中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白在腫瘤生物學(xué)行為中的研究進(jìn)展

蘇澤鑫，楊炳生，劉正偉，林荔軍

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院關(guān)節(jié)骨病外科，廣州 510282)

脂質(zhì)運載蛋白(lipocalin，LCN)家族是一群由小分子量的細(xì)胞外分泌性蛋白組成的超家族，最早于1987年被Pervaiz和Brew[1]發(fā)現(xiàn)并命名。LCN家族成員的平均長度約為175個氨基酸殘基，雖然其家族成員一級結(jié)構(gòu)的相似性僅為25%，不同成員的氨基酸序列具有極大的多樣性，但它們都具有高度相似的三級結(jié)構(gòu)，即由8個方向平行的β折疊構(gòu)成的8鏈β-桶狀結(jié)構(gòu)[2]，其共同特點是能作為載體結(jié)合并轉(zhuǎn)運一系列小疏水分子，如脂肪酸、類固醇、信息素和前列腺素等。自1996年起，LCN家族被認(rèn)為廣泛分布于人體器官組織中并參與相應(yīng)的生理功能[3]。中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)作為LCN家族的重要成員，過去將其單純歸類為轉(zhuǎn)運蛋白。但有研究表明，NGAL在多種細(xì)胞過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、代謝、凋亡、分化等作用[4]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，NGAL也介導(dǎo)多種腫瘤的生成、進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程[5]。目前，有關(guān)NGAL在腫瘤中的作用已成為研究熱點，因此全面深入地了解NGAL在腫瘤發(fā)生與進(jìn)展中的作用十分重要。現(xiàn)就NGAL在腫瘤生物學(xué)行為中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 NGAL概述

NGAL由位于染色體基因座9q34.11的一段包含7個外顯子與6個內(nèi)含子的基因所編碼，是一種含有198個氨基酸序列的分泌性糖蛋白。其N端為310-螺旋，C端為α螺旋，中間為保守的8鏈β-桶狀結(jié)構(gòu)，三者共同構(gòu)成NGAL的三級結(jié)構(gòu)。與LCN家族的其他蛋白成員相比，NGAL的8鏈β-桶狀結(jié)構(gòu)更大，與配體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域更淺，且NGAL的β-桶狀結(jié)構(gòu)封閉末端的β4-β5環(huán)附近有游離的巰基，可以與配體結(jié)合形成二硫鍵，從而調(diào)節(jié)蛋白的活性和功能，這也是NGAL與基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)前體相結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[6]。

最初NGAL被鑒定為分子量為25 000的糖蛋白，其能與高疏水親和力鐵載體(血小板活化因子、細(xì)菌性腸螯合素和內(nèi)源性兒茶酚胺等)結(jié)合，因此最早認(rèn)為NGAL作為抗細(xì)菌免疫因子存在，可通過耗竭鐵抑制細(xì)菌生長并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[7-8]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NGAL在體內(nèi)存在3種分子形式：單體(25 000)、二硫鍵連接的同源二聚體(46 000)和二硫鍵連接的異二聚體(135 000)[9]。其中，NGAL的同源二聚體(46 000)可在人中性粒細(xì)胞中與MMP-9通過二硫鍵共價結(jié)合，從而在不同組織器官中發(fā)揮不同的生物學(xué)功能[10]。通常NGAL在人體內(nèi)主要在炎癥或損傷期間的中性粒細(xì)胞和其他細(xì)胞類型中表達(dá)，且NGAL在體內(nèi)的合成主要來源于粒細(xì)胞成熟過程早期的髓細(xì)胞階段，而外周血中的成熟粒細(xì)胞缺少NGAL的信使RNA表達(dá)[11]。因此在人體正常外周循環(huán)中，僅能檢測到極低水平的NGAL表達(dá)，而NGAL的表達(dá)水平在外周血中性粒細(xì)胞中升高，這預(yù)示著機(jī)體處于某種病理狀態(tài)，如炎癥、感染、腫瘤等。

2 NGAL在機(jī)體中的調(diào)控作用

據(jù)報道，NGAL在機(jī)體多種病變過程中存在異常表達(dá)，包括炎癥反應(yīng)[12]、腎臟與肝臟損害[13-14]及腫瘤[15]。目前，NGAL的蛋白表達(dá)水平已被證明在多種腫瘤中異常高表達(dá)，包括乳腺癌[16-17]、結(jié)腸癌[18]、肺癌[19]、卵巢癌[20]等。然而一項研究表明，NGAL在口腔癌的原發(fā)惡性和轉(zhuǎn)移腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)[21]。大量研究表明，NGAL的高表達(dá)與高度惡性腫瘤的復(fù)發(fā)傾向和預(yù)后不良相關(guān)[15, 22-23]。Cymbaluk-Ploska和Chudecka-Glaz[24]研究認(rèn)為，NGAL可用于子宮內(nèi)膜癌患者手術(shù)治療前的腫瘤分期評估。此外，Roli等[25]針對NGAL作為癌癥預(yù)后和診斷標(biāo)志物潛在價值的薈萃分析結(jié)果顯示，生物體液(血清和尿液)中的高NGAL水平可用于預(yù)測結(jié)直腸癌和乳腺癌患者的無病生存率，但其預(yù)后和診斷準(zhǔn)確性在其他人類腫瘤中仍不確定，如胰腺癌、狀腺癌、肝癌、肺癌、食管癌、口腔癌和腎癌。研究認(rèn)為，NAGL的異常表達(dá)主要通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡、血管生成、侵襲與遷移及化療藥物敏感性等在腫瘤中發(fā)揮重要作用，而NGAL在不同腫瘤中的功能調(diào)控機(jī)制不同，見表1。

表1 NGAL在不同腫瘤中調(diào)控的生物學(xué)行為及相關(guān)機(jī)制

NGAL：中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子-β1；EMT：上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；NF-κB：核因子κB；caspase-9：胱天蛋白酶-9；Nrf2：核因子E2相關(guān)因子2；HO-1：血紅素加氧酶1；VEGF：血管內(nèi)皮生長因子；HIF-1α：缺氧誘導(dǎo)因子1α；PI3K：磷脂酰肌醇-3-激酶；AKT：蛋白激酶B；ERK：胞外信號調(diào)節(jié)激酶；NFAT1：活化T細(xì)胞核因子1；Rac1：Ras相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物1；SULF2：硫酸酯酶2；EGFR：表皮生長因子受體；Wnt/β-catenin：Wnt/β聯(lián)蛋白；-：未報道

2.1 調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡 腫瘤細(xì)胞無限增殖的生長特性是腫瘤發(fā)生的始動環(huán)節(jié)，研究表明，NGAL在不同腫瘤中對腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡具有不同的調(diào)控模式[26-28]。Wang等[26]研究認(rèn)為，NGAL能通過轉(zhuǎn)化生長因子-β1/NGAL/Twist1通路下調(diào)肝細(xì)胞癌細(xì)胞株的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。Kim等[27]通過對結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29、DLD-1、SW480、HCT116和SW620的體外細(xì)胞實驗認(rèn)為，NGAL的高表達(dá)對腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且能進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。而Han等[28]在對胃癌MGC-803細(xì)胞株的研究中發(fā)現(xiàn)，沉默NGAL基因可導(dǎo)致細(xì)胞處于G0/G1期的數(shù)量增加，S期和G2/M期百分比降低，且NGAL的下調(diào)通過調(diào)控核因子κB相關(guān)通路抑制MGC-803細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Leng等[29]對人慢性髓系白血病的研究發(fā)現(xiàn)，NGAL的表達(dá)在小鼠動物模型體內(nèi)促進(jìn)腫瘤生成的同時，對體內(nèi)正常造血細(xì)胞也起到了促進(jìn)凋亡的作用，從而進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。Song等[30]對肺腺癌的研究表明，NGAL可通過激活核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶1途徑并誘導(dǎo)血紅素加氧酶1和超氧化物歧化酶1的表達(dá)預(yù)防氧化應(yīng)激，進(jìn)一步抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長。研究表明，NGAL基因的啟動子區(qū)域含有許多轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，如核因子κB，而核因子κB作為調(diào)控細(xì)胞增殖凋亡重要信號通路的調(diào)控因子，在影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Nanashima等[31]報道，磷脂酶A2Ⅳc(Pla2g4c)基因敲除小鼠可通過介導(dǎo)核因子κB/NGAL通路的表達(dá)誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制成瘤作用。以上研究結(jié)果表明，NGAL對腫瘤增殖的調(diào)控作用可能與組織特異性密切相關(guān)?？梢?，NGAL在腫瘤細(xì)胞中的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)具有一定的復(fù)雜性。雖然體外實驗發(fā)現(xiàn)，NGAL在不同腫瘤細(xì)胞中的調(diào)控增殖行為存在差異[26-28]；但大部分體內(nèi)實驗表明，NGAL對腫瘤的增殖具有促進(jìn)作用，提示NGAL可能是腫瘤治療中一個新的潛在治療靶點[29-31]。

2.2 調(diào)控腫瘤血管生成 腫瘤的發(fā)生和增殖需要持續(xù)的氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)，且腫瘤的血管生成對于惡性實體瘤的生長和進(jìn)展十分重要。然而由于腫瘤組織生成的新生血管為不完整的薄弱管狀結(jié)構(gòu)，具有較高的滲透性，有助于腫瘤細(xì)胞遷移入血從而發(fā)展為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，所以抑制腫瘤的血管生成對腫瘤的治療具有重要作用[47]。文獻(xiàn)報道，乳腺癌患者腫瘤組織和尿液中的NGAL水平均升高，且其升高水平與乳腺癌的進(jìn)展相關(guān)，提示NGAL可作為乳腺癌的診斷和預(yù)后標(biāo)志物[32]。Guo等[33]研究證明，NGAL可通過升高血管內(nèi)皮生長因子水平刺激新血管形成，且通過對NGAL基因的瞬時敲低或干擾小RNA沉默也可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞腫瘤血管生成減少。Leung等[34]對胰腺導(dǎo)管癌BxPC3和HPAF-Ⅱ細(xì)胞株的研究發(fā)現(xiàn)，NGAL可通過胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)基因缺氧誘導(dǎo)因子1α和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)。Meka等[35]分析了NGAL啟動子甲基化狀態(tài)與乳腺癌患者微血管形成的關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)67.2%(43/64)的乳腺癌患者NGAL啟動子為非甲基化狀態(tài)，32.8%(21/64)的患者NGAL啟動子為甲基化狀態(tài)；而NGAL啟動子非甲基化狀態(tài)與腫瘤細(xì)胞的侵襲性表型和平均微血管密度升高有關(guān)。這些結(jié)果表明，NGAL通過促進(jìn)腫瘤內(nèi)的血管生成調(diào)控腫瘤微環(huán)境的改變，從而促進(jìn)腫瘤的生長和血行轉(zhuǎn)移。

2.3 調(diào)控腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移 目前在腫瘤的臨床治療中，雖然系統(tǒng)性治療方法(新輔助化療、手術(shù)、輔助化療等)降低了惡性腫瘤相關(guān)病死率，但腫瘤的轉(zhuǎn)移率高仍與大部分腫瘤的臨床預(yù)后差有關(guān)。因此，如何抑制和治療腫瘤的轉(zhuǎn)移是目前腫瘤研究的難點與熱點。Mannelqvist等[36]研究發(fā)現(xiàn)，NGAL的表達(dá)程度與子宮內(nèi)膜癌的惡性程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率和生存預(yù)后顯著相關(guān)。Zhang等[48]對138例肝細(xì)胞癌的腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，NGAL的表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌的腫瘤TNM分期、復(fù)發(fā)率均顯著相關(guān)。Lin等[37]研究發(fā)現(xiàn)，NGAL的基因及蛋白表達(dá)水平與口腔癌患者的分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示NGAL在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用。

研究顯示，NGAL通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮介導(dǎo)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用[4]。雖然NGAL最早被發(fā)現(xiàn)能與MMP-9結(jié)合，但有研究表明NGAL與MMP-9結(jié)合形成的復(fù)合物可阻止MMP-9的自身降解，并進(jìn)一步增加MMP-9的活性；另外，MMP-9本身可降解細(xì)胞外基質(zhì)和基膜，因此NGAL和MMP-9/NGAL復(fù)合物的形成有助于腫瘤的進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[49]。Koh和Lee等[38]研究表明，胃癌細(xì)胞中NGAL的上調(diào)可通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/核因子κB通路促進(jìn)MMP-9的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。Ding等[39]研究發(fā)現(xiàn)，NGAL可通過介導(dǎo)胞外信號調(diào)節(jié)激酶/SLUG通路誘導(dǎo)細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化作為腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)關(guān)鍵機(jī)制之一，進(jìn)一步促進(jìn)了前列腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。Gaudineau等[40]對乳腺癌的研究表明，活化T細(xì)胞核因子1可誘導(dǎo)下游NGAL的表達(dá)，而NGAL的高表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移。此外，NGAL還可通過下調(diào)小鼠乳腺癌細(xì)胞磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的肺部轉(zhuǎn)移[41]。Hu等[42]研究發(fā)現(xiàn)，沉默NGAL減少了結(jié)腸癌細(xì)胞株KM12C和DLD1的侵襲行為；同時，該研究還進(jìn)一步證明NGAL可通過影響Ras相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物1和上皮鈣黏素的亞細(xì)胞定位調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移行為。相反，部分研究則認(rèn)為NGAL在腫瘤侵襲和遷移中具有保護(hù)性的調(diào)控作用[27, 50-51]。Feng等[50]在結(jié)腸癌的研究中認(rèn)為，NGAL的上調(diào)會抑制核因子κB通路的表達(dá)，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株的侵襲和遷移。Kim等[27]研究認(rèn)為，NGAL在發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中低表達(dá)，在未發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，提示NGAL的高表達(dá)與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。此外Lee等[51]研究發(fā)現(xiàn)，NGAL可通過抑制c-Jun氨基端激酶和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路的表達(dá)進(jìn)一步抑制肝細(xì)胞癌HCC細(xì)胞株的增殖與侵襲。

2.4 調(diào)控腫瘤化療藥物敏感性 雖然手術(shù)治療是實體惡性腫瘤的主要治療手段，但化療仍是腫瘤治療的重要輔助方法，而化療耐藥是影響腫瘤患者預(yù)后的一個重要原因，目前已有不少學(xué)者對NGAL在化療耐藥性中的作用進(jìn)行了研究。有研究認(rèn)為，NGAL不會影響乳腺癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞中的阿霉素耐藥性[52]。但在其他藥物的研究中，Yu等[53]認(rèn)為NGAL可通過介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子-α的表達(dá)增加腎癌細(xì)胞對舒尼替尼的藥物敏感性。有關(guān)結(jié)腸癌細(xì)胞長春新堿耐藥的研究表明，與非耐藥株細(xì)胞系相比，耐藥株細(xì)胞系的NGAL蛋白表達(dá)減少；同時該研究還觀察到，當(dāng)小干擾RNA下調(diào)NGAL的表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的凋亡被顯著抑制，但對其細(xì)胞周期沒有顯著影響[43]。順鉑作為一種傳統(tǒng)的抗癌化療藥物，在各種腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。Monisha等[21]研究表明，NAGL敲除的口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞通過上調(diào)AMP活化的蛋白激酶/p53/DNA損傷修復(fù)基因1通路的表達(dá)，導(dǎo)致口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性明顯增加，同時也促進(jìn)了口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移。而Miyamoto等[44]研究認(rèn)為，NGAL表達(dá)增加可提高子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性，并促進(jìn)其腫瘤遷移。Yoon等[45]通過藥物基因組學(xué)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，肝癌患者中索拉菲尼耐藥人群的NGAL表達(dá)更高，且進(jìn)一步實驗證明其耐藥性通過硫酸酯酶2/表皮生長因子受體/NGAL通路進(jìn)行調(diào)控。Kim等[46]結(jié)合生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，由RNA聚合酶Ⅱ延長因子3誘導(dǎo)的5-氟尿嘧啶耐藥乳腺癌細(xì)胞株的基因芯片表達(dá)譜中，NGAL的表達(dá)較非耐藥株增加，沉默NGAL的表達(dá)后，耐藥細(xì)胞株則重新恢復(fù)對5-氟尿嘧啶的藥物敏感性。上述研究表明，NGAL在不同腫瘤對不同藥物的敏感性中發(fā)揮重要調(diào)控作用，提示NGAL也可能成為腫瘤藥物治療中的一個潛在突破點。

3 小 結(jié)

NGAL作為LCN家族重要的組成因子，廣泛參與人體生理病理及腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控環(huán)節(jié)。目前認(rèn)為，NGAL參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、血管生成、侵襲與遷移等生物學(xué)進(jìn)程，且通過調(diào)控腫瘤對化療藥物的敏感性影響腫瘤的治療并影響腫瘤患者的預(yù)后。然而，目前對NGAL的腫瘤相關(guān)性機(jī)制研究仍不全面，部分研究在NGAL對不同腫瘤中的調(diào)控作用得出了矛盾的結(jié)果，提示NGAL的腫瘤調(diào)控作用具有組織特異性及復(fù)雜性。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和腫瘤研究的深入，更多關(guān)于NGAL在腫瘤中的調(diào)控作用將會被挖掘并深入探討，未來以NGAL為靶點的生物靶向治療將成為腫瘤研究突破的新熱點，并為腫瘤診斷、治療及預(yù)后評估提供新方向。