治療在抗生素治療、呼吸機管理、復蘇策略和血糖維持等方面取得了一定進展，但嚴重膿毒血癥仍是重癥監(jiān)護病房的主要死亡原因[1]。在抗生素時期，膿毒血癥被定義為病原體引起的全身炎癥反應綜合征。然而，近年來膿毒血癥被定義為由宿主對感染反應失調(diào)引起的威脅生命的器官功能障礙[2]。據(jù)調(diào)查，多器官功能障礙在膿毒血癥患者并發(fā)癥中占40%～60%[3]，傳統(tǒng)的抗感染治療和支持治療旨在改善膿毒血癥誘導衰竭器官的功能，但治療效果不佳[4]。以往研究認為，膿毒血癥引起的組織器官損害可歸因于炎癥反應的過度活化[5]、免疫功能紊亂[6]和凝血功能障礙等[7]。在膿毒血癥誘導的多器官功能障礙中可伴有自噬的改變，并對疾病產(chǎn)生一定的影響。在脂多糖或盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)誘導的膿毒血癥中，自噬發(fā)揮著雙重作用，其在早期促進細胞和組織的生存，晚期發(fā)揮損傷作用?，F(xiàn)就自噬在膿毒血癥中的作用研究進展予以綜述。

1 細胞自噬概述

自噬通?？煞譃檫x擇性自噬和非選擇性自噬。非選擇性自噬是一種進化上保守的細胞質(zhì)降解系統(tǒng)，其內(nèi)的各種物質(zhì)被雙膜結(jié)構(gòu)-自噬體隔離，隨后運送至溶酶體進行降解，以維持細胞穩(wěn)態(tài)。但非選擇性自噬需要受體蛋白識別后才能降解各種物質(zhì)，如通過線粒體自噬方式回收損傷或功能不全的線粒體。在饑餓、活性氧類聚集及各種微生物等刺激下，自噬水平的失衡容易導致細胞器的破壞，能量代謝紊亂，最終引起細胞死亡和凋亡[8-9]。目前，酵母的遺傳學研究已鑒定出30多個自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene,Atg)，在自噬過程中，Atg以高度調(diào)節(jié)的方式按順序連接。這些Atg可組成包括Atg1/unc-51樣激酶起始復合物、Ⅲ類磷脂酰肌醇激酶成核復合物、磷脂酰肌醇-3-激酶結(jié)合Atg18/Atg2復合物、Atg5-Atg12偶聯(lián)體系和Atg8/微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain,LC3)-磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)體系在內(nèi)的5種官能團，它們參與自噬體的啟動、形成、伸長和融合[10]。自噬始動于Atg1/unc-51樣激酶復合物的活化與分離膜。然后，通過活化Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶復合物、Atg14和Beclin-1等形成雙層膜結(jié)構(gòu)-隔離膜。在哺乳動物中，分離膜主要起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸部位，也可起源于包括高爾基體、內(nèi)質(zhì)體和質(zhì)膜在內(nèi)的其他部位。Atg5-Atg12復合物與Atg16結(jié)合可將分離膜擴展為自噬體膜，隨后LC3和γ-氨基丁酸受體相關(guān)蛋白家族成員與磷脂酰乙醇胺結(jié)合并募集到膜中。Atg4B和Atg7，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺結(jié)合促進LC3-Ⅱ形成，這種脂類共軛形式的LC3通常用作自噬體標志物。最終，自噬體與溶酶體融合，內(nèi)容物降解，有用成分被回收或用于代謝途徑[10-11]。

2 自噬與膿毒血癥

膿毒血癥誘導的自噬是通過微生物結(jié)構(gòu)中的病原體相關(guān)分子模式與模式識別受體結(jié)合開始，常見的模式識別受體包括Ca2+依賴型糖結(jié)合跨膜分子、視黃酸誘導基因1[12]和Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)等，這種結(jié)合反過來又可以激活不同的細胞內(nèi)事件，并促進LC3-Ⅰ向LC-Ⅱ轉(zhuǎn)化，從而導致自噬活性的增加。研究表明，革蘭陰性菌的脂多糖與TLR4結(jié)合后通過促分裂原活化的蛋白激酶/p38信號通路激活自噬[13]。而磷脂壁酸與TLR2結(jié)合后通過促分裂原活化的蛋白激酶1/胞外信號調(diào)節(jié)激酶2-促分裂原活化的蛋白激酶3/胞外信號調(diào)節(jié)激酶1途徑誘導自噬[13]。自噬的異常表達可直接或間接影響膿毒血癥誘發(fā)的多器官功能障礙。在盲腸結(jié)扎術(shù)后的小鼠體內(nèi)，自噬在術(shù)后初始階段增加，隨后逐漸減弱[14]。在脂多糖誘導的急性肺損傷模型中，中性粒細胞自噬水平升高，表明該過程中自噬表達水平可能受炎癥信號通路的調(diào)節(jié)[15]。以上研究說明，自噬對膿毒血癥誘導的多器官功能障礙有重要的調(diào)節(jié)作用。

2.1自噬與膿毒性肝臟損傷 在各種動物膿毒血癥模型中，肝臟自噬誘導水平最高，其次為心臟和脾臟[16]。鈣蛋白酶系統(tǒng)可通過直接裂解包括從自噬體形成到自噬溶酶體降解整個自噬過程的某些Atg蛋白抑制自噬的發(fā)生，如裂解后的Atg5水平與鈣蛋白酶活化一致是鈣蛋白酶介導的自噬功能損害的表現(xiàn)。盲腸結(jié)扎術(shù)誘導的小鼠膿毒性肝損傷中鈣蛋白酶活性增加，而抑制鈣蛋白酶可以增加自噬，提示這種蛋白酶活性增加可能是膿毒血癥過程中的一種負性自噬調(diào)節(jié)機制[17]。有學者對缺乏表面活性劑相關(guān)蛋白A1和表面活性劑相關(guān)蛋白D小鼠的肝組織進行自噬活性檢測發(fā)現(xiàn)，LC3-Ⅱ和自噬體顯著增加，且與野生型小鼠相比，表面活性劑相關(guān)蛋白A1和表面活性劑相關(guān)蛋白D敲除小鼠的生存率明顯升高，表明自噬在膿毒血癥誘導的肝損傷中發(fā)揮保護作用[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在脂多糖刺激后出現(xiàn)漸進性肝損傷，4 h后丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶顯著升高，隨著刺激時間增加，肝組織損傷逐漸加重，6 h后脂多糖成功誘導小鼠急性肝損傷。在急性肝損傷早期(2～4 h)自噬標志物(Atg5、Atg7、Beclin-1、LC3A)表達水平呈上升趨勢；在肝衰竭期，自噬標志物表達水平下降[19]。氯喹是一種自噬抑制劑，其能夠阻斷自噬流，給予膿毒血癥小鼠氯喹后，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平升高，肝組織損傷加重，這進一步證實自噬在膿毒血癥誘導肝損傷中發(fā)揮保護作用[16]。在早期膿毒血癥中，自噬水平升高在肝細胞中發(fā)揮保護作用，而晚期自噬水平下降可能與膿毒血癥時的肝功能衰竭有關(guān)。

2.2自噬與膿毒性心肌損傷 Sun等[20]研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的脂多糖刺激小鼠后，其心臟中的自噬增加；而在高劑量的脂多糖刺激下，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的活性增加，自噬減少。心臟特異性過表達自噬基因Beclin-1后，自噬增加，mTOR信號通路被抑制，心臟功能、炎癥反應和纖維化均得到改善。Rubicon是一種自噬負性調(diào)控因子，其通過抑制Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶C3/Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶的活性抑制自噬體的成熟。有學者用脂多糖刺激Rubicon敲除小鼠發(fā)現(xiàn)，其存活時間較野生型小鼠長；超聲心動圖結(jié)果顯示，與野生型小鼠相比，Rubicon敲除小鼠在脂多糖刺激12 h后心排血量和自噬明顯增加[21]。AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一種在細胞能量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用的酶，其能夠調(diào)節(jié)心臟中的心肌信號。脂多糖可促進心肌組織AMPK上游調(diào)節(jié)蛋白(蛋白磷酸酶2A和蛋白磷酸酶2Cα)的表達，隨后AMPK的活化可以改善脂多糖誘導心肌自噬的增加，從而改善小鼠心功能不全，其機制為通過調(diào)控AMPK/mTOR發(fā)揮作用[22]。此外，Zou等[23]認為自噬的削弱可引起心功能障礙并誘導心肌細胞凋亡，脂多糖誘導自噬24 h后心肌細胞開始發(fā)生凋亡，而給予3-甲基腺嘌呤抑制溶酶體的形成或直接沉默Atg5均可導致脂多糖刺激4 h后即出現(xiàn)凋亡。以上數(shù)據(jù)均表明，自噬的增加可以改善脂多糖誘導的心臟毒性。然而也有研究認為，自噬的增加可發(fā)揮損害作用[24]。SD大鼠在脂多糖刺激4 h后，TLR4、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4和LC3的表達水平顯著升高，且電鏡結(jié)果、紅色熒光蛋白-綠色熒光蛋白-LC3轉(zhuǎn)染結(jié)果均顯示脂多糖刺激后自噬表達水平升高[24]。肉桂醛是一種從肉桂精油中提取的主要活性成分，研究發(fā)現(xiàn)其可通過抑制TLR4-還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4信號通路抑制自噬，從而改善脂多糖誘導的SD大鼠心功能不全，表明自噬的減少在脂多糖誘導的心肌損傷中發(fā)揮保護作用[24]。自噬在膿毒血癥誘導的心肌損傷中扮演雙重角色，其可能與動物模型、刺激物的劑量和水平等相關(guān)。

2.3自噬與膿毒性肺損傷 呼吸衰竭通常發(fā)生在膿毒血癥早期，研究表明膿毒血癥早期自噬相關(guān)蛋白表達水平的下降與促凋亡蛋白的表達增加有關(guān)，自噬誘導劑雷帕霉素可誘導自噬增加，從而減輕細胞凋亡[25]。Zhang等[26]發(fā)現(xiàn)，脂多糖可誘導人肺微血管內(nèi)皮細胞通透性增加，乳酸脫氫酶釋放增加，細胞活性降低。當自噬受到抑制后，細胞通透性增加，乳酸脫氫酶釋放得更多且細胞活性降低更為明顯。動物實驗顯示，脂多糖可誘導肺組織水腫，白細胞浸潤和出血，而減少自噬可加重肺組織水腫和白細胞浸潤，提示自噬能夠減輕脂多糖誘導的急性肺損傷，其機制可能與限制肺微血管屏障的損傷有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，一氧化碳通過增強Beclin-1依賴的自噬在膿毒血癥中發(fā)揮保護作用，而敲除Beclin-1后，一氧化碳的保護作用受到抑制[27]。羥基酪醇是一種天然多酚類化合物，它通過促進自噬緩解脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠肺部炎癥[28]?？梢?，自噬在膿毒性肺損傷中發(fā)揮重要作用。4-苯基丁酸鈉鹽是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑，其保護作用體現(xiàn)為通過抑制核因子κB信號通路抑制脂多糖誘導的肺組織中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和通過作用于絲氨酸/蘇氨酸激酶/mTOR通路抑制自噬，其中自噬對細胞生存的影響可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的活化有關(guān)[29]。這些研究提示，自噬對膿毒性肺損傷發(fā)揮雙重作用，其具體機制有待進一步探討。

2.4自噬與膿毒性腎損傷 為驗證自噬在膿毒性腎損傷中的作用，有研究給小鼠進行盲腸穿刺結(jié)扎術(shù)誘導急性腎損傷。電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，膿毒血癥小鼠的自噬溶酶體數(shù)量隨著時間的延長而增加，24 h后自噬溶酶體數(shù)量減少，自噬流受阻，腎損傷加重；給予雷帕霉素誘導自噬后，腎功能得到改善[14]。研究表明，脂多糖誘導的小鼠腎小管細胞自噬增加，而氯喹抑制自噬可加重脂多糖誘導急性腎損傷，同樣腎近端小管特異性敲除Atg7小鼠表現(xiàn)為進一步惡化的脂多糖誘導的急性腎損傷[30]。替西羅莫司或AMPK誘導自噬增加，可保護內(nèi)毒血癥小鼠近端腎小管和改善腎功能[31]。Escobar等[32]發(fā)現(xiàn)，AMPK誘導自噬的活化可減少細胞因子的表達和內(nèi)皮活化，改善腎功能。以上研究提示，自噬在膿毒血癥誘導的急性腎損傷中發(fā)揮保護作用。此外，脂多糖可誘導腎細胞LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達增加，自噬體數(shù)量增加，而給予3-甲基腺嘌呤可抑制自噬流，減少p65磷酸化，導致泛素化核因子κB抑制劑積累，從而使經(jīng)典核因子κB通路的活化受到抑制，提示自噬減少可以降低脂多糖誘導的炎癥反應和改善腎功能，其保護作用可能依賴于泛素化核因子κB抑制劑的積累[33]。自噬對膿毒性腎損傷雙重作用的具體機制尚未清楚，可能與其調(diào)控的眾多信號通路有關(guān)。

3 線粒體自噬與膿毒血癥

雖然大部分情況下，自噬在膿毒血癥中發(fā)揮保護作用，但在應激或病理狀態(tài)下保護細胞的機制尚不清楚。受損和功能障礙的線粒體不僅可以釋放促凋亡因子(細胞色素C)，還是活性氧類產(chǎn)生的主要來源。因此，清除受損的細胞器和功能失調(diào)的線粒體有助于自噬維持細胞和組織的生存[34]。sestrin 2是一種應激誘導蛋白，其能使巨噬細胞誘導線粒體自噬來清除受損的線粒體，從而抑制膿毒血癥誘導的核結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族嘧啶結(jié)構(gòu)域炎癥小體的活化。如敲除sestrin 2的小鼠可檢測到線粒體自噬的缺失，其可引起炎癥小體的過度活化，從而增加膿毒血癥的死亡率[35]。PTEN誘導激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)/Parkin信號通路是線粒體自噬中較為經(jīng)典的通路，PINK1是一種位于線粒體內(nèi)膜中的蛋白激酶，其通常維持在低水平狀態(tài)，一旦被激活即可招募Parkin(具有E3泛素-蛋白連接酶活性的蛋白)轉(zhuǎn)位至受損線粒體的外膜誘導泛素化，泛素化的線粒體在自噬受體調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)下被自噬囊泡包裹成線粒體自噬體，隨后與溶酶體融合并被水解酶降解[36]。脂多糖誘導小鼠急性心肌損傷后，血清中的心肌肌鈣蛋白Ⅰ表達顯著增加，而線粒體膜電位呈下降趨勢，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達增加，線粒體自噬相關(guān)通路PINK1/Parkin在脂多糖刺激6 h前顯著增加，隨后表現(xiàn)為下降趨勢，提示脂多糖誘導心肌損傷的早期，心肌細胞自噬的活化可能發(fā)生于心肌線粒體內(nèi)[37]。脂多糖誘導線粒體去極化增加肝細胞線粒體鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅰ的表達，鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶作為PINK1的激酶，通過作用于PINK1/Parkin信號通路對膿毒血癥發(fā)揮正性調(diào)控機制[38]。以上研究均表明，線粒體自噬在膿毒血癥中扮演重要角色，因此增強線粒體自噬可能成為治療膿毒血癥的一個重要方法。

4 自噬誘導劑在膿毒血癥治療中的價值

在膿毒血癥的晚期自噬受到抑制，自噬活性降低與器官衰竭有關(guān)，提示自噬誘導劑可能預防或治療膿毒血癥[39-41]。Liu等[39]應用雷帕霉素處理膿毒血癥小鼠發(fā)現(xiàn)，小鼠海馬體的磷酸化mTOR表達減少，自噬標志物LC3-Ⅱ、Atg5和Atg7表達增加，p62表達減少。同時，雷帕霉素能通過增強自噬改善小鼠膿毒血癥后的學習能力，表明雷帕霉素可能是治療膿毒癥所致認知損耗的潛在有效藥物。褪黑素是一種內(nèi)源性吲哚胺類激素，它通過誘導自噬增加，從而減少肌酸激酶和肌酸激酶同工酶的表達，減輕心肌結(jié)構(gòu)破壞，改善心功能[40]?？R西平作為一種經(jīng)典抗驚厥藥，其能通過激活自噬降低膿毒血癥誘導肝細胞凋亡，炎癥反應和肝組織損傷，從而改善肝功能[41]。自噬激活在膿毒癥中的保護作用機制尚待闡明，膿毒血癥的潛在治療劑的藥動學或藥效學需要進一步研究，這對膿毒血癥中的器官靶向治療非常重要。

5 小 結(jié)

膿毒血癥是指由不同微生物入侵機體后導致的不良免疫反應，嚴重時可導致多器官功能衰竭和細胞死亡。雖然關(guān)于膿毒血癥的基礎(chǔ)實驗和臨床研究已取得一定進展，但由于其發(fā)病涉及機制眾多且復雜，故仍具有較高的發(fā)病率和死亡率。自噬參與了膿毒血癥的病理生理過程，在大多數(shù)情況下自噬的活化對膿毒血癥發(fā)揮保護作用，自噬誘導劑可改善膿毒血癥誘導的器官損傷。然而也有研究認為自噬的活化發(fā)揮損傷作用[24]，因此其具體機制需進一步探討。自噬作為一種細胞適應機制，在膿毒血癥誘導的多器官功能障礙中發(fā)揮重要作用，未來其將為膿毒血癥的治療提供新靶點。