腦缺血再灌注模型制作方法的研究進(jìn)展

潘洲佳，顧佳楠，謝竹青,2，張 尹,2，屠穎歆，王 虎，陳培清，辛?xí)悦鳌?/p>

(1.上海健康醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，上海 201318； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201318)

腦血管疾病嚴(yán)重危害人類身體健康，是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和長期殘疾的第三大原因，分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩大類，其中缺血性腦卒中占80%～90%[1-2]。腦卒中的高發(fā)生率、高致殘率和高死亡率給社會及家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。為了有效地篩選治療藥物，提高缺血性腦卒中的治愈率和恢復(fù)率，制作出接近人類腦梗死的理想大腦中動脈缺血(middle cerebral artery occlusion，MCAO)再灌注模型是腦科學(xué)工作者一直關(guān)注的課題，建立穩(wěn)定的動物模型是研究該類疾病最主要的手段之一?，F(xiàn)分別從實驗動物和栓線材料的選擇、制作和栓線頭端的處理以及制作腦相關(guān)手術(shù)因素對實驗結(jié)果的影響等方面對腦缺血模型制作方法的研究進(jìn)展予以綜述，以期建立穩(wěn)定可靠的MCAO再灌注模型，并提高制備模型的成功率和可行性。

1 實驗動物的選擇

1.1動物種類 選擇適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ褪菍嶒炑芯康幕A(chǔ)。MCAO高度模擬了臨床人類腦血管疾病的發(fā)病病理過程，結(jié)合臨床病理特點，建立符合人類疾病特點的動物模型對臨床上腦缺血發(fā)病機制及藥物篩選的研究具有重要意義。常用于制備腦缺血模型研究的動物有狒狒、猴、兔、犬和鼠等，每種動物都有其優(yōu)缺點，狒狒和猴的高級神經(jīng)中樞與人類非常相近，但費用高、飼養(yǎng)難；犬的腦血管與人類差異較大，頸內(nèi)外動脈間吻合網(wǎng)豐富，若只阻斷單根顱內(nèi)動脈很難形成穩(wěn)定的病灶；兔的大腦皮質(zhì)不夠發(fā)達(dá)，研究效果不理想[3]。鼠類的飼養(yǎng)成本低且繁殖快，是目前最常用的實驗研究動物。目前，大鼠是心腦血管疾病研究最常使用的實驗動物之一，其食性與人類相近，且腦組織病變特點與臨床患者類似，用大鼠建立的MCAO再灌注模型的實驗效果最佳。

1.2動物體型 不同體型大鼠制備模型的成功率不同。楊贊章和陳虹[4]的實驗發(fā)現(xiàn)，動物體重越小，死亡率越高，體重180 g以下大鼠的死亡率高達(dá)70%，而體重350 g以上大鼠的死亡率低于10%，但體重350 g以上大鼠的體重過大、血管較粗，導(dǎo)致模型制備的成功率降低，因此，需要選擇體重適宜的大鼠制備模型。此外，大鼠的生命力較強，抗感染能力強，易存活，大鼠的體重為250～300 g時模型的成功率較為理想[5]。

2 栓線材料的選擇及制作

2.1栓線材料的選擇 選擇合適的線栓是模型成功的關(guān)鍵，線栓要軟硬適度。為了減少動物損傷，提高成模率，實驗用栓線也在不斷改善。栓線種類有尼龍線、鼠須、釣魚線等，常規(guī)MCAO模型所用栓線材料為尼龍線[6]。甘雨等[7]選用尼龍線制備MCAO模型的研究發(fā)現(xiàn)，尼龍線直徑均一，弧度及硬度適中，不僅大幅度提高了模型制備的成功率，還節(jié)約了栓線的制作時間。但謝寧等[8]的實驗發(fā)現(xiàn)，尼龍線硬度不夠、韌性不高，易在彎曲血管處停留，且在一定溫度時易變軟，使其入顱比較困難，由于進(jìn)線深度不夠常導(dǎo)致腦缺血模型的制作失敗。隨后，Wang等[9]的實驗也得到了相同的結(jié)論。曹霞和丙秉振[10]發(fā)現(xiàn)，鼠須具有良好的硬度和彈性，內(nèi)在性質(zhì)均一，使用鼠須代替尼龍線可以克服尼龍線韌性較差的缺陷，可顯著提高M(jìn)CAO模型制備的成功率；但鼠須直徑不一，頭端難以處理，無法完全阻塞血管。Tang等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，釣魚線內(nèi)在性質(zhì)均一，硬度及彈性良好，頭端易處理，可作為良好的栓線材料。近年來，研究者大多使用釣魚線作為栓線的首選材料。

2.2栓線制備 目前常用的栓線頭端處理方法有Longa法、Koizmi法和石蠟法3種。Longa法是將栓線的頭端燒成球形，目前大部分研究采用此方法制備栓線頭端[12]。但Laing等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，采用Longa法栓線操作時插線困難，易穿破血管，再灌注后易引發(fā)動脈血管破裂出血，導(dǎo)致再灌注成功率較低。在上述研究的基礎(chǔ)上，Reglodi等[14]對Longa法進(jìn)行改進(jìn)，將栓線頭端燒成小圓頭，制成頭端大小一致、鈍圓光滑的栓線，將栓線的頭端浸入0.1%的多聚賴氨酸溶液，浸泡完全后置于60 ℃的烤箱中烘干備用，用其制備MCAO模型的成功率達(dá)到100%。

Koizmi法是在栓線的頭端涂抹硅酮，多項研究均采用此方法制備栓線[15-17]。Belayer等[16]將栓線頭端加熱后使其頭端變圓鈍，然后將多聚賴氨酸溶液涂于距栓線頭端20 mm處，發(fā)現(xiàn)涂抹多聚賴氨酸溶液的線栓制備MCAO模型的成功率提高，大鼠的死亡率下降。而李振宗等[17]將多聚賴氨酸和硅酮處理的栓線對模型的影響進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，硅酮處理的線栓模型的成功率、穩(wěn)定性和重復(fù)性均優(yōu)于多聚賴氨酸處理的模型。

石蠟法是使用加熱熔化的固體石蠟處理栓線取代Koizmi涂硅酮的方法，在距栓線插入端5 mm內(nèi)均勻涂抹石蠟，簡便省時，保證了良好的栓塞效果。王耀明等[18]亦有石蠟法栓塞效果的報道。Zuo等[19]對石蠟處理栓線的MCAO模型研究發(fā)現(xiàn)，其模型制備的成功率達(dá)到了100%，將固體石蠟經(jīng)加熱熔化后處理的栓線的均一性良好，石蠟與栓線緊密黏附，插線后導(dǎo)致的腦梗死體積比其他栓線插線后形成的腦梗死體積更大，死亡率更低。石蠟的化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，不與血液中的成分發(fā)生反應(yīng)，且經(jīng)石蠟處理的栓線粗細(xì)適中、頭端光滑圓鈍，對血管壁無刺激，不易對血管壁造成直接損傷。

2.3栓線長度和直徑的選擇 穩(wěn)定可靠MCAO模型的建立，不僅需要選擇合適的大鼠，還需要符合其他相應(yīng)的條件。Kuge等[20]對MCAO模型制作的研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠的體重與所使用的栓線長度成正比，可根據(jù)大鼠體重選擇栓線的長度。

此外，不同品牌外科手術(shù)縫線的直徑不同，需要根據(jù)實驗所建立的模型選擇不同的栓線長度和直徑。李忠仁和崔龍[21]認(rèn)為，插線需要根據(jù)不同大鼠的TC線 (動物門齒根部T點與頸總動脈分叉點C點的距離)選擇適宜的插入深度，兩者存在密切關(guān)系，但未報道其線長、線直徑與模型制備效果的關(guān)系。辛世萌等[22]對大鼠體重確定的模型制備結(jié)果評分進(jìn)行方差分析證實，栓線直徑對模型制備有明顯影響，并發(fā)現(xiàn)栓線直徑為0.28 mm時，阻塞效果好；對腦梗死體積進(jìn)行方差分析顯示，栓線直徑對模型制備的影響無差異，由此可見，直徑為0.28 mm、長17～18 mm栓線的重復(fù)性良好，對動物生理指標(biāo)的影響小，成功率高。

3 實驗操作的改進(jìn)

3.1左右側(cè)動脈選擇 模型制備過程中，手術(shù)動脈的選擇也具有決定性作用。高煥民等[23]對MCAO再灌注模型中左側(cè)與右側(cè)大腦動脈栓塞差異的研究顯示，左側(cè)再灌注24 h、48 h及72 h后神經(jīng)功能缺損評分顯著低于右側(cè)；左側(cè)缺血程度較右側(cè)重；左側(cè)神經(jīng)元數(shù)量缺失嚴(yán)重，海馬細(xì)胞排列十分紊亂，腦梗死體積明顯大于右側(cè)，由此可見，模型制備時選擇右側(cè)動脈栓塞的成功率較高，且較安全可靠。陳春富和李勁松[24]認(rèn)為，頸部手術(shù)可能對左側(cè)大腦迷走神經(jīng)造成損傷，對心臟、血壓產(chǎn)生較大影響。實際手術(shù)操作中要盡量避免損傷大鼠的頸部周圍組織，其中迷走神經(jīng)尤為重要，一旦刺激迷走神經(jīng)，極易引起大鼠呼吸暫停和心臟停搏。張傳灼等[25]的研究證實，左側(cè)動脈栓塞可能損傷迷走神經(jīng)，易引起嚴(yán)重的神經(jīng)功能損傷，因此，為減少大腦外在因素的影響，應(yīng)盡量選擇右側(cè)動脈。選擇右側(cè)動脈栓塞有助于體溫和血壓的平穩(wěn)。何芳雁等[26]的實驗研究表明，選擇右側(cè)動脈避免刺激左側(cè)迷走神經(jīng)，有利于提高大鼠的成活率及模型制備的成功率。

3.2手術(shù)切口位置 目前，大鼠MCAO頸部手術(shù)切口有頸部正中切口和頸部外側(cè)切口兩種[27]。絕大多數(shù)研究者采用大鼠頸部正中切口，首先將大鼠以仰臥位固定于操作臺上，頸前區(qū)消毒，切開時依次經(jīng)過頜下腺、下頜淋巴結(jié)、胸鎖乳突肌、胸骨舌骨肌等，鈍性分離肌肉及筋膜，充分暴露右側(cè)頸總動脈[5]。頸內(nèi)動脈分支的翼腭突動脈較粗，且走行與頸內(nèi)動脈一致，多數(shù)情況下插線易插入分支翼腭突動脈而不能入顱，故可暴露翼腭突動脈而不結(jié)扎，讓栓線越過翼腭突動脈插入顱內(nèi)，保證充分地再灌注。手術(shù)中需分離和保護(hù)氣管、迷走神經(jīng)和舌咽神經(jīng)叢等，此操作易傷及左側(cè)迷走神經(jīng)，對心臟造成影響，手術(shù)風(fēng)險和難度較高，對操作者的要求較高[28]。陳春富和李勁松[24]選用的頸部外側(cè)切口，手術(shù)視野好，血管和肌肉易于分離，氣道分泌物產(chǎn)生少，不需要輔助呼吸，且對器官的刺激性小，手術(shù)較簡單，成功率較高。胡華等[29]采取頸部外側(cè)切法的實驗發(fā)現(xiàn)，操作中適當(dāng)調(diào)整血管和線栓的進(jìn)入角度，可提高模型制備的成功率?？梢?，頸部外側(cè)切口可降低手術(shù)難度和動物死亡率；手術(shù)視野暴露較充分，對氣管刺激小，出血量較少，對大鼠損傷小，有利于實驗動物存活。

3.3栓線插入位置 栓線插入位置的選擇對模型制備的成功也有很大影響。目前，栓線的插入方法主要有兩種，一種是采用頸外動脈切口位置插入栓線的傳統(tǒng)方法，將合適的栓線從頸外動脈緩慢插入，后向下輕按頸外動脈，使栓線成直線插入頸內(nèi)動脈，以便栓線沿頸外動脈經(jīng)過頸總動脈分叉處入頸內(nèi)動脈，到大腦前動脈，后至大腦中動脈[30]。栓線插入需緩慢送入頸內(nèi)動脈，遇有輕微阻力停止，之后可將外留的多余栓線涂黑，殘端盡量保留長一些，以便再灌注時拔線。甘雨等[7]研究發(fā)現(xiàn)，線栓插入深度一般為(18.0±0.5) mm，并可術(shù)前標(biāo)記栓線18 mm 位置，若進(jìn)線遇到阻力時，進(jìn)線長度已達(dá)18 mm，應(yīng)立即停止進(jìn)線，以免造成蛛網(wǎng)膜下腔出血；若不到 18 mm，則可緩慢退出2～3 mm，重新調(diào)整角度再緩慢送入頸內(nèi)動脈。陳嵐等[30]的實驗證實，從頸外動脈插入栓線可以保留頸總動脈的完整性，且由于栓線與頸內(nèi)動脈近似成直線，為頸外動脈再灌注的血流通暢提供了條件，可實現(xiàn)充分復(fù)灌。王新鳳等[31]的實驗證實，從頸外動脈插入的栓線繞過頸總動脈和頸內(nèi)和頸外血管形成的分叉，再進(jìn)入頸內(nèi)動脈時更易進(jìn)入大鼠大腦中動脈。但栓線進(jìn)入頸內(nèi)動脈的實驗操作要求較高，由于頸外動脈較細(xì)，插入過程中易被扯斷或剪斷而不能有效控制出血量，且對動物損傷大，故操作難度較大。

另一種方法是栓線從頸總動脈經(jīng)頸內(nèi)動脈直接插至大腦中動脈的起始部，再灌注時抽回栓線至頸總動脈內(nèi)，此方法操作較簡單，優(yōu)點是可不分離頸內(nèi)動脈、迷走神經(jīng)等，對血管的刺激較小，避免了迷走神經(jīng)受損而影響心臟的可能性等，對生理結(jié)構(gòu)的損傷也較小，可形成穩(wěn)定的梗死灶。但由于頸總動脈的結(jié)扎，需通過前后交通動脈實現(xiàn)再灌注，由于再灌注血流是非正常生理性流向，因此難以保證大鼠的正常血供，且反復(fù)插入易加重血管損傷，增加死亡率。因此，需要根據(jù)具體的實驗要求選擇適當(dāng)?shù)闹苽浞椒ㄖ谱髂X缺血再灌注模型。

4 手術(shù)注意事項

大腦對缺血再灌注損傷的耐受程度與術(shù)前體內(nèi)葡萄糖濃度密切相關(guān)，故術(shù)前大鼠應(yīng)自由進(jìn)食，以確保大鼠體內(nèi)的葡萄糖濃度。若術(shù)后大鼠情況欠佳，可補充1%葡萄糖溶液，以提高大鼠的耐受力，縮短蘇醒時間，提高成功率。

手術(shù)時，手術(shù)室溫度需要保持在28 ℃左右，手術(shù)臺可以用烤燈(距離60 cm高度)持續(xù)照射保溫，防止手術(shù)過程中大鼠因亞低溫而受損。在整個手術(shù)過程中，要實時監(jiān)測大鼠的直腸溫度，并保持循環(huán)加熱墊的溫度以保證大鼠37 ℃的體溫，盡量保持手術(shù)過程中大鼠生命體征的穩(wěn)定[32]。此外，圍術(shù)期的護(hù)理也很重要，術(shù)后48 h內(nèi)動物的死亡率最高，若安全度過危險期則存活率明顯提高，故需實時監(jiān)測大鼠體溫，保證良好的生命體征。

5 小 結(jié)

隨著MCAO模型制備方法的不斷改進(jìn)和發(fā)展，對MCAO模型的動物選擇、模型制備等也不斷改善，MCAO模型制備的成功率明顯提高，術(shù)后損傷逐漸減少，使腦MCAO模型日趨成熟和完善。目前，線栓法是公認(rèn)的較為理想的制備MCAO模型的方法，主要用于臨床腦血管疾病的研究，但手術(shù)操作要求高、模型差異性大、動物死亡率高，仍需進(jìn)一步的研究以明確各因素對模型制備的實驗條件和操作步驟等的影響，嚴(yán)格注重細(xì)節(jié)，不斷總結(jié)經(jīng)驗對模型進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化，為腦缺血臨床治療的研究提供更優(yōu)質(zhì)的動物模型。