含半胱氨酸和組氨酸豐富域蛋白1的研究進(jìn)展

曲光瑾，張鐵民，王宇虹，羅善順，張 婧，韓 輝※

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 a.老年病科 國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心， b.結(jié)直腸外科，哈爾濱 150001)

含半胱氨酸和組氨酸豐富域蛋白1(cysteine and histidine rich domains containing protein-1，CHP-1)又稱Morgana，是高度保守的蛋白質(zhì)家族成員之一，對植物發(fā)育和抗病性起重要作用。動(dòng)植物可能具有相似的發(fā)育和抗病機(jī)制，動(dòng)物核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)構(gòu)上類似于植物抗病蛋白(R蛋白)的一個(gè)亞類，參與細(xì)胞內(nèi)病原體的識別和炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)。脊椎動(dòng)物具有兩個(gè)半胱氨酸和組氨酸豐富域(cysteine and histidine rich domains，CHORD)包含蛋白，即CHP-1和Melusin，無脊椎動(dòng)物僅有CHP-1。Melusin是心肌特異性整合素結(jié)合蛋白，參與心肌細(xì)胞的過度增長，而CHP-1可在所有組織和細(xì)胞中普遍表達(dá)。序列分析表明，脊椎動(dòng)物CHP-1和無脊椎動(dòng)物CHP-1是同源物，而 Melusin 可能起源于進(jìn)化過程中的基因復(fù)制[1]。哺乳動(dòng)物CHP-1蛋白與熱激蛋白(heat shock protein，HSP)90相互作用。CHP-1和HSP90的分子伴侶p23和S相激酶相關(guān)蛋白1的G2等位基因抑制因子(suppressor of the G2 allele of Skp 1，SGT1)有相似的結(jié)構(gòu)序列，可能是HSP90的分子伴侶，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的各組織器官，對生物的正常發(fā)育起重要作用。CHORDC1基因缺失可導(dǎo)致不育或胚胎死亡。CHP-1蛋白可在細(xì)胞缺血應(yīng)激過程中避免凋亡，起到保護(hù)細(xì)胞的作用，并與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密不可分。現(xiàn)就CHP-1的研究進(jìn)展予以綜述。

1 CHP-1的發(fā)現(xiàn)

Shirasu等[2]報(bào)道了一類新的真核鋅結(jié)合蛋白，是一種多物種抗病性基因(Rar1基因)編碼的蛋白，不僅存在于大麥抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中，還是秀麗隱桿線蟲發(fā)育的必需蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)病原體的識別和炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)[3]。Rar1基因?qū)^氧化氫刺激的宿主細(xì)胞具有保護(hù)作用，可降低其死亡率，其編碼含有60個(gè)氨基酸的蛋白，包括兩個(gè)分子量為25 500的CHORD蛋白，即CHP-1和Melusin[4]。Melusin是一種與心肌肥厚機(jī)械負(fù)荷有關(guān)的肌肉特異性蛋白，與CHP-1有63%的同源性，廣泛分布于機(jī)體各種組織細(xì)胞[5]。沉默秀麗隱桿線蟲的CHORD-containing基因可導(dǎo)致半數(shù)秀麗隱桿線蟲不育[6]。CHP-1+/-小鼠并不表現(xiàn)發(fā)育異?；蚩梢娀蝃7]。雜交鼠胚胎形成3.5 d后，形態(tài)正常的CHP-1-/-胚胎以正常的孟德爾頻率出現(xiàn)，但此后未再檢測到CHP-1-/-胚胎，提示CHP-1基因在動(dòng)物發(fā)育過程中起重要作用[8]。

2 CHP-1的結(jié)構(gòu)

CHP-1具有兩個(gè)CHORD區(qū)域，N端由92個(gè)氨基酸序列間隔，C端Melusin含有30個(gè)酸性氨基酸殘基的鈣結(jié)合伸展結(jié)構(gòu)；而CHP-1的C端由85個(gè)氨基酸組成，與SGT1有很大同源性[9]。SGT1是泛素連接機(jī)制和酵母動(dòng)粒組裝途徑的重要組成部分，也是重要的植物抗病蛋白[10]。對小鼠和人類進(jìn)行基因組序列分析的研究表明，CHP-1基因定位于小鼠第9號染色體，人類11q14.3染色體[11]。CHP-1和Melusin基因共享保守的外顯子和內(nèi)含子，其基因編碼序列在小鼠和人類基因組中由11個(gè)編碼外顯子組成。小鼠和人類基因組的CHP-1編碼外顯子的分子量均為21.6 kb左右，前4個(gè)外顯子(1～4)編碼第一個(gè)CHORD結(jié)構(gòu)域以及中間區(qū)域，而第二個(gè)CHORD完全由3個(gè)外顯子(6～8)編碼，SGT1樣結(jié)構(gòu)域由3個(gè)末端編碼外顯子(9～11)編碼[11]。數(shù)據(jù)庫分析并驗(yàn)證其他種屬CHP-1和Melusin同源性發(fā)現(xiàn)，真菌和斑馬魚CHORDC基因可編碼Melusin和CHP-1，但在果蠅和秀麗隱桿線蟲中只能編碼CHP-1，且果蠅和秀麗隱桿線蟲特有的CHORD蛋白與小鼠和人類CHP-1的同源性高于Melusin[12-13]。CHP-1是金屬結(jié)合蛋白，可以結(jié)合植物CHORD區(qū)域的鋅離子，并保留了調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物CHORD區(qū)域鋅離子的能力。由于CHP-1不具有末端酸性結(jié)合域，因此不結(jié)合鈣離子[14]。

3 CHP-1的作用及機(jī)制

CHP-1是與系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的保守蛋白質(zhì)，通過抑制ROCK激酶的活性調(diào)節(jié)中心體復(fù)制，廣泛存在于成體有絲分裂后的組織，除細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)作用外，還對細(xì)胞應(yīng)激起保護(hù)作用。CHP-1分子伴侶活性可能保護(hù)細(xì)胞應(yīng)激損傷[15]。CHP-1的表達(dá)與HSP70類似，免疫印跡分析顯示，以43 ℃孵育NIH 3T3細(xì)胞 45 min，然后復(fù)溫至37 ℃，復(fù)溫后維持3 h，CHP-1信使RNA的轉(zhuǎn)錄增加3倍，同時(shí)蛋白水平升高；熱應(yīng)激后8 h，轉(zhuǎn)錄水平回落至基線。NIH 3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)CHP-1慢病毒，升溫或過氧化氫處理后，可避免細(xì)胞的致死性應(yīng)激[16]。

短暫性腦缺血發(fā)作可使受損蛋白和多種HSP增加。缺血期3～5 d，海馬1區(qū)神經(jīng)元的壞死顯著增加，海馬2～4區(qū)和齒狀回區(qū)神經(jīng)元的壞死較少，表明后者具有內(nèi)在保護(hù)機(jī)制。對沙鼠海馬1區(qū)、海馬2～4和齒狀回區(qū)CHP-1的表達(dá)水平進(jìn)行測量發(fā)現(xiàn)，缺血3 h后，兩個(gè)部位CHP-1表達(dá)上升程度相似；缺血24 h后海馬1區(qū)CHP-1信使RNA表達(dá)水平恢復(fù)至基線，海馬2～4和齒狀回區(qū)的CHP-1信使RNA表達(dá)始終升高；且海馬缺血再灌注區(qū)HSP70的上調(diào)時(shí)間也較長，與CHP-1水平一致[17]。

CHP-1能夠結(jié)合和抑制ROCKⅠ和ROCKⅡ激酶的活性[18]。ROCKⅠ激酶在細(xì)胞凋亡中具有特異性作用，活性ROCKⅠ激酶過表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞膜起泡，細(xì)胞皺縮和核裂解，從而發(fā)生細(xì)胞凋亡。ROCKⅠ激酶還參與誘導(dǎo)上游的胱天蛋白酶3激活誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，活性ROCKⅠ激酶突變體的表達(dá)足以誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞胱天蛋白酶3的裂解和激活。此外，ROCKⅠ激酶可磷酸化造血細(xì)胞和心肌細(xì)胞的第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)229和Thr321，提高PTEN的穩(wěn)定性和活性。CHP-1可抑制ROCKⅠ激酶的活性，并高表達(dá)CHP-1，導(dǎo)致NIH 3T3細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞系的PTEN水平降低。CHP-1調(diào)節(jié)PTEN的能力取決于ROCKⅠ激酶，活性ROCKⅠ激酶可使PTEN的水平恢復(fù)正常，并增加過表達(dá)CHP-1細(xì)胞凋亡刺激的敏感性。PTEN是一種有效的腫瘤抑制劑，其缺失導(dǎo)致細(xì)胞自噬信號通路激活，PTEN的輕度下調(diào)對腫瘤的易感性和進(jìn)展有強(qiáng)烈的影響，并可影響細(xì)胞存活和化療的耐藥性。三陰性乳腺癌PTEN呈低表達(dá)，故PTEN缺失可用于預(yù)測三陰性乳腺癌的早期復(fù)發(fā)。PTEN的表達(dá)和功能受不同機(jī)制(如基因突變、表觀遺傳沉默、微RNA調(diào)節(jié)、競爭性內(nèi)源RNA、翻譯后修飾和定位改變癌細(xì)胞)的調(diào)節(jié)，通過翻譯后修飾破壞PTEN。CHP-1表達(dá)水平的增加可抑制ROCKⅠ激酶，導(dǎo)致PTEN不穩(wěn)定，并提高化療藥物的耐藥性。與原發(fā)性腫瘤相比，卵巢癌化療后復(fù)發(fā)CHP-1的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[19-20]。

CHP-1通過抑制ROCKⅡ激酶在中心體復(fù)制和基因組穩(wěn)定性中起關(guān)鍵調(diào)控作用。中心體是大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞的主要微管組織中心，包括一對中心粒，由中心粒外周物質(zhì)包圍，形成組織微管，有助于細(xì)胞兩極形成紡錘體。正常細(xì)胞的中心體復(fù)制被嚴(yán)格調(diào)控，每個(gè)細(xì)胞周期僅發(fā)生一次。當(dāng)調(diào)節(jié)機(jī)制失調(diào)時(shí)，同一細(xì)胞周期內(nèi)中心體發(fā)生多次復(fù)制，導(dǎo)致具有多余中心體的細(xì)胞出現(xiàn)，此現(xiàn)象稱為中心體擴(kuò)增[21]。具有多余中心體的細(xì)胞可形成異常紡錘體，無法介導(dǎo)染色體分離，導(dǎo)致出現(xiàn)非整倍體和多倍體細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。CHP-1基因高度保守，在系統(tǒng)發(fā)育過程中起重要作用。果蠅神經(jīng)母細(xì)胞中CHP-1的缺失導(dǎo)致強(qiáng)烈的有絲分裂表型，多倍體細(xì)胞頻繁出現(xiàn)，大多數(shù)二倍體細(xì)胞出現(xiàn)中心體擴(kuò)增。CHP-1+/-胚胎來源的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的CHP-1單倍體缺陷，導(dǎo)致多倍體細(xì)胞、多中心體和多極紡錘體的高發(fā)?；蚪M不穩(wěn)定性是癌細(xì)胞的典型特征，有利于癌癥的發(fā)生發(fā)展。與野生型小鼠相比，CHP-1+/-小鼠對化學(xué)誘變劑的敏感性顯著升高[4]。

4 CHP-1與HSP90的相互作用

對伴侶HSP90結(jié)構(gòu)的研究表明，核苷酸和藥物配體可誘導(dǎo)幾種不同的構(gòu)象狀態(tài)，但具體機(jī)制尚不清楚[22]。與其他HSP90共伴侶相似，CHP-1對熱變性檸檬酸合成酶具有自身的伴侶活性，此活性存在于CHP-1和SGT1的相似結(jié)構(gòu)序列中。SGT1結(jié)構(gòu)域與小型HSP的α-結(jié)晶結(jié)構(gòu)域同源，可控制變性蛋白的聚集和分解。采用串聯(lián)質(zhì)譜方法研究ATP、ADP和凝膠霉素對人HSP90相互作用體蛋白質(zhì)組影響的研究發(fā)現(xiàn)了52種HSP90復(fù)合物的調(diào)節(jié)配體和分子伴侶；格爾德霉素處理后導(dǎo)致HSP90復(fù)合物顯著富集于CHP-1核心轉(zhuǎn)錄區(qū)，提示HSP90抑制可能在轉(zhuǎn)錄和CHP-1 RNA處理上具有共同的基礎(chǔ)作用，進(jìn)一步證實(shí)了CHP-1是新的ADP依賴的HSP90相互作用蛋白；這種相互作用是由細(xì)胞裂解液中高AD∶ATP 比值以及體外純化的重組蛋白刺激和HSP90結(jié)合核苷酸的能力決定[23]。

HSP90相互作用體在核苷酸和藥物配體方面是動(dòng)態(tài)的，且HSP90的藥理抑制可能刺激特異性復(fù)合物的形成。二聚體HSP90 ATP酶是一種高效的分子伴侶，在蛋白質(zhì)折疊途徑的后期發(fā)揮作用，以協(xié)助折疊和激活特定蛋白質(zhì)。HSP90在細(xì)胞分裂、代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄和免疫等多種生物過程中發(fā)揮重要作用，是重要的抗癌靶點(diǎn)。HSP90復(fù)合物含有幾種分子伴侶和輔助蛋白，可調(diào)節(jié)ATP酶活性和輔助蛋白間相互作用[24]。在腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞系HEK293T中穩(wěn)定表達(dá)N端及C端異常糖鏈糖蛋白標(biāo)記的HSP90互補(bǔ)DNA，在5 mmol/L ATP、5 mmol/L ADP或5 mol/L格爾德霉素存在下對HSP90復(fù)合物進(jìn)行異常糖鏈糖蛋白標(biāo)記。HSP90復(fù)合物不能水解ATP，但能結(jié)合核苷酸的E47A突變體，其親和力與野生型HSP90蛋白相當(dāng)。異常糖鏈糖蛋白標(biāo)記突變體在體外可增強(qiáng)HSP90與底物肽之間的相互作用。有研究證明，酵母中與CHP-1類似的突變可加強(qiáng)酵母p23同源物Sba1p和酵母HSP90之間的相互作用，此相互作用受ATP的積極影響[25]。HSP90抑制劑治療后，HSP70表達(dá)顯著上調(diào)，由于參與應(yīng)激反應(yīng)的CHP-1亦在格爾德霉素依賴復(fù)合物中被鑒定出，故認(rèn)為CHP-1可能同樣上調(diào)[26]。使用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)確定依賴于格爾德霉素交互作用亞群的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)格爾德霉素處理后，HSP90復(fù)合物中蛋白質(zhì)的增加與細(xì)胞豐度增加無關(guān)[27]。若HSP90和HSP70結(jié)合的相互作用發(fā)生在格爾德霉素處理后，則HSP70信使RNA表達(dá)的增加將直接反映在肽譜計(jì)數(shù)中。經(jīng)格爾德霉素處理后，HSP70同源物HSPA8和HSPA1A的信使RNA豐度分別上調(diào)了2倍和18倍，而相應(yīng)蛋白質(zhì)光譜豐度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[28]。通過D93N可確定HSP90復(fù)合物依賴活性HSP90 ATP酶或HSP90結(jié)合核苷酸或凝膠霉素的能力。D93N突變阻止了HSP90 ATP酶活性位點(diǎn)的核苷酸結(jié)合，并基于D93N的類似機(jī)制與格爾德霉素和腺嘌呤核苷酸的接觸預(yù)測D93N突變對明膠霉素結(jié)合的干擾。可見，CHP-1依賴格爾德霉素與HSP90復(fù)合物成員的相互作用將顯著受損。

5 CHP-1在臨床中的應(yīng)用

CHP-1減少可使細(xì)胞發(fā)生癌變，增強(qiáng)腫瘤易感性。在乳腺癌和肺癌中，CHP-1表達(dá)降低[乳腺癌67.3%(37/55)，肺癌57.7%(45/78)]，但可在少數(shù)乳腺癌(5.4%)和肺癌(10.3%)中過表達(dá)，特別是三陰性乳腺癌[4]。CHP-1過表達(dá)可能是某些腫瘤抑制中心體擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)遺傳穩(wěn)定的機(jī)制之一，反映了基因的趨同現(xiàn)象，可抵消晚期腫瘤細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定性，允許具有染色體組成的細(xì)胞克隆性擴(kuò)增，從而賦予增殖優(yōu)勢，其過表達(dá)與腫瘤分級、有絲分裂數(shù)和淋巴結(jié)陽性相關(guān)。因此，在低表達(dá)CHP-1的T47D和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中，上調(diào)CHP-1可增強(qiáng)化療藥物表柔比星和多西紫杉醇的敏感性。

CHP-1+/-小鼠可自發(fā)進(jìn)展為一種類似于人類非典型慢性髓性白血病的致命性骨髓增生性疾病。對自發(fā)腫瘤形成CHP-1+/-小鼠的敏感性監(jiān)測20個(gè)月發(fā)現(xiàn)，第12個(gè)月開始，60%的CHP-1+/-小鼠出現(xiàn)明顯的病理體征，如消瘦、脊柱變形和嚴(yán)重制動(dòng)等衰弱癥狀；壞死鏡檢查未發(fā)現(xiàn)實(shí)體瘤；組織病理分析顯示，髓樣細(xì)胞浸潤于心肌、腦組織、腎臟等[29]。CHP-1缺失是ROCK激酶過度激活、中心體擴(kuò)增和骨髓細(xì)胞遺傳學(xué)異常的重要因素。此外，CHP-1在以非復(fù)發(fā)性細(xì)胞遺傳學(xué)異常為特征的非典型慢性粒細(xì)胞白血病骨髓以及由BCR-ABL癌基因引起的部分費(fèi)城染色體陽性慢性粒細(xì)胞白血病(Ph1 CML)骨髓中均呈低表達(dá)，預(yù)示其對伊馬替尼(費(fèi)城染色體陽性慢性粒細(xì)胞白血病的標(biāo)準(zhǔn)治療)的反應(yīng)更差[30]。

CHP-1作為腫瘤抑制劑的方式多樣，CHP-1低表達(dá)可誘導(dǎo)中心體擴(kuò)增和細(xì)胞遺傳學(xué)異常；在費(fèi)城染色體陽性慢性粒細(xì)胞白血病中，CHP-1與BCR-ABL信號協(xié)同作用，可降低伊馬替尼的治療效果，但低表達(dá)CHP-1患者骨髓中的ROCK抑制劑可恢復(fù)伊馬替尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，表明ROCK抑制劑聯(lián)合伊馬替尼治療可以克服低表達(dá)CHP-1患者的耐藥性[31]。

此外，miR-26b可通過靶向CHP-1蛋白抑制乙型肝炎病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[32]。CHP-1蛋白(而非CHP-1信使RNA)與miR-26b的 3′非翻譯區(qū)信使RNA互補(bǔ)，降低miR-26b的過表達(dá)。乙型肝炎病毒感染可抑制肝細(xì)胞miR-26b的表達(dá)，增加CHP-1蛋白的表達(dá)。C型尼曼匹克病多見兒童,患兒出生后發(fā)育多正常，少數(shù)有早期黃疸，常以肝脾腫大為首發(fā)表現(xiàn)，多在5～7歲出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，表現(xiàn)為智力減退、語言障礙、學(xué)習(xí)困難、感情易變、步態(tài)不穩(wěn)、共濟(jì)失調(diào)、震顫、肌張力及腱反射亢進(jìn)、驚厥、癡呆、眼底可見櫻桃紅斑或核上性垂直性眼肌癱瘓，患者CHP-1蛋白低表達(dá)可能與I1061T突變相關(guān)[33]。

6 小 結(jié)

CHP-1是系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的保守蛋白質(zhì)，人體各器官均有表達(dá)，是一種具有調(diào)節(jié)鋅離子能力的金屬蛋白，可通過抑制ROCK激酶活性調(diào)節(jié)中心體的復(fù)制，活化HSP90的分子伴侶活性的作用，保護(hù)細(xì)胞免受致死性應(yīng)激損傷。CHP-1在乳腺癌、肺癌、非典型慢性粒細(xì)胞白血病、乙型肝炎和C型尼曼匹克病均有異常表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和耐藥密切相關(guān)，但目前仍主要集中于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究階段，尚缺乏相關(guān)臨床試驗(yàn)研究證據(jù)的支持，期待其成為未來抑制腫瘤的新靶點(diǎn)。