微滲漏檢測方法的研究進(jìn)展

方玉葉，呂長海

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科，昆明 650106)

完善的根管治療需要良好的冠方及根方封閉，可防止根管與根尖周之間組織液的微循環(huán)以及口腔內(nèi)細(xì)菌的滲入與根管內(nèi)殘留細(xì)菌的影響[1]。微滲漏指充填材料與牙體間或充填材料自身的微小間隙使口腔內(nèi)微生物及其代謝產(chǎn)物、化學(xué)物質(zhì)、液體、分子或離子等滲入，微滲漏的深度可至窩洞的底部，從而引起過敏反應(yīng)、繼發(fā)齲、牙髓刺激和邊緣染色等[2]。牙體組織與充填材料不密合可導(dǎo)致微滲漏的發(fā)生，是根管治療失敗最主要的原因，且冠方微滲漏較根尖微滲漏更容易導(dǎo)致治療失敗[3]。此外，臨床醫(yī)師的操作充填技術(shù)、密封劑的理化性能和玷污層的去除程度等因素對(duì)微滲漏也有較大影響。

目前，微滲漏檢測大多通過體外研究觀察。常用的檢測方法有染料滲漏法、染料提取法、流體濾過法、電化學(xué)法、微生物滲透法、葡萄糖滲漏法、放射線同位素、掃描電子顯微鏡、微型計(jì)算機(jī)斷層X線掃描等[4]。但關(guān)于封閉劑封閉能力的研究尚未達(dá)成共識(shí)，現(xiàn)對(duì)近年來微滲漏檢測方法的研究進(jìn)展予以綜述。

1 染料滲漏法

染料滲漏法由Grossman提出，指將特定染料經(jīng)某種方式滲入需要檢測的目標(biāo)物體中，通過對(duì)染料的觀察評(píng)價(jià)目標(biāo)物體微滲漏情況，操作簡單，是目前最常用的體外檢測方法[5]。封閉根尖2 mm以上的牙體后，根尖浸泡于染料內(nèi)，染料通過根管壁與充填材料或充填材料本身的空隙滲漏，這是一種在常規(guī)大氣壓力下進(jìn)行的被動(dòng)染料滲漏法，可采用縱向剖開、橫向剖面和透明牙法，用線性方法觀察染料的滲漏深度[6]。常用的染料有伊紅、亞甲藍(lán)、印度墨水、堿性品紅、龍膽紫、熒光染料、硝酸銀等[7]。

縱向剖開和橫向剖面是從二維角度觀察滲漏情況?？v向剖開是在立體顯微鏡下觀察滲漏深度，受試驗(yàn)者的主觀影響；隨機(jī)選擇剖開面，通過染料滲透最深點(diǎn)的概率極低，導(dǎo)致低估滲漏。橫向剖面只能確定每一節(jié)是否有滲透，以上兩種方法由于技術(shù)本身(鋸片厚度)會(huì)造成牙本質(zhì)組織和染料的部分丟失[6]。

透明牙法是通過10%硝酸脫礦、不同濃度乙醇溶液脫水和水楊酸甲酯浸泡的過程使牙齒變透明，以便提供根管內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)的三維圖像，其優(yōu)點(diǎn)是沒有牙體組織損失，更清晰地觀察側(cè)副根管滲漏區(qū)域及充填材料與根尖孔的關(guān)系[8-9]。若脫礦脫水不完全會(huì)降低牙齒的透明度，牙齒長期浸泡在硝酸、乙醇等酸溶液中可引起染料溶解。

被動(dòng)染料滲漏法中根管充填材料間隙內(nèi)空氣會(huì)阻礙染料滲漏，故出現(xiàn)了真空或離心狀態(tài)下的主動(dòng)染料滲透法[4]。但有研究表明，染料更容易滲漏到無水空隙，故主動(dòng)染料滲漏法的滲漏明顯高于被動(dòng)染料滲漏法[10]。染料滲透法是一種定性實(shí)驗(yàn)，因具有較好的敏感性、易用性、便利性和成本效益而應(yīng)用廣泛[11]。但由于擴(kuò)散現(xiàn)象不能立刻得到結(jié)果,故需對(duì)樣本進(jìn)行破壞性分析，不能重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2 染料提取法

染料提取法是基于染料滲漏法的一種定量實(shí)驗(yàn)，除根尖以外的牙體組織被封閉，在正常大氣壓下，浸泡在染料內(nèi)48～72 h，流水沖洗30 min清除牙體表面的封閉材料，放入酸性溶液(如65%硝酸)3 d，釋放出界面所有染料，再將液體置入離心機(jī)離心(14 000 r/min，5 min)[12-13]?；诿糠N物質(zhì)特有的吸收光譜，不同染料對(duì)光的選擇性吸收波長及相應(yīng)的吸收系數(shù)是固定的物理常數(shù)，應(yīng)用分光光度計(jì)進(jìn)行光學(xué)密度分析，取離心后的上層均一溶液，測定出溶液中染料對(duì)光的吸收度，從而計(jì)算出染料的含量[14]。亞甲藍(lán)、甲苯胺藍(lán)、堿性品紅分子大小與細(xì)菌毒素相似，常用吸光度法測定[15]。染料提取法操作簡單，不需要昂貴的設(shè)備，但溶液中的雜質(zhì)及溫度變化等均可影響測量結(jié)果。

3 流體濾過法

流體濾過法通過氣泡在微量管內(nèi)的位移距離計(jì)算微滲漏，經(jīng)改造用于根管微滲漏的測量，樣本冠方與大氣壓下裝滿水的管道連接，根尖與帶刻度的微量管相連，由冠方向根尖施加恒定的壓力，當(dāng)樣本存在間隙時(shí)，水通過間隙使微量管中氣泡發(fā)生位移，根據(jù)記錄的位移距離及流體動(dòng)力源公式計(jì)算微滲漏[16]。目測觀察位移存在一定誤差，現(xiàn)采用計(jì)算機(jī)控制和數(shù)字氣壓設(shè)備，基于光的折射反應(yīng)通過計(jì)算機(jī)控制的激光二極管觀察氣泡運(yùn)動(dòng)[17]。

流體濾過法是定量實(shí)驗(yàn)，不破壞樣本，不需要示蹤劑，消除了分子大小、與牙本質(zhì)親和力或pH等有關(guān)因素的影響；可在不同時(shí)間反復(fù)測量，通過改變施加壓力或微量管直徑來調(diào)節(jié)系統(tǒng)靈敏度，但不能反映微滲漏發(fā)生的位置[18-19]。測量時(shí)間、施加壓力、含氣泡管的直徑、氣泡長度等沒有標(biāo)準(zhǔn)化，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同[20]。長時(shí)間高壓會(huì)導(dǎo)致樣本新的間隙形成[21]。染料提取法與流體濾過法都考慮到材料的多孔性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定相關(guān)性，但流體濾過法測量時(shí)，液體可在空隙中達(dá)到平衡，使濾過減少[22]。

4 電化學(xué)法

金屬與腐蝕性物質(zhì)接觸，可通過電極反應(yīng)(一種電化學(xué)反應(yīng))發(fā)生腐蝕。Jacobsen和Fraunhofer[23]依靠離子在空間內(nèi)擴(kuò)散進(jìn)行了電化學(xué)微滲漏實(shí)驗(yàn)，將除冠部和根尖牙體外都封閉，冠部和根尖被分別浸泡在兩個(gè)獨(dú)立電解質(zhì)溶液中，將電解質(zhì)中的電極與穩(wěn)壓器連接，用電流計(jì)測量通過充填材料的電流，根據(jù)歐姆定律得出樣本阻抗。微滲漏大小與阻抗值成反比、與電流大小成正比，電流大小與電解質(zhì)與電極的接觸面積成正比[24]。

穩(wěn)壓器分為直流穩(wěn)壓器和交流穩(wěn)壓器。應(yīng)用直流電靈敏度有限，且可產(chǎn)生極化效應(yīng)，只有電解質(zhì)擴(kuò)散到整個(gè)界面時(shí)才能進(jìn)行記錄測量，且不能用于測量冠部密封缺損樣本；而交流電連續(xù)測量時(shí)不產(chǎn)生極化效應(yīng)，低值電位(40 mV)對(duì)牙體內(nèi)部電荷分布不產(chǎn)生干擾，封閉后可立刻測量電流值，此方法敏感，較常使用[25]。

電化學(xué)法是一種定量實(shí)驗(yàn)，無損樣本，可長時(shí)間對(duì)同一樣本進(jìn)行多次測量，并可評(píng)估熱循環(huán)、老化、機(jī)械應(yīng)力等對(duì)牙齒與充填界面的影響[25]。但電解質(zhì)的組成、電極類型及各電極之間距離、電極厚度等會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響；電極上腐蝕沉積物的積累阻礙離子流動(dòng)擴(kuò)散，影響電流值的準(zhǔn)確表達(dá)[26-27]。測定樣本的充填修復(fù)體只適用于非金屬材料，而對(duì)于金屬材料的結(jié)果并不準(zhǔn)確[28]。

5 微生物滲透法

人體口腔是個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境，存在種類繁多的天然菌群，各部位微生物群體差異很大，細(xì)菌微生物較染料等物質(zhì)更能體現(xiàn)臨床相關(guān)性，故Goldman等提出微生物滲漏法[29]。檢測微生物滲漏主要有雙室滲漏模型、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)及聚合酶鏈反應(yīng)3種方法。最常用的是雙室滲漏模型，實(shí)驗(yàn)前對(duì)滲漏裝置進(jìn)行消毒，充填物冠方是含細(xì)菌的培養(yǎng)液，根尖是無菌培養(yǎng)基，封閉除根尖2 mm外的牙體，無菌培養(yǎng)基變渾濁則表明發(fā)生微滲漏[30]。在SEM和聚合酶鏈反應(yīng)中，可直接在根管或牙本質(zhì)小管中觀察到或檢測到細(xì)菌[31]。對(duì)目標(biāo)微生物檢測具有較高的特異性是聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)，也適用于封閉前根管內(nèi)有細(xì)菌殘留的情況[32]。

常見的示蹤菌有糞腸球菌、變異鏈球菌、表皮葡萄球菌、產(chǎn)黑普氏菌、嗜酸乳桿菌、齒狀放線菌、熒光假單胞菌、具核梭桿菌、白色念珠菌等，可以是單一細(xì)菌或混合菌群，但結(jié)論因細(xì)菌種類不同而不同。糞腸球菌是最常用的示蹤菌，它是正?？谇坏木航M成，也是根管內(nèi)最常見的微生物，常合并需氧和厭氧菌感染[33]。利用唾液進(jìn)行微生物泄漏實(shí)驗(yàn)，可以刺激根管內(nèi)殘留細(xì)菌的生長繁殖，更好地模擬單一細(xì)菌或混合菌群滲漏的臨床環(huán)境，但不能模擬溫度和唾液流動(dòng)等變化[34]。

微生物滲透法是一種定性實(shí)驗(yàn)，較好地模擬了臨床和生物環(huán)境，細(xì)菌微生物的大小、生物活性都與口腔病理生理活動(dòng)相關(guān)；細(xì)菌不能到達(dá)的微小空隙，其產(chǎn)物可以滲入，且細(xì)菌產(chǎn)物可早于細(xì)菌進(jìn)入根管系統(tǒng)。只要有一種細(xì)菌通過封閉的根管就會(huì)在培養(yǎng)基中繁殖引起渾濁，且不能估計(jì)根尖感染時(shí)間；此外，具有抗菌性能的材料(如丁香酚糊劑)不能用微生物法測定微滲漏[5]。

6 葡萄糖滲漏法

葡萄糖具有親水性和化學(xué)穩(wěn)定性，是細(xì)菌微生物所需的營養(yǎng)物質(zhì)，分子量很小(重均分子量為180)，可使根管內(nèi)殘留的細(xì)菌繁殖，有較好的臨床相關(guān)性[35]。Xu等[20]用葡萄糖作為示蹤物來分析根管微滲漏，充填物冠方是葡糖糖溶液，通過靜水壓力使葡萄糖分子滲入根管，抽取根尖區(qū)溶液，用分光光度計(jì)測量濾過根管的葡萄糖含量，通過葡糖糖氧化酶-過氧化物酶法得出葡萄糖濃度，從而算出不同時(shí)間間隔的微滲漏。分光光度計(jì)檢測值在0.02～1.2(相當(dāng)于葡萄糖濃度0.6～79.6 mg/L)，低于最低值將被忽略，超過最高值將無法檢測[36]。有報(bào)道用分光光度計(jì)和葡萄糖試紙得出的葡萄糖濃度平均值相似，兩者之間存在相關(guān)性，葡萄糖試紙費(fèi)用較低，是檢測葡萄糖滲漏值的有效方法[37]。

葡萄糖滲漏法是一種定量實(shí)驗(yàn)，能夠連續(xù)無創(chuàng)測量微滲漏，具有成本低，特異度和靈敏度高的特點(diǎn)，且不受觀察者主觀因素影響[38]。但操作中存在較難維持無菌狀態(tài)、葡萄糖水分消耗和蒸發(fā)、葡萄糖可能滲漏到牙本質(zhì)而非根尖等問題。有研究表明，葡萄糖在堿性環(huán)境下可轉(zhuǎn)化為不能被檢測的葡萄糖酸鹽，根管充填材料sealer 26及礦化物三氧化物凝聚體含有氫氧化鈣，根管消毒時(shí)殘留的氫氧化鈣會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不適合用葡萄糖滲漏法，故有學(xué)者提出用蔗糖代替葡萄糖作為示蹤物[39-40]。

7 放射性同位素

放射性同位素是將含同位素的溶液放置在充填材料冠方，可定量測量根尖滲出同位素的放射活性，常用的示蹤劑有14C、45Ca、131I、32S、22N、99Tc等。γ計(jì)數(shù)器具有較高的靈敏度和特異度，可以精確地計(jì)算出放射性物質(zhì)的劑量，直觀反映出微滲漏的大小，測量時(shí)不受操作者的主觀影響。放射性同位素顆粒約為40 nm，最小的色素顆粒為120 nm，細(xì)菌的大小為50～1 000 nm，具有高度的穿透性，可以提供更精確的微泄漏量信息[41]。但有研究表明，同位素45Ca與牙齒和部分修復(fù)材料有親和力，且能滲入其中，并導(dǎo)致測量誤差[26]。放射性同位素具有較好的重現(xiàn)性和較高的準(zhǔn)確性，但相同材料的形狀和表面紋理不同可影響放射性同位素的黏附程度，導(dǎo)致測量結(jié)果不同；測量時(shí)需要精密的材料和儀器，具有放射性損害，目前較少使用[18]。

8 SEM

SEM是檢測和分析實(shí)體對(duì)象最常用的工具，通過聚焦電子束向樣本發(fā)射電子，依據(jù)電子與樣本中原子的相互作用，檢測樣本中發(fā)射的次級(jí)電子，探測體收集次級(jí)電子后，轉(zhuǎn)化為不同強(qiáng)度的電信號(hào)，可獲取被測樣本的各種理化性質(zhì)信息，形成完整的圖像[42]。

SEM是一種定性方法，常與染料滲漏法結(jié)合用于觀察滲漏的程度。采集速度快、放大倍數(shù)大，圖像分辨率高，樣本損傷和污染程度小，可從多個(gè)角度同時(shí)對(duì)樣品表面進(jìn)行三維成像。但需要特殊的設(shè)備和真空條件，檢測前樣本需脫水和干燥，否則可能導(dǎo)致充填材料間產(chǎn)生裂隙，影響微滲漏。

9 微型CT

微型CT是一種三維成像方法，其分辨率與光學(xué)顯微鏡相當(dāng)，已應(yīng)用于口腔領(lǐng)域。隨著微型CT技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)可用于檢測裂縫及微滲漏[43]。臨床上，微型CT的分辨率(體素<0.001 mm)較CT及磁共振高(體素0.7 mm)，可更好地描述較小結(jié)構(gòu)，并對(duì)三維數(shù)據(jù)集進(jìn)行處理，以建立精確的解剖模型[44]。

掃描儀X射線垂直樣本，用光敏探測器記錄未吸收的光子信號(hào)，利用圖像分析軟件將輻射不透明度轉(zhuǎn)換為灰度值，最終成像取決于材料原子序數(shù)和質(zhì)量密度，高于閾值的灰度值自動(dòng)轉(zhuǎn)換為“白色”，而低于閾值的灰度值被轉(zhuǎn)換為“黑色”。如果組織間密度相似，將很難視覺識(shí)別，則需要浸泡或注射造影劑[45-46]。

微型CT結(jié)合三維重建技術(shù)可定量微滲漏，并立體重現(xiàn)微滲漏形態(tài)；定位準(zhǔn)確，可在干預(yù)前后進(jìn)行評(píng)估，測量充填材料中的間隙體積，同時(shí)保持樣本完整性。但微型CT的測量精度(1.8 μm)較電子顯微鏡(0.25 μm)低，需要特殊儀器輔助操作，測量的時(shí)間和成本較高[47]。

10 小 結(jié)

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各種新技術(shù)和新設(shè)備的出現(xiàn)對(duì)口腔和臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展起重要作用。在口腔臨床實(shí)踐中，緊密密封根管非常重要，目前關(guān)于微滲漏的檢測方法較多，由于尚無不同檢測方法的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，且受觀察者主觀因素的影響，故使用同一種檢測方法結(jié)果也存在一定的差異，從而干擾研究的最終結(jié)果。微滲漏檢測方法基本均在體外進(jìn)行，以人類離體牙為樣本，模擬臨床封閉操作，故實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床有一定的相似，但人類口腔內(nèi)環(huán)境多變，充填材料受食物溫度變化、咀嚼力等因素影響，其中熱因素對(duì)微滲漏的影響最大，故不能完全模擬口腔內(nèi)微生態(tài)的環(huán)境變化。因此，進(jìn)一步研究微滲漏實(shí)驗(yàn)的臨床相關(guān)性及不同微滲漏檢測方法之間的可靠性和相關(guān)性，更好地將不同方法結(jié)合，從而得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果，對(duì)提高臨床治療效果具有重要意義。