何首烏的入血成分、藥動學(xué)及肝毒性代謝組學(xué)研究進(jìn)展

蒙鐘經(jīng)，丁選勝

（中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210009）

何首烏（polygoni multi fl ori radix）為蓼科植物何首烏Polygonum multi fl orumThunb.的干燥塊根，是一味傳統(tǒng)的補益類中藥，一直以來其與人參、靈芝、蟲草并稱為我國中藥寶庫中的“四大仙草”，并被廣泛使用。近年來，有關(guān)于何首烏及其制劑的不良反應(yīng)報道越來越多，引起了研究者和公眾的極大關(guān)注。何首烏及其制劑的不良反應(yīng)主要有肝損傷、胃腸道反應(yīng)、過敏反應(yīng)，其中肝損傷最為常見，主要表現(xiàn)為乏力、納差、黃疸、總膽紅素和轉(zhuǎn)氨酶異常升高等，以急性肝細(xì)胞損傷型為主，停藥后大部分患者可恢復(fù)，但也可能導(dǎo)致肝衰竭、慢性肝炎、肝硬化，甚至死亡[1-3]。自2005年9月原國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布含何首烏制劑白蝕丸引起的肝損害通告以來，研究人員從多種角度探討了何首烏致肝損傷的原因，主要包括長期用藥、藥不對證、藥材產(chǎn)地、炮制方法、飲片規(guī)格、復(fù)方配伍差異以及部分患者為肝損害易感人群等[4-10]。本文對何首烏入血成分、藥動學(xué)、肝毒性代謝組學(xué)的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為其不良反應(yīng)的研究提供參考。

1 何首烏入血成分研究

藥物作用發(fā)揮的效應(yīng)成分一般來自入血原型成分或其代謝產(chǎn)物。不論生首烏還是制首烏，在一定條件下均能對機體產(chǎn)生肝損傷作用，說明它們均含有肝毒性成分。肝損傷的發(fā)生可能是毒性成分直接損傷肝細(xì)胞或在肝臟中被轉(zhuǎn)化為肝毒性成分所致，故研究何首烏的入血成分，不僅可為藥理活性物質(zhì)的篩選提供參考，對毒性成分的確定也有一定的價值。

陳紹文等[11]采用大鼠灌胃的方法，給藥劑量為2 g · kg-1· d-1，連續(xù) 7 d，分別建立生首烏、制首烏灌胃大鼠血清的高效液相指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)炮制前后何首烏藥液灌胃大鼠與空白大鼠的血藥含量圖譜顯著不同，并在制首烏含藥血清指紋圖譜中找到一個可能為藥效作用的特征峰（保留時間為35 min）；該研究還認(rèn)為生首烏經(jīng)炮制加工后，化學(xué)成分不僅在含量上有變化，種類也發(fā)生了改變，故生首烏、制首烏入血成分的含量和種類也存在差異。另有研究表明，生首烏炮制后，沒食子酸的含量顯著升高，大黃素和大黃素甲醚等游離蒽醌含量升高，二苯乙烯苷含量下降，且新增了5-羥甲基糠醛、2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4氫-吡喃-4-酮等麥拉德反應(yīng)（Maillard reaction）產(chǎn)物[12-13]。高效液相指紋圖譜中各出峰物質(zhì)的定性鑒別需對照品，因此，更多入血成分信息的獲取需要結(jié)合定性、定量分析方面具有優(yōu)勢的質(zhì)譜。另一項研究中，Lin等[14]采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-QTOF-MS）分析大鼠灌胃生首烏醇提取物后的血漿樣本，檢測出23個入血成分，其中16個是生首烏原型成分，有二苯乙烯-O-己糖、決明蒽酮-O-（丙二?；?己糖、對羥基苯甲醛、大黃素及大黃素衍生物等，另外7個化合物分別為二苯乙烯苷葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物（3個）、大黃素葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物（2個）、決明蒽酮及決明蒽酮葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物。Zhang等[15]采用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜（HPLC-LTQ-Orbitrap MS）分析給藥生首烏后大鼠血漿和尿液中的藥源性成分，共檢測到43種化合物，原型成分主要有反式二苯乙烯苷、順式二苯乙烯苷、大黃素、何首烏乙素、5-羧甲基-7-羥基-2-甲基色原酮，其余為代謝產(chǎn)物。在灌胃生首烏提取物的大鼠肝臟中，郭忠會等[16]檢測到11個藥源性成分，包括5個原型成分：大黃素、反式二苯乙烯苷、決明蒽酮-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃素-8-O-（6'-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖苷；代謝產(chǎn)物6個：大黃素葡萄糖醛酸化（2個）、大黃素葡萄糖羥基化、大黃素葡萄糖甲基化、大黃素葡萄糖氧化乙?；⒋簏S素葡萄糖羥化甲基化。

2 何首烏藥動學(xué)研究

二苯乙烯苷（2，3，5，4'-四羥基-二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，TSG）、大黃素（1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌，emodin）、大黃酸（1，8-二羥基-3-羧基蒽醌，rheic acid）既是何首烏的主要化學(xué)成分，又是其活性成分，藥動學(xué)研究主要圍繞這幾種成分進(jìn)行。

2.1 基于活性單體的何首烏藥動學(xué)研究

2.1.1 二苯乙烯苷 TSG的主要吸收部位是胃，在小腸內(nèi)幾乎不吸收，在胃內(nèi)以原型藥物的形式吸收入血，在大鼠體內(nèi)的半衰期較短，分布及消除較快，以心、腎、肝分布較高[17-18]。TSG灌胃后，在大鼠體內(nèi)呈二室開放模型，達(dá)峰時間（Tmax）為40 min，峰濃度（Cmax）為31.9 mg · L-1[18]。TSG在肝臟中經(jīng)過Ⅱ相代謝，產(chǎn)生多種葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物，且主要以葡萄糖醛酸結(jié)合物的形式經(jīng)膽汁排泄，經(jīng)十二指腸在腸道菌和酶的作用下轉(zhuǎn)化為原型，被重吸收入血，故可導(dǎo)致TSG血藥濃度出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象[19]。機體功能狀態(tài)可影響藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝及排泄。王春英等[19]研究不同高血脂癥模型與正常大鼠給藥TSG后的體內(nèi)藥動學(xué)行為，發(fā)現(xiàn)與正常大鼠相比，TSG在Triton WR-1339高脂血癥模型大鼠及食糜性高脂血癥模型大鼠的體內(nèi)過程均發(fā)生了明顯變化：與正常大鼠相比，在 Triton高脂血癥模型大鼠和食糜性高脂血癥模型大鼠體內(nèi)TSG生物利用度均明顯增加；與正常大鼠相比，在Triton高脂血癥模型大鼠體內(nèi)，TSG在腎臟中的分布有所減少，在其他臟器的分布均無明顯變化，而在食糜性高脂血癥模型大鼠體內(nèi)，TSG在心臟中的分布明顯減少，在肝臟、脾臟和腎臟中的分布均明顯增加。

2.1.2 大黃素 大黃素在十二指腸和空腸有較多吸收，同時十二指腸、空腸的代謝酶對大黃素的水解作用較強，在結(jié)腸和回腸上的水解作用則相對較弱[20]。大黃素在體內(nèi)的主要代謝途徑為尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（uridine 5'-diphosphate glucuronosyltransferase，UGT）代謝，代謝速度快，而排泄速度較慢，生物利用度低。劉 薇[20]研 究 發(fā) 現(xiàn)，UGT1A1、UGT1A8、UGT1A9、UGT1A10是最重要的可代謝大黃素的幾種酶。UGT1A1在肝腸中均有分布，UGT1A9只在肝中表達(dá)，而UGT1A10、UGT1A8只在腸中表達(dá)，且UGT1A10對大黃素的代謝最快。大黃素的生物利用度低，可能是由于大黃素在腸道易被UGT代謝成葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物，后者作為多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance associated protein，MRP）家族的底物，易被腸道Caco-2細(xì)胞膜上的外排蛋白排出；另有研究認(rèn)為性別因素可影響大黃素在體內(nèi)的吸收、分布和蓄積，劉薇等[20-22]發(fā)現(xiàn)雌性大鼠的大黃素吸收量和代謝速率較雄性大鼠高，而排泄的代謝產(chǎn)物卻少于雄性大鼠，說明雌性大鼠蓄積大黃素的時間和含量多于雄性大鼠，這些差異可能與不同性別大鼠相關(guān)代謝酶的分布或外排蛋白差異有關(guān)。Wu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，大黃素藥動學(xué)過程在時間和性別上均存在差異，隨著給藥時間的延長，大黃素在雌性大鼠體內(nèi)的暴露水平和致肝損傷程度高于雄性大鼠；結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，大黃素代謝的相關(guān)位點為UGT2B基因的rs11726899位點，在HepG2細(xì)胞中敲除UGT2B7基因后可使大黃素葡萄糖醛酸化水平顯著降低，且會增加大黃素的細(xì)胞毒性。

2.1.3 大黃酸 大黃酸屬于易吸收化合物，在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸中的吸收均較強，以空腸段吸收最強[24-25]。大黃酸原型成分及其代謝產(chǎn)物主要經(jīng)肝、腎排泄。李恩澤等[26]發(fā)現(xiàn)大黃酸的葡糖醛酸化代謝在大鼠和人肝微粒體間有明顯的種屬差異：在大鼠的肝微粒體中生成2個無反應(yīng)活性的羥基葡糖醛酸代謝產(chǎn)物，而在人肝微粒體中生成有反應(yīng)活性的乙酰葡糖醛酸代謝產(chǎn)物，提示在人體中大黃酸的代謝活化較大鼠更為嚴(yán)重。

2.2 基于藥材的何首烏藥動學(xué)研究

早期何首烏的藥動學(xué)研究側(cè)重于其主要成分二苯乙烯苷、大黃素、大黃酸等單體的藥動學(xué)研究。由于何首烏成分復(fù)雜，成分間可能存在相互作用，單體的藥動學(xué)過程與以藥材為整體的藥動學(xué)過程可能存在明顯差異。

Zhang等[27]發(fā)現(xiàn)生首烏不同提取部位（游離蒽醌組分、多糖和鞣質(zhì)組分、二苯乙烯苷組分、結(jié)合蒽醌組分、總提物）中的TSG、大黃素、大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在大鼠體內(nèi)的Cmax、Tmax、曲線下面積（AUC）、半衰期（T1/2）和體內(nèi)平均滯留時間（MRT）等藥動學(xué)參數(shù)均有明顯不同；給藥不同提取部位對細(xì)胞色素P450如CYP3A4、CYP2C19、CYP2E1以及UGT1A1等藥物代謝酶可產(chǎn)生不同的抑制作用，提示不同提取部位對藥物代謝酶抑制作用可能是其肝毒性和藥動學(xué)差異的原因。Ma等[28]發(fā)現(xiàn)二苯乙烯苷可影響大黃素的體內(nèi)過程，增加大黃素的AUC、Cmax和T1/2，且能抑制大黃素的葡萄糖酸化水平，使得大黃素在體內(nèi)的暴露水平增加，這可能與二苯乙烯苷抑制了大黃素相關(guān)代謝酶的表達(dá)有關(guān)。大鼠長期大劑量給予生首烏提取物后，TSG和大黃素之間的相互作用可導(dǎo)致大黃素在體內(nèi)蓄積，發(fā)生肝損傷[29]。因此，可以認(rèn)為何首烏在一定劑量下起治療作用，超出范圍則產(chǎn)生毒性。

3 何首烏肝毒性代謝組學(xué)研究

隨著代謝組學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展，近年來，國內(nèi)已有很多學(xué)者將其應(yīng)用到何首烏肝毒性研究中。采用代謝組學(xué)研究思路，通過色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析生物樣品中的內(nèi)源性代謝物，借助模式識別和專家系統(tǒng)等計算分析方法對代謝物譜加以分析，可尋找何首烏致肝損傷的生物標(biāo)志物及相關(guān)代謝通路。

Dong等[30]采用液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）分別檢測給予42 d大鼠生首烏、制首烏的膽汁和血清中的膽酸、鵝去氧膽酸、牛黃膽酸、甘氨膽酸、甘氨鵝去氧膽酸、去氧膽酸、甘氨去氧膽酸、熊去氧膽酸和豬去氧膽酸9種膽汁酸的含量，發(fā)現(xiàn)這些膽汁酸的紊亂與何首烏誘導(dǎo)的肝損傷有關(guān)，膽汁中的甘氨去氧膽酸與血清中的豬去氧膽酸在肝損傷發(fā)生時含量降低尤其明顯，認(rèn)為其可輔助傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)氨酶作為何首烏致藥源性肝損傷的診斷生物標(biāo)志物。

Zhang等[31]通過氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）比較了正常大鼠與給藥生首烏不同提取物（乙醇提、水提）大鼠的血清、肝組織代謝物的差異，應(yīng)用主成分分析法（PCA）和偏最小二乘判別分析法（PLS-DA）分析其代謝譜，發(fā)現(xiàn)與正常大鼠相比，給藥生首烏乙醇提取物和生首烏水提取物大鼠的血清和肝臟組織中的代謝物均出現(xiàn)紊亂，認(rèn)為生首烏的乙醇提取物、水提取物均可引起大鼠體內(nèi)能量代謝、氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝紊亂，且乙醇提取物誘導(dǎo)的紊亂程度比水提取物更嚴(yán)重，證實了生首烏醇提取物毒性大于水提取物的事實。Li等[32]通過非靶向代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激狀態(tài)下，給藥生首烏乙酸乙酯提取物（主要含有TSG和微量大黃素-8-O-葡萄糖苷）可對大鼠肝臟造成明顯的損傷，并鑒定了21種差異表達(dá)的生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)這些代謝物主要涉及三羧酸循環(huán)和鞘脂代謝這2個途徑。Zhang等[33]通過尿代謝組學(xué)方法研究由生首烏和制首烏引起的代謝紊亂，發(fā)現(xiàn)給藥生首烏的大鼠肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，而制首烏無此現(xiàn)象；并鑒定了在生首烏給藥組尿液中差異表達(dá)的16種潛在生物標(biāo)志物，包括吡哆胺、4-吡哆酸、檸檬酸等代謝物，通路分析結(jié)果表明，與何首烏肝毒性相關(guān)的通路有維生素B6代謝、色氨酸代謝和檸檬酸循環(huán)等。馬致潔等[34]采用LC-MS測定給藥生首烏大鼠的動態(tài)血清代謝指紋譜，共篩選得到6個潛在生物標(biāo)志物，即油酸酰胺（oleamide）、溶血性磷脂酰膽堿[lysoPC（16 : 0）]、白三烯 A4（leukotriene A4）、反式-十四碳-2-烯酸（trans-tetra-dec-2-enoic acid）、雙氫皮質(zhì)醇（dihydrocortisol）和 7α-羥基去氫表雄酮（7α-hydrox ydehydroepiandrosterone）。Xia等[35]在非靶向代謝組學(xué)研究中采用GC-MS法篩選出了灌胃生首烏醇提物大鼠血清中的10個差異表達(dá)的代謝物，包括甘氨酸、13-二十碳烯酸、乳酸、十八烷酸、脯氨酸、2-糠酸、膽固醇、丙氨酸、二十二碳六烯酸和賴氨酸，認(rèn)為這些標(biāo)志物參與了氨基酸代謝、能量代謝和氧化應(yīng)激損傷。

二苯乙烯苷在自然界中以反式構(gòu)型存在，自然光/紫外線照射下可部分轉(zhuǎn)化為順式[36]。二苯乙烯苷結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化與何首烏的肝毒性有關(guān)，Li等[37]研究發(fā)現(xiàn)，順式二苯乙烯苷致大鼠特異質(zhì)肝損傷相關(guān)的代謝通路主要有精氨酸代謝、鳥氨酸代謝、維生素B6代謝和嘧啶代謝等。另有代謝組學(xué)分析結(jié)果表明，大黃素能擾亂細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽和脂肪酸的代謝，并在細(xì)胞培養(yǎng)基中檢測出大黃素-半胱氨酸加合物，且其含量隨著大黃素濃度的增加而增加[38]。因此，研究者基于以上研究提出了大黃素致肝損傷機制的新觀點：大黃素-半胱氨酸加合物的形成很可能是大黃素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞代謝紊亂的主要原因。

4 結(jié)語與展望

何首烏主要含有二苯乙烯苷類、蒽醌類、卵磷脂類、鞣質(zhì)和微量元素等多種化學(xué)成分，但迄今引起肝損傷不良反應(yīng)的毒性成分尚未明確。二苯乙烯苷類、蒽醌類及鞣質(zhì)在何首烏成分中所占比例較大，成為毒性成分首要考慮對象[39]。TSG、大黃素及其衍生物是何首烏的主要入血成分，TSG與大黃素間的相互作用使大黃素在體內(nèi)蓄積，長期大量使用何首烏會增加肝損傷風(fēng)險。大黃素等蒽醌類成分在腸道內(nèi)經(jīng)UGT相關(guān)酶代謝，其分子的空間取向和特定官能團(tuán)可影響UGT1A1的活性，如順式-大黃素-大黃素二蒽酮、反式-大黃素-大黃素二蒽酮和大黃素-8-O-葡萄糖苷對該酶有顯著的抑制作用[40]。入血成分分析與主要成分的藥動學(xué)研究有助于研究者確定藥物效應(yīng)成分及其體內(nèi)過程，對藥物的臨床應(yīng)用有指導(dǎo)意義。目前，少見何首烏的毒代動力學(xué)研究，毒代動力學(xué)作為藥動學(xué)和毒理學(xué)的交叉學(xué)科，能夠為何首烏的安全性評價、毒性成分的毒理作用和機制提供更多的依據(jù)。

多位研究者運用代謝組學(xué)技術(shù)分析何首烏致肝損傷大鼠的血液、尿液、膽汁及肝組織的代謝物差異，并篩選出差異性代謝物及其代謝通路。肝毒性代謝組學(xué)研究結(jié)果一定程度上可揭示何首烏誘導(dǎo)肝臟損傷的作用機制，提供可用于早期發(fā)現(xiàn)何首烏肝損傷的輔助臨床診斷的生物標(biāo)志物，對何首烏肝毒性機制研究，臨床早期發(fā)現(xiàn)、診斷、治療和預(yù)后評判具有潛在的應(yīng)用價值和意義。

通過多年的研究探討，對何首烏致肝損傷的認(rèn)識有了一些進(jìn)展，但其確切的肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)及毒性機制仍未闡明，且現(xiàn)有的基礎(chǔ)研究較少與臨床實際結(jié)合，是亟待解決的重點難點問題。另外，以往的何首烏肝毒性研究中，多以正常動物為研究對象，有待結(jié)合中醫(yī)臨床用藥的實際。