納米材料在光動力療法腫瘤治療中的應(yīng)用進展

張繼雙，周林

（南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023）

光動力療法（photodynamic therapy，PDT）是一種利用光進行疾病治療的重要療法。PDT作用機制是光源激發(fā)光敏劑（photosensitizer，PS）后，其由基態(tài)躍遷至單重激發(fā)態(tài)，隨后，單重激發(fā)態(tài)的光敏劑經(jīng)系間竄越至三重激發(fā)態(tài)，三重激發(fā)態(tài)的PS與氧氣或生物分子發(fā)生能量傳遞或電子轉(zhuǎn)移，生成各種活性氧（reactive oxygen species，ROS）或自由基，從而損傷蛋白質(zhì)及核酸等生物分子，發(fā)揮治療活性（見圖1）[1]。1972年，Diamond 發(fā)現(xiàn)卟啉的光敏活性可以殺死腫瘤細胞，開啟了PDT腫瘤治療序幕。如今，PDT已廣泛用于腫瘤的臨床治療。然而，PDT的深部實體腫瘤治療仍面臨以下問題：1）已臨床應(yīng)用的PS分子的激發(fā)波長多處于可見光區(qū)或紫外光區(qū)[2]，該波段范圍內(nèi)光源組織穿透深度有限[3]。2）由于腫瘤生長快速，其血管組織發(fā)育不全，導(dǎo)致實體腫瘤部分區(qū)域常呈現(xiàn)乏氧微環(huán)境（氧分壓＜5 mmHg）[4]，而氧氣是PDT三要素之一，乏氧微環(huán)境必定影響PDT療效。3）與正常細胞相比，腫瘤細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）濃度很高（＞10 mmol · L-1），高濃度的GSH勢必消耗PDT產(chǎn)生的ROS，降低PDT治療效果[5]。4）有機小分子PS腫瘤靶向性、光穩(wěn)定性及ROS產(chǎn)生能力亟待提升[2]。因此，尋求有效方法解決上述問題，是PDT實現(xiàn)深部實體腫瘤治療的基礎(chǔ)。

近年來，隨著制備技術(shù)及檢測手段的不斷進步，納米技術(shù)發(fā)展迅速，納米材料在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用范圍不斷拓展。近年來，許多新型納米材料表現(xiàn)出優(yōu)良的光學(xué)、催化活性及ROS產(chǎn)生能力等性能，被廣泛應(yīng)用于PDT腫瘤治療領(lǐng)域。本文將從光、PS及氧氣三要素角度，簡述近年來為解決PDT深部實體腫瘤治療面臨的問題，基于PDT三要素設(shè)計合成的納米材料及其在PDT腫瘤治療中的研究進展。

1 光

光的組織穿透深度與其波長密切相關(guān)，多數(shù)PS激發(fā)波長在紫外光或可見光區(qū)，然而，這些波段光源組織穿透深度淺，無法滿足深部腫瘤治療要求。因此，PDT深部腫瘤治療效果有限。

與紫外光或可見光相比，近紅外光（700 ～ 1 300 nm）有著更深的組織穿透能力，更加符合PDT治療體內(nèi)深部實體腫瘤的要求?；诖?，自2007年以來，具有吸收近紅外光、發(fā)出可見光性質(zhì)的上轉(zhuǎn)換納米材料在PDT領(lǐng)域的應(yīng)用研究悄然興起。稀土離子由于其f價電子層結(jié)構(gòu)具有豐富且穩(wěn)定的電子能級而常作為上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的發(fā)光中心[6]。稀土離子摻雜的上轉(zhuǎn)換納米材料可被近紅外光激發(fā)，產(chǎn)生紫外-可見-近紅外上轉(zhuǎn)換發(fā)射光。通過控制稀土離子的種類與組成，可以獲得具有不同發(fā)光光譜的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料。利用共價鍵、氫鍵、自組裝等原理將上轉(zhuǎn)換材料與PS分子組合后，選用組織穿透深度強的近紅外光激發(fā)上轉(zhuǎn)換材料，其產(chǎn)生的可見光區(qū)或紫外光區(qū)的上轉(zhuǎn)換熒光可間接激發(fā)PS產(chǎn)生ROS，實現(xiàn)PS的間接長波敏化[7]（見圖2）。此外，因上轉(zhuǎn)換納米材料激發(fā)光位于能量較低的近紅外區(qū)，不僅具有良好的組織穿透性能，而且對生物體組織的損傷也很小，安全性較佳[8]。

圖 2 基于上轉(zhuǎn)換材料實現(xiàn)光敏劑近紅外光間接敏化機制圖Figure 2 Schematic presentation of near infrared lighttriggered indirect sensitization of photosensitizer based on upconversion nanoparticles

凌代舜教授課題組將PS二氫卟吩e6（chlorin e6，Ce6）與具有pH響應(yīng)功能的高分子聚合物偶聯(lián)后，與上轉(zhuǎn)換納米材料NaYF4:Yb,Er@CaF2及表面活性劑Pluronic F68聚合組裝為復(fù)合納米藥物（PPNs）。在血液傳輸pH條件（pH=7.4）下，復(fù)合納米藥物中的Ce6因聚集而呈現(xiàn)失活態(tài)，在腫瘤微環(huán)境（pH = 6.5）及進入腫瘤細胞的內(nèi)涵體或溶酶體的酸性環(huán)境（pH = 5.5）中，復(fù)合納米藥物解聚，Ce6恢復(fù)活性；經(jīng)980 nm激光激發(fā)后，NaYF4:Yb,Er@CaF2產(chǎn)生675 nm上轉(zhuǎn)換熒光，進而激發(fā)Ce6產(chǎn)生ROS，殺傷腫瘤細胞。皮下移植瘤模型實驗中，瘤內(nèi)注射 PPNs（2 g · L-1，100 μL）后，980 nm 激光（2.5 W · cm-2，10 min）光照腫瘤組織，與對照組相比，14 d治療后，其腫瘤組織體積為對照組1/10以下[9]。

除上轉(zhuǎn)換材料外，近年來，長余輝發(fā)光材料也被廣泛用于PDT腫瘤治療，通過提高光源利用效率，增強PDT治療效果。長余輝發(fā)光材料可儲存被外部光源激發(fā)時產(chǎn)生的激發(fā)能，并在外部光源激發(fā)停止后逐漸將能量以光的形式緩慢釋放，實現(xiàn)短時激發(fā)和長時間發(fā)射熒光的獨特光學(xué)效應(yīng)。PDT過程可利用該材料產(chǎn)生的長效熒光作為光源，經(jīng)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ fl uorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）， 間 接 持 續(xù) 激 發(fā)PS，產(chǎn)生ROS，從而殺滅腫瘤細胞，提高光能利用效率，增強PDT效果（見圖3）。

圖 3 基于長余輝發(fā)光材料的光敏劑短時光照后的持續(xù)敏化機制圖Figure 3 Continuous sensitization mechanism of photosensitizer based on short period of illumination and long afterglow luminescent material

陳小元教授課題組將長余輝發(fā)光材料ZnGa:Cr與聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）復(fù)合，形成具有長余輝發(fā)光功能的復(fù)合體（ZGC PL）并植入腫瘤組織（10 g · L-1，20 μL）作為內(nèi)源光源；尾靜脈注射光敏藥物光克洛[2-（1-hexyloxyethyl）-2-devinyl pyropheophorbide-alpha，HPPH，1 g · L-1，150 μL] 后， 僅在第1天及第8天（治療時間14 d）使用白光LED（400 ～ 750 nm）光照腫瘤部位15 min。結(jié)果顯示，ZGC PL植入物可儲存激發(fā)能，停止光照后作為內(nèi)源持續(xù)發(fā)光光源為PDT提供光源，高效利用光能，14 d 治療期內(nèi)皮下移植瘤生長被完全抑制，且腫瘤細胞發(fā)生顯著的凋亡及壞死[10]。許多長余輝發(fā)光材料光照后具有長時間的持續(xù)發(fā)光性能，如潘正偉教授課題組合成的Zn3Ga2Ge2O10:Cr長余輝發(fā)光材料被單次短時激發(fā)后，可在650 ～ 1 000 nm波段范圍內(nèi)實現(xiàn)超過360 h的長余輝發(fā)光[11]。但受限于余輝發(fā)光強度及生理環(huán)境對余輝發(fā)光效果的影響，目前，長余輝材料體外單次激發(fā)后，活體內(nèi)腫瘤治療時完全利用余輝發(fā)光作為光源，無需再次光照的PDT治療體系研究鮮見。因此，還需不斷探索在生理條件下，能夠高強度、長時間發(fā)出余輝熒光的新型材料。

此外，近年來，具有生物自發(fā)光功能的PDT治療研究興起。生物自發(fā)光是一種特殊的化學(xué)發(fā)光，其作用機制是在一定條件下，特定酶催化底物發(fā)生氧化釋放光子。生物發(fā)光將化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽艿男士蛇_到100%。生物發(fā)光應(yīng)用于PDT的過程就是利用生物發(fā)光體系（供體）產(chǎn)生的光與PS（受體）發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，進而敏化PS產(chǎn)生ROS，殺滅腫瘤細胞。吳長鋒教授課題組利用PLGA合成共載熒光素酶（luciferase）、熒光素底物（D-熒光素）及光敏藥物玫瑰紅（rose bengal，RB）的復(fù)合納米體系（PLGARB）；該體系進入腫瘤細胞后，在三磷酸腺苷（adenosine triphophate，ATP）及Mg2+存在條件下，熒光素酶催化D-熒光素發(fā)光，激發(fā)RB產(chǎn)生ROS，殺滅腫瘤細胞；PLGA-RB與D-熒光素利用生物發(fā)光作為PDT光源的治療組皮下移植瘤增殖抑制效果與PLGA-RB使用外加光源激發(fā)的對照組相近，真正實現(xiàn)了無外加光源的PDT腫瘤治療[12]。

2 光敏劑

傳統(tǒng)的PS多為有機小分子，如已用于臨床治療的光卟啉、四-（間羥基苯基）二氫卟吩、內(nèi)源性卟啉Ⅸ及5-氨基乙酰丙酸等[13]。但有機小分子PS的腫瘤靶向性、光穩(wěn)定性及ROS產(chǎn)生能力亟待提升[2]。許多納米材料被光激發(fā)亦可產(chǎn)生ROS，可作為新型納米PS；與傳統(tǒng)的有機小分子PS相比，納米PS來源更加廣泛、價格低廉且具有優(yōu)良的光穩(wěn)定性與光敏活性。此外，納米PS還可通過實體腫瘤中存在的獨特的高通透性和滯留（enhanced permeability and retention，EPR）效應(yīng)，被動靶向腫瘤組織，實現(xiàn)在腫瘤組織高效聚集，提升PDT效果。優(yōu)良的納米PS應(yīng)該具有生物安全性佳、治療后可代謝排出體外、良好的穩(wěn)定性及優(yōu)良的ROS產(chǎn)生能力等特點。

二氧化鈦（TiO2）納米顆粒是經(jīng)典的無機納米PS，在紫外光照射下，TiO2可以產(chǎn)生大量ROS。研究顯示，紫外光組織穿透深度淺，無法有效穿透皮膚組織實現(xiàn)體內(nèi)腫瘤治療[14]。楊飄萍教授課題組以商業(yè)化TiO2P25為原料，用水熱法合成TiO2納米棒，在其表面修飾金納米簇后，獲得Au25/B-TiO2-x復(fù)合納米PS；Au25/B-TiO2-x可被650 nm光激發(fā)，實現(xiàn)空穴電子的分離，電子會轉(zhuǎn)移到金屬表面，形成能抑制空穴電子重組的勢壘，分離的空穴-電子對將誘導(dǎo)水分裂產(chǎn)生大量的ROS，發(fā)揮PDT抗腫瘤活性[15]。

謝毅教授課題組通過簡單剝離方法獲得厚度為2.0 nm的超薄黑磷納米片，在可見光照射下，其可產(chǎn)生大量單線態(tài)氧，且量子產(chǎn)率高達0.91；該納米片在0.2 mg · L-1的濃度下，使用 660 nm 激光器（0.5 W · cm-2）光照10 min即可使71.5%的腫瘤細胞發(fā)生凋亡；皮下注射超薄黑磷納米片（500 mg · L-1，30 μL）12 h后，使用660 nm激光器光照腫瘤部位20 min，在16 d治療期內(nèi)，超薄黑磷納米片加光照治療組的皮下移植瘤增長停滯，說明超薄黑磷納米片是一種優(yōu)良的納米PS，更重要的是，該納米片治療后可被降解，預(yù)示其臨床應(yīng)用潛力巨大[16]。

GSH是生物體內(nèi)廣泛存在的一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結(jié)合、含有巰基的還原性三肽，具有很強的抗氧化活性[17]。腫瘤細胞內(nèi)GSH濃度達到正常組織細胞的7倍以上[18]，而PDT是一種基于氧化損傷的治療方法，故腫瘤細胞內(nèi)高濃度還原物質(zhì)GSH的存在可嚴(yán)重降低PDT氧化損傷效果。曲曉剛教授課題組制備了Cu2+修飾的氮化碳納米片（Cu2+-g-C3N4）作為納米PS[19]。該納米PS在可見光照射下不僅可以高效產(chǎn)生包括超氧陰離子自由基、羥基自由基、單線態(tài)氧及過氧化氫等多種ROS，同時，Cu2+還可將腫瘤細胞內(nèi)的GSH轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽（GSSG），使腫瘤細胞內(nèi)GSH/GSSG比例降低1/3，顯著降低腫瘤細胞抗氧化能力，因此，Cu2+-g-C3N4的GSH損傷能力大大提升了其PDT抗腫瘤活性。另外，筆者所在課題組設(shè)計了一個末端含有二硫聯(lián)吡啶的新型鋅酞菁PS（ZnPc-DTP），其ROS產(chǎn)生能力很低并可通過分子間π-π相互作用形成納米聚合物（ZnPc-DTP NP）；經(jīng)尾靜脈注射后，ZnPc-DTP NP可經(jīng)EPR效應(yīng)實現(xiàn)腫瘤組織靶向富集，進入腫瘤細胞后，ZnPc-DTP中的二硫鍵能直接與GSH發(fā)生反應(yīng)，將GSH轉(zhuǎn)化為GSSG，降低腫瘤細胞中的GSH濃度；同時，腫瘤細胞中高水平的GSH能切斷二硫鍵，破壞原有的納米結(jié)構(gòu)，切斷ZnPc-DTP二硫鍵，釋放出ROS高產(chǎn)生能力的末端含有巰基的鋅酞菁（ZnPc-SH），實現(xiàn)基于藥物腫瘤細胞內(nèi)原位活化及GSH損傷的高效PDT腫瘤治療效果（見圖4）[20]。

圖 4 ZnPc-DTP NP抗腫瘤過程示意圖Figure 4 Schematic presentation of anticancer mechanism of ZnPc-DTP NP

3 氧氣

氧氣通過血液循環(huán)被輸送到全身各組織，然后被細胞吸收利用。正常組織中血管分布均勻，血流供應(yīng)穩(wěn)定，因此組織內(nèi)各細胞所處氧氣環(huán)境較為均衡。然而，實體腫瘤組織部位的血管結(jié)構(gòu)完整性差，血流供應(yīng)斷續(xù)不定，導(dǎo)致大部分遠離血管的腫瘤細胞處于乏氧的微環(huán)境（見圖5）。因氧氣是PDT發(fā)揮活性三要素之一，氧氣缺乏會顯著降低PDT治療的效果。因此，尋求有效方法增加腫瘤組織的含氧量，對PDT腫瘤治療具有重要意義。目前，可通過以下方法緩解腫瘤乏氧：催化腫瘤細胞內(nèi)高濃度的H2O2產(chǎn)氧；在光敏治療體系中共載攜氧劑，實現(xiàn)腫瘤組織富氧；升溫加快腫瘤部位血流速度，增加氧氣供給等。

圖 5 實體腫瘤內(nèi)氧氣濃度分布示意圖Figure 5 Schematic diagram of oxygen concentration distribution in solid tumor

與正常細胞相比，腫瘤細胞內(nèi)H2O2濃度較高。H2O2可被多種催化劑催化分解產(chǎn)生氧氣，利用該原理，研究人員設(shè)計構(gòu)建出多種催化H2O2分解產(chǎn)氧以緩解實體腫瘤乏氧的納米PDT治療體系。郭子建教授課題組將過氧化氫酶與PS亞甲基藍（methylene blue，MB）包覆于聚合物納米粒內(nèi)部，并在納米粒表面修飾腫瘤靶向肽（RGDfK）組成復(fù)合藥物HAOP；該復(fù)合藥物經(jīng)尾靜脈注射進入荷瘤小鼠后，在腫瘤組織高效富集，進入腫瘤細胞后，過氧化氫酶催化細胞內(nèi)高濃度H2O2產(chǎn)生氧氣；使用細胞內(nèi)氧氣濃度檢測探針[Ru(dpp)3]Cl2檢測攝取HAOP后細胞內(nèi)氧氣濃度增加過程顯示，HAOP孵育8 h后，細胞內(nèi)乏氧情況顯著緩解。因此，HAOP可通過催化H2O2分解產(chǎn)生氧氣，為PDT供氧，實現(xiàn)乏氧實體腫瘤的高效治療[21]。除了過氧化氫酶，劉莊教授課題組[22]、鄭南峰教授課題組[23]、汪鵬飛教授課題組[24]、雷建平教授課題組[25]及Taeghwan Hyeon課題組[26]還采用二氧化錳（MnO2）、鉑包鈀納米片（Pd@Pt）、錳碳量子點、黑磷/氧化錳復(fù)合材料及MnFe2O4等納米材料作為H2O2分解產(chǎn)氧的催化劑，與PS組成復(fù)合納米藥物，通過催化腫瘤細胞內(nèi)源H2O2產(chǎn)生氧氣供給PDT使用，實現(xiàn)了乏氧腫瘤的PDT高效治療。

血紅蛋白是血液中紅細胞內(nèi)負責(zé)氧氣傳遞的主要載體，其在氧濃度高的環(huán)境中易與氧氣結(jié)合，但在氧濃度低的環(huán)境中又容易與氧氣解離，釋放氧氣。基于此，王利群教授課題組使用兩親性三嵌段共聚物（mPEG-b-PAA-b-PS）將血紅蛋白與PS四(4-羧苯基)卟吩[5,10,15,20-tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin ，TCPP]組裝成仿生復(fù)合藥物（I-ARCs），模擬紅細胞載氧及遞氧過程，直接傳輸氧氣至腫瘤組織，緩解實體腫瘤乏氧，增進PDT療效[27]。此外，全氟碳類化合物（per fl uorocarbon，PFC，直鏈或環(huán)狀碳氫化合物的氟取代物）也是氧氣的良好溶劑。因此，PFC也可作為氧氣傳遞介質(zhì)緩解實體腫瘤乏氧[28]。何丹農(nóng)教授課題組使用PLGA包覆PFC溴化物（per fl uorooctyl bromide，PFOB）與PS IR780組成復(fù)合納米藥物（PLGA-IR780-PFOB），該復(fù)合納米藥物包覆的PFOB中攜帶大量氧氣，復(fù)合納米藥物進入腫瘤細胞后，釋放所攜帶的氧氣至腫瘤細胞，緩解實體腫瘤乏氧；與不含PFOB對照組（PLGA-IR780）相比，PLGA-IR780-PFOB治療組體內(nèi)腫瘤抑制率提升近5倍[29]。

4 結(jié)語

綜上所述，納米技術(shù)在PDT腫瘤治療領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，在推動PDT腫瘤治療進程中發(fā)揮了巨大的作用?；诩{米材料構(gòu)建的多樣化PDT體系，不僅來源廣泛、價格低廉，且可克服PDT治療過程中面臨的光源組織穿透不足、腫瘤組織乏氧等問題，還可通過EPR效應(yīng)實現(xiàn)腫瘤組織的被動靶向。然而，利用納米材料構(gòu)建PDT治療體系的體內(nèi)抗腫瘤研究的實驗周期多在30 d以內(nèi)，短時治療后，可通過檢測實驗動物體質(zhì)量變化及主要臟器超薄切片染色后的病理分析判斷體系的不良反應(yīng)。但納米材料長期治療可能導(dǎo)致的不良反應(yīng)、對免疫系統(tǒng)的影響及代謝路徑等問題的研究相對較少。如汪聯(lián)輝教授課題組的研究表明，含Gd3+的上轉(zhuǎn)換材料NaGdF4可以選擇性吸附細胞內(nèi)的ATP并催化其磷酸鍵斷裂，導(dǎo)致細胞內(nèi)ATP濃度下降，當(dāng)材料質(zhì)量濃度為1 600 mg·L-1時，細胞內(nèi)ATP濃度趨近于零，ATP濃度的下降可誘發(fā)細胞自噬及凋亡[30]。此外，因Gd3+具有優(yōu)良的核磁成像性能，其被廣泛用于具有腫瘤診療一體化功能的PDT納米藥物合成。因此，若該類材料無法在短時間內(nèi)快速代謝排出體外，在某些正常組織中聚集的材料就可能引發(fā)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。此外，以斑馬魚為對象的研究表明，納米銅、納米銀、Cd/Te量子點、納米TiO2及納米MgO等材料具有顯著的致畸效應(yīng)并可影響斑馬魚正常發(fā)育[31]。但可以預(yù)見，隨著納米技術(shù)的進步，會有更多的擁有優(yōu)良的生物安全性、腫瘤主動靶向能力、可代謝或可降解、協(xié)同腫瘤治療功能等新型材料用于PDT腫瘤治療，進一步拓展PDT腫瘤治療應(yīng)用范圍，推動新型納米藥物的臨床PDT腫瘤治療進程。