生殖支原體耐藥及機(jī)制研究進(jìn)展

程燦燦，古裕蓮

(廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 511400)

生殖支原體是目前發(fā)現(xiàn)能獨(dú)立復(fù)制的最小的原核細(xì)胞生物。在其發(fā)現(xiàn)的最初十幾年內(nèi)都少有關(guān)注，這與其生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)要求嚴(yán)格不無(wú)關(guān)系。然而隨著技術(shù)的進(jìn)步，尤其是聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)的應(yīng)用，生殖支原體在性傳播疾病中的致病作用逐漸得到重視。由于分子診斷學(xué)在臨床及科研中的廣泛應(yīng)用，生殖支原體被證實(shí)是男性非淋球菌性尿道炎(non-gonococcal urethritis，NGU)的獨(dú)立致病菌之一[1]，也被認(rèn)為可引起女性的宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎及盆腔炎等疾病[2]，嚴(yán)重影響人們的泌尿生殖健康。生殖支原體主要通過(guò)生殖道黏膜接觸傳播，也有研究發(fā)現(xiàn)生殖道-肛門接觸同樣可以進(jìn)行傳播[1]。國(guó)外的研究發(fā)現(xiàn)，生殖支原體的感染或攜帶多發(fā)生在25歲以后[3]。各國(guó)學(xué)者對(duì)生殖支原體在NGU男性中的患病率進(jìn)行了很多調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在NGU患者中生殖支原體感染率較高，在復(fù)發(fā)性、沙眼衣原體陰性的NGU患者中生殖支原體感染率甚至更高。目前，核酸檢測(cè)是診斷這種病原體感染的最主要手段。生殖支原體具有支原體類的無(wú)細(xì)胞壁的共性，在治療上對(duì)抑制細(xì)胞壁生長(zhǎng)的抗生素?zé)o效，只能選擇干擾蛋白質(zhì)合成或干擾DNA復(fù)制的抗生素。臨床上用于治療生殖支原體感染的有大環(huán)內(nèi)酯類(代表藥物阿奇霉素)、喹諾酮類(代表藥物莫西沙星)、四環(huán)素類(代表藥物多西環(huán)素)和鏈陽(yáng)性菌素類(代表藥物普那霉素)抗生素。不同于其他支原體的是，生殖支原體體外純培養(yǎng)比其他支原體難度大，體外藥物敏感性試驗(yàn)更是耗時(shí)長(zhǎng)且缺乏標(biāo)準(zhǔn)。針對(duì)這類感染，臨床上通常進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性用藥治療。這也可能是生殖支原體感染的治療效果不好且耐藥現(xiàn)象漸增的一大原因?，F(xiàn)對(duì)生殖支原體的耐藥性監(jiān)測(cè)、目前的耐藥現(xiàn)狀及機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 生殖支原體耐藥性監(jiān)測(cè)

由于生殖支原體對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，生長(zhǎng)極其緩慢，從臨床標(biāo)本中分離出的生殖支原體很難在無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。研究表明，應(yīng)用尿道拭子標(biāo)本，單純的SP4培養(yǎng)基初代分離培養(yǎng)時(shí)間為1～3個(gè)月，Vero細(xì)胞培養(yǎng)法大約為3周[4-5]。這也給生殖支原體的體外藥物敏感性檢測(cè)帶來(lái)困難，至今尚未有公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)評(píng)價(jià)臨床標(biāo)本中生殖支原體的藥物敏感性，現(xiàn)有的報(bào)道多數(shù)都是參考其他已有標(biāo)準(zhǔn)的支原體進(jìn)行研究。目前體外藥物敏感性檢測(cè)方法主要有3種：瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法和細(xì)胞培養(yǎng)法。

1.1瓊脂稀釋法 早在1989年，Hannan[6]就已經(jīng)研究了生殖支原體在內(nèi)的多種支原體瓊脂稀釋法藥物敏感性檢測(cè)，并在關(guān)于支原體屬(獸醫(yī))最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)值檢測(cè)的推薦和指南上做了改進(jìn)和詳細(xì)介紹。與傳統(tǒng)的平板稀釋法相似，菌液被接種在含有一系列抗生素(濃度差為2倍)的瓊脂平板上，通過(guò)觀察平板菌落生長(zhǎng)情況判定MIC值。但此研究確定的MIC是能抑制性50%菌落的最低抗生素濃度，而現(xiàn)在普遍認(rèn)為，MIC是能抑制菌落生長(zhǎng)的最低抗生素濃度。也有報(bào)道用E-Test方法在瓊脂上檢測(cè)較準(zhǔn)確的MIC值，但限于成本高昂且生殖支原體在體外生長(zhǎng)耗時(shí)長(zhǎng)(>7 d)[7]，未能在臨床推廣。Bébéar等[8]應(yīng)用瓊脂稀釋法檢測(cè)了生殖支原體對(duì)莫西沙星的體外抗菌活性。近年很少有報(bào)道用瓊脂稀釋法來(lái)檢測(cè)生殖支原體的體外藥物敏感性。

1.2肉湯稀釋法 目前，肉湯稀釋法主要應(yīng)用SP4液體培養(yǎng)基。將抗生素按2倍梯度稀釋加入SP4培養(yǎng)基中，接種一定量的生殖支原體(通常104～106CFU/mL)，置于96微孔板中封板37 ℃孵育3～28 d，MIC值為抑制顏色改變的抗生素最低濃度。盡管這種藥物敏感性試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單易行、成本也相對(duì)不高，但生殖支原體在這種無(wú)生命的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)于緩慢，很難用于臨床常規(guī)檢測(cè)。多數(shù)研究根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)推薦的人型支原體MIC法進(jìn)行生殖支原體的體外藥物敏感性檢測(cè)[9]。楊安波等[10]報(bào)道，應(yīng)用商品化的生殖支原體藥物敏感性試劑盒，評(píng)價(jià)了61例臨床分離生殖支原體菌株對(duì)12種抗生素的敏感性。有研究應(yīng)用一種無(wú)線磁電傳感器裝置，通過(guò)檢測(cè)SP4培養(yǎng)基中生殖支原體生長(zhǎng)時(shí)共振頻率的變化，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生殖支原體的生長(zhǎng)，并應(yīng)用該方法評(píng)價(jià)了四環(huán)素和左氧氟沙星的體外抗菌效果[11]。這種實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)技術(shù)在研究充分的條件下，也許能彌補(bǔ)肉湯稀釋法藥物敏感性培養(yǎng)周期長(zhǎng)這一缺陷。

瓊脂稀釋法是最早用于檢測(cè)生殖支原體體外藥物敏感性試驗(yàn)的方法，其次是應(yīng)用SP4培養(yǎng)基的肉湯稀釋法。盡管這種藥物敏感性方法簡(jiǎn)單易行，成本也相對(duì)不高，但生殖支原體在這種無(wú)生命的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)于緩慢，很難用于臨床常規(guī)檢測(cè)及科學(xué)研究，近年鮮有相關(guān)報(bào)道。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)法 1996年Jensen等[12]首次用Vero細(xì)胞與患者標(biāo)本共培養(yǎng)，進(jìn)行生殖支原體分離培養(yǎng)并用PCR方法監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng)情況。此后，細(xì)胞培養(yǎng)法便被大量應(yīng)用到生殖支原體的初代分離及后續(xù)的體外藥物敏感性試驗(yàn)中。將Vero細(xì)胞培養(yǎng)與TaqMan PCR技術(shù)同時(shí)應(yīng)用于生殖支原體的藥物敏感性監(jiān)測(cè)已成為較成熟的技術(shù)[13-14]。TaqMan PCR是根據(jù)生殖支原體的生殖支原體Pa基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的定量方法，將定量的DNA載量運(yùn)用到抗生素對(duì)生殖支原體的抑菌率計(jì)算中，根據(jù)抑制率達(dá)到99%時(shí)的最低抗生素濃度確定MIC值。Mondeja等[15]對(duì)上述的培養(yǎng)方法做了改進(jìn)，培養(yǎng)成本適當(dāng)降低。Hamasuna等[16]將肉湯稀釋法與細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩者測(cè)得的MIC值結(jié)果相近。相對(duì)于肉湯稀釋法，該法明顯縮短了培養(yǎng)時(shí)間，在科研工作中被廣泛應(yīng)用。但成本相對(duì)提高且對(duì)技術(shù)要求相對(duì)更高，目前也僅限于研究。

耐藥性檢測(cè)除了上述的體外藥物敏感性試驗(yàn)外，臨床治療效果觀察也被視為一個(gè)手段。另外，針對(duì)生殖支原體的耐藥位點(diǎn)進(jìn)行DNA水平的耐藥性檢測(cè)已經(jīng)逐漸被臨床應(yīng)用，與DNA鑒定同時(shí)檢測(cè)即可完成生殖支原體的鑒定與藥物敏感性預(yù)測(cè)，極大解決了生殖支原體培養(yǎng)及體外藥物敏感性試驗(yàn)生長(zhǎng)困難、耗時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題。核酸技術(shù)的迅速發(fā)展為生殖支原體這種人工培養(yǎng)較難的支原體的研究提供了更多的手段，在前述的眾多研究基礎(chǔ)上，開(kāi)展生殖支原體的檢測(cè)及耐藥性監(jiān)測(cè)正在臨床診治和科學(xué)研究中逐漸變得可行。

2 生殖支原體對(duì)四環(huán)素類的耐藥現(xiàn)狀及耐藥機(jī)制

四環(huán)素類藥物的抗菌作用方式是通過(guò)與細(xì)菌核糖體30S亞基的A位點(diǎn)結(jié)合抑制氨?；鵷RNA與核糖體的作用，從而阻斷肽鏈的延長(zhǎng)及蛋白的合成。四環(huán)素、米諾環(huán)素和多西環(huán)素作為代表藥物，在治療支原體感染時(shí)，尤其是解脲支原體，敏感性較好。多西環(huán)素作為治療NGU的一線藥物，在一部分地區(qū)被用來(lái)經(jīng)驗(yàn)性治療生殖支原體所致的泌尿系感染。但從大量的臨床治療發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素在治療生殖支原體感染時(shí)的治愈率低，常延誤正確的治療而發(fā)生持續(xù)感染，并且治愈率還在不斷下降[17]。

由于生殖支原體沒(méi)有針對(duì)體外藥物敏感性的標(biāo)準(zhǔn)，參考肺炎支原體的體外藥物敏感性折點(diǎn)MIC≤2 mg/L計(jì)算，則生殖支原體對(duì)于多西環(huán)素在體外藥物敏感性試驗(yàn)非常敏感，但這與臨床治療效果不符。有學(xué)者提出應(yīng)將生殖支原體的藥物敏感性折點(diǎn)降低至MIC≤0.25 mg/L[18]，應(yīng)用新折點(diǎn)再解釋生殖支原體感染治療失敗就發(fā)現(xiàn)，治療失敗率與生殖支原體對(duì)多西環(huán)素的體外不敏感率幾近吻合，但這一現(xiàn)象尚需進(jìn)一步研究探討。目前，在報(bào)道中僅有發(fā)現(xiàn)生殖支原體對(duì)四環(huán)素及多西環(huán)素在體外的敏感性出現(xiàn)降低及臨床上的治療失敗的現(xiàn)象，并未發(fā)現(xiàn)其相關(guān)的耐藥基因突變。在人型支原體和解脲支原體中檢出的與四環(huán)素類耐藥相關(guān)的tetM基因突變，并未在生殖支原體菌株中檢出，且尚未發(fā)現(xiàn)新的與其相關(guān)的耐藥機(jī)制。鑒于多西環(huán)素治療生殖支原體感染效果不佳，該藥不被推薦作為生殖支原體感染的治療，或者僅在一、二線治療生殖支原體感染的藥物均無(wú)效的情況下使用。

3 生殖支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥現(xiàn)狀及耐藥機(jī)制

細(xì)菌的核糖體50S大亞基是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的作用靶位，主要由23S rRNA和核糖體蛋白(L22核糖體蛋白和L4核糖體蛋白)構(gòu)成。細(xì)菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物有多種耐藥機(jī)制，從對(duì)肺炎支原體和解脲支原體的大量研究中發(fā)現(xiàn)，支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥機(jī)制主要是23S rRNA基因和核糖體蛋白基因L4、L22的基因突變，導(dǎo)致藥物作用靶位改變[19]。國(guó)內(nèi)關(guān)于生殖支原體對(duì)于該類藥物耐藥機(jī)制的研究不多。但國(guó)外的診療指南指出阿奇霉素是臨床上治療生殖支原體感染所致NGU的一線藥物。近年報(bào)道發(fā)現(xiàn)，生殖支原體對(duì)其的耐藥性已相當(dāng)嚴(yán)重了，且耐藥率還在不斷上升[20]。

從臨床標(biāo)本中分離或檢測(cè)到的大量阿奇霉素耐藥菌株，攜帶23S rRNA基因2058和或2059位點(diǎn)突變[21-22]，這兩個(gè)位點(diǎn)位于該基因Ⅴ區(qū)。其單核苷酸突變類型，在生殖支原體中的檢出率由高到低依次為 A2058G，A2059G，A2058T，A2058C，A2059C和A2059T[18]。除了上述兩個(gè)位點(diǎn)，23S rRNA其他位點(diǎn)突變也可能導(dǎo)致耐藥，但少有報(bào)道。目前，23S rRNA基因的2058和2059堿基位點(diǎn)突變被普遍認(rèn)為與生殖支原體抵抗阿奇霉素的機(jī)制有關(guān)，最新的治療及診斷指南都將該位點(diǎn)的檢測(cè)推薦應(yīng)用于NGU患者的診治[23-24]。有些地區(qū)早在2008年就開(kāi)始對(duì)臨床標(biāo)本常規(guī)檢測(cè)生殖支原體的大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因[14]。在北歐部分國(guó)家的調(diào)查研究顯示，23S rRNA的突變率在生殖支原體感染的患者標(biāo)本中達(dá)41%[25]，而加拿大有47.3%[26]，新西蘭有72%[27]。如此高的突變率，研究者認(rèn)為可能是該地區(qū)常規(guī)用阿奇霉素單劑1 g治療生殖支原體感染患者，造成耐藥菌株的篩選，其他的研究也支持此觀點(diǎn)[28-29]。

新藥交沙霉素和普那霉素被用來(lái)治療多重耐藥的生殖支原體感染，但僅在有限的地區(qū)使用[2,23]，近年來(lái)研究顯示，這些藥物也出現(xiàn)了臨床治療失敗的案例。Guschin等[30]在1例久治不愈的生殖支原體感染患者中發(fā)現(xiàn)了23S rRNA基因的2062位堿基由A突變成了T的生殖支原體菌株，這一突變位點(diǎn)在肺炎支原體和人型支原體中報(bào)道與交沙霉素高水平耐藥有關(guān)，與帶有十六碳內(nèi)酯環(huán)的藥物耐藥性相關(guān)，而并不影響十五碳內(nèi)酯環(huán)的藥物的敏感性。因阿奇霉素與交沙霉素內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)上的差異，理論上A2062T位點(diǎn)不參與抵抗阿奇霉素的機(jī)制。

L22與L4核糖體蛋白形成的環(huán)形結(jié)構(gòu)與大環(huán)內(nèi)酯類藥物結(jié)合空間位置有關(guān)，其內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的氨基酸位點(diǎn)是L22為Arg88-Ala93，L4為Gln62-Gly66(參考大腸埃希菌相應(yīng)蛋白中的氨基酸位置)[31]。該區(qū)域的氨基酸改變可能導(dǎo)致核糖體的空間構(gòu)象改變，進(jìn)而導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯類藥物不能與靶位結(jié)合而失去抗菌作用。Jensen等[14]發(fā)現(xiàn)4株L22基因突變導(dǎo)致的單個(gè)氨基酸發(fā)生替換，但位點(diǎn)均不在上述位置。其他關(guān)于L4突變的研究未發(fā)現(xiàn)明確的證據(jù)證明與大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性相關(guān)[19]。但在肺炎支原體耐藥性研究中發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白L4和L22突變僅可能導(dǎo)致其低水平耐藥，常與23S rRNA基因Ⅴ區(qū)突變同時(shí)存在。

4 生殖支原體對(duì)喹諾酮類的耐藥現(xiàn)狀及耐藥機(jī)制

喹諾酮類藥物中的莫西沙星是治療生殖支原體感染的二線藥物，通常用于對(duì)阿奇霉素治療失敗病例。隨著莫西沙星在治療中的應(yīng)用，耐喹諾酮類的生殖支原體菌株不斷增多，在許多地區(qū)已經(jīng)出現(xiàn)了與大環(huán)內(nèi)酯類相同的耐藥趨勢(shì)[32]。在亞太地區(qū)和英國(guó)都有莫西沙星治療生殖支原體感染失敗的案例，前者的發(fā)生率更高[33-34]。西他沙星被認(rèn)為與莫西沙星有著相同的抗菌效果，在日本等地有較多的臨床應(yīng)用。而氧氟沙星和左氧氟沙星的體外及體內(nèi)抗生殖支原體效果均較弱，未被推薦作為臨床治療生殖支原體感染用藥[35]。

生殖支原體對(duì)喹諾酮類藥物耐藥的機(jī)制與喹諾酮耐藥決定區(qū)(the quinolone resistance-determining region，QRDR)突變有關(guān)。QRDR包括旋轉(zhuǎn)酶gyrA、gyrB基因和拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅣparC、parE基因的某些區(qū)域。喹諾酮類藥物通過(guò)與酶蛋白-DNA復(fù)合體結(jié)合，阻止DNA復(fù)制，進(jìn)而達(dá)到抗菌目的。研究發(fā)現(xiàn)，臨床菌株中parC的單核苷酸突變所致拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ氨基酸改變與生殖支原體對(duì)莫西沙星和西他沙星耐藥高度相關(guān)且發(fā)生率漸增(37%～47%)，其常見(jiàn)氨基酸突變位點(diǎn)及突變模式為S83I、S83N、D87N、D87Y和D87H[34,36-39]，其中以S83I和S83N最為重要。其次報(bào)道較多的是gyrA基因突變，所致的旋轉(zhuǎn)酶氨基酸位點(diǎn)及突變模式為D87N[40]?？偟膩?lái)說(shuō)，parC或gyrA發(fā)生單核苷酸突變時(shí)可造成生殖支原體對(duì)喹諾酮類藥物敏感性明顯降低，而同時(shí)攜帶上述兩種基因的單核苷酸突變時(shí)，生殖支原體通常會(huì)對(duì)喹諾酮類藥物顯示出高水平耐藥。研究還發(fā)現(xiàn)，不同的突變模式可能涉及不同藥物的敏感性，如parC的突變模式S83I對(duì)莫西沙星的MIC值有明顯影響，而對(duì)西他沙星的MIC值影響稍小[34,40]。QRDR的另外兩個(gè)區(qū)域parE和gyrB，其突變位點(diǎn)并未被大量研究，主要原因可能是其突變發(fā)生率較低。僅有的少量研究顯示，當(dāng)其與parC上述突變聯(lián)合存在時(shí)，常導(dǎo)致對(duì)喹諾酮類的高水平耐藥[32]。臨床隨訪研究顯示，QRDR突變的出現(xiàn)可能并不是由于治療生殖支原體時(shí)藥物篩選的結(jié)果[41]，不同突變位點(diǎn)的出現(xiàn)及對(duì)其他喹諾酮藥物的影響仍在研究中。

5 小 結(jié)

目前，生殖支原體被認(rèn)為是僅次于沙眼衣原體的NGU致病菌，在體外的常規(guī)培養(yǎng)及藥物敏感性監(jiān)測(cè)均較困難，臨床上又快速出現(xiàn)了對(duì)一線、二線抗生素的抵抗，使得治療難度加大。國(guó)內(nèi)外對(duì)生殖支原體耐藥及機(jī)制研究已從之前體外藥物敏感性方向轉(zhuǎn)向?qū)ζ銬NA水平方向，并主要集中對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類耐藥機(jī)制的上。研究其耐藥機(jī)制及開(kāi)發(fā)新的更有效的抗生素是目前生殖支原體研究中亟待解決的問(wèn)題。鑒于目前的研究結(jié)果，建議對(duì)于初診NGU患者，應(yīng)使用PCR檢測(cè)是否為生殖支原體感染，并對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥相關(guān)的23S rRNA基因位點(diǎn)及喹諾酮類耐藥相關(guān)的parC，gyrA基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果和治療指南再調(diào)整合理的治療方案，避免經(jīng)驗(yàn)性用藥治療，以防生殖支原體治療失敗或持續(xù)感染，甚至造成對(duì)耐藥菌株的篩選。