間充質(zhì)干細胞及其來源的細胞外囊泡在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的研究進展

衛(wèi) 春，許 珂，張莉蕓

(1.山西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，太原 030001； 2.山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院 山西大醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，太原 030032)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA) 的發(fā)病機制主要包括免疫紊亂、組織細胞損傷及骨破壞。其發(fā)病率及致畸、致殘率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，已成為全球健康保健的重要問題之一。目前，RA的治療主要以緩解癥狀、減少并發(fā)癥為主，但其臨床緩解率僅達50%左右[1]。大量基礎(chǔ)研究表明，間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可有效改善RA動物模型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度，抑制免疫細胞及炎癥細胞因子，促進組織修復(fù)[2-6]。但MSCs來源有限，且靜脈輸注可致心律失常、體內(nèi)異位成骨、成瘤等潛在風(fēng)險限制了其臨床應(yīng)用。而進一步研究發(fā)現(xiàn)，細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)可介導(dǎo)細胞間的信號傳達，釋放生物活性物質(zhì)、信使RNAs、微RNAs(microRNAs，miRNAs)等。EVs依據(jù)細胞來源不同發(fā)揮各種功能，且通過不同機制與受體細胞相互作用，如與靶細胞質(zhì)膜融合，或通過內(nèi)吞作用內(nèi)化，或與細胞表面受體相互作用，誘導(dǎo)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等[7-9]。由于間充質(zhì)干細胞來源的細胞外囊泡(extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells，MSC-EVs)可模擬其母體細胞發(fā)揮治療作用，且可規(guī)避細胞療法的潛在風(fēng)險，故MSCs-EVs逐漸成為研究熱點?，F(xiàn)就MSCs及MSCs-EVs在RA中的研究進展予以綜述。

1 MSCs特性

MSCs是來自骨髓、脂肪、牙髓和臍帶等各種組織的成熟干細胞，其中具有治療作用的主要來源于骨髓和脂肪組織，其可分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞[10]。此外，MSCs還可通過分泌生長因子、細胞因子、趨化因子等多種營養(yǎng)因子，發(fā)揮抗炎、促增殖、抗凋亡、抗纖維化、促血管生成作用[7]。

MSCs的分化潛能和旁分泌功能，使其與骨軟骨缺損、骨關(guān)節(jié)病的軟骨修復(fù)和組織重建密切相關(guān)。MSCs在特定培養(yǎng)基條件下分化為軟骨細胞，并產(chǎn)生分泌軟骨細胞外基質(zhì)的分化細胞，分化的軟骨細胞性能接近原始透明軟骨。為獲得更多功能成熟的軟骨細胞，在臨床前動物模型中，Vinatier等[11]研制出多種方法將MSCs與仿生支架和生長因子相結(jié)合，以支持軟骨細胞分化，形成功能性透明關(guān)節(jié)軟骨。

MSCs的抗纖維化作用被證明是通過肝細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和腎上腺髓質(zhì)的產(chǎn)生來介導(dǎo)[12]。在損傷組織中，MSCs通過產(chǎn)生抗氧化分子發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，如血紅素加氧酶1和促紅細胞生成素[13]。當(dāng)暴露于炎癥環(huán)境時，MSCs可以發(fā)揮抗炎作用，即腫瘤壞死因子-α、白細胞介素(interleukin，IL)-1β或IL-1α等炎癥因子激活MSCs，使其獲得免疫抑制特性，調(diào)節(jié)固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，抑制CD4+和CD8+T細胞的增殖、分化，誘導(dǎo)CD4+CD25+叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg細胞)產(chǎn)生[14]。此外，MSCs還可通過抑制Toll樣受體的活化和誘導(dǎo)耐受性IL-10的產(chǎn)生，抑制樹突狀細胞活化和成熟，并通過誘導(dǎo)炎癥M1型向M2型巨噬細胞亞群的轉(zhuǎn)化，抑制自然殺傷細胞活化[15]。這些免疫抑制功能由接觸依賴性機制介導(dǎo)，主要調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的釋放，如吲哚胺2，3-雙加氧酶、一氧化氮、IL-6、前列腺素E2、腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子誘導(dǎo)基因6、人類白細胞抗原G5、IL-1受體拮抗劑等[16]?？梢姡琈SCs通過分泌和旁分泌機制產(chǎn)生大量介質(zhì)，在風(fēng)濕性疾病，尤其是RA患者的治療中具有重要的應(yīng)用價值。

2 MSCs與RA

RA是一種慢性自身免疫性疾病，以滑膜炎癥為特征，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨漸進性破壞。其發(fā)病率高，致殘性強[1]。研究發(fā)現(xiàn)，免疫細胞在RA的發(fā)生發(fā)展中起核心作用，且針對免疫細胞為治療靶點的生物制劑在一定程度上提高了RA的臨床緩解率，特別是對難治性RA患者，但約30%的患者仍無效[17]。此外，生物制劑價格昂貴，存在誘發(fā)腫瘤、結(jié)核等感染性疾病的風(fēng)險，且停藥后病情容易復(fù)發(fā)。

目前RA的發(fā)病機制尚不清楚，研究多集中在炎癥通路、趨化因子通路及骨破壞通路，其中炎癥通路在RA中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，輔助性T細胞(helper T cell，Th細胞)1和Th17細胞是導(dǎo)致RA發(fā)病的核心T亞群[18]。在RA患者中，由Th1細胞分泌的腫瘤壞死因子-α、IL-1、IL-2、γ干擾素及Th17細胞產(chǎn)生的IL-17、IL-6等炎癥因子水平升高；而Th2細胞、Treg細胞產(chǎn)生的抗炎因子(IL-4、IL-10、IL-35和轉(zhuǎn)化生長因子-β等)水平降低[19]。因此，Th1/Th2及Th17/Treg的失衡與RA的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而IL-1、腫瘤壞死因子-α被認為是RA發(fā)病的重要促炎細胞因子，IL-10、腫瘤壞死因子-β為重要的抗炎細胞因子。B細胞可以分泌包含類風(fēng)濕因子在內(nèi)的各種自身抗體，在RA的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。研究證實，骨髓、脂肪、滑膜、臍帶等來源的異基因MSCs移植對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠具有治療作用[20]。針對RA動物模型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓來源的MSCs移植不僅可改善膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)癥狀、影像學(xué)及病理表現(xiàn)，還可抑制T、B細胞增殖，上調(diào)Treg細胞、下調(diào)Th17細胞水平，抑制促炎因子(腫瘤壞死因子-α、IL-1、IL-17)的表達[3-5]。因此，MSCs在炎癥性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮抗炎作用，其可能成為治療RA的新細胞治療方案。但MSCs在體內(nèi)有導(dǎo)致毛細血管阻塞、異位成骨等潛在風(fēng)險，故使其臨床應(yīng)用受限。且有研究顯示，MSCs治療RA無明顯改善，這可能與動物遺傳背景有關(guān)，也可能與永生化小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞有關(guān)[21]。

3 MSC-EVs與RA

3.1EVs EVs是磷脂雙分子層包繞形成的異質(zhì)性膜分泌體，幾乎所有類型的細胞均可分泌，其存在于各種生物體液(血液、尿、唾液、腦脊液、母乳和其他)中。依據(jù)大小、組成和來源不同，EVs可分為外泌體、微粒(或泡)和凋亡小體[22]。其中，外泌體是由多微囊泡內(nèi)體與細胞質(zhì)膜融合釋放的EVs，其直徑為40～100 nm。微粒也叫微囊泡，是細胞受刺激或應(yīng)激(缺氧誘導(dǎo))產(chǎn)生的EVs，當(dāng)磷脂不對稱分布或細胞骨架重組后微囊泡直接從細胞質(zhì)膜脫落，直徑為100～1 000 nm，其表達親代細胞膜表面受體。凋亡小體是EVs的第三種主要類型，直徑>1 000 nm，誘導(dǎo)晚期細胞死亡的小泡。在病理情況下，微囊泡可能有致病作用，并促進疾病的進展，反過來其也可能保護和防止疾病的發(fā)展。 與其他細胞類型類似，MSC-EVs可通過傳遞信息與其他細胞相互作用來模擬其母體細胞的作用，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、促進組織修復(fù)及再生作用[23-25]。

3.2MSC-EVs在RA中的免疫調(diào)節(jié)作用 在RA、骨關(guān)節(jié)炎、自身免疫性腦脊髓炎等炎癥疾病中，MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用備受關(guān)注。雖然MSC-EVs在RA臨床前模型中的治療效果報道較少，但一些體外研究已證實了MSC-EVs的免疫調(diào)節(jié)作用[23,26-27]。MSC-EVs治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎的研究顯示，MSC-EVs具有免疫抑制作用，其可以減少 T細胞的增殖，增加IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β1的產(chǎn)生，促進細胞凋亡；同時，MSC-EVs也可促進CD4+CD25+Treg細胞的產(chǎn)生，半乳凝素1和膜結(jié)合轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達，這些均是參與免疫耐受的關(guān)鍵分子[23]。另有研究證明了MSC-EVs對T亞群的免疫調(diào)節(jié)作用，當(dāng)人臍帶MSCs來源的EVs與活化的脾臟組織勻漿共培養(yǎng)時，Th17細胞數(shù)量減少、IL-17 水平降低，叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3+Treg細胞數(shù)量增加[26]。Blazquez等[27]研究證實，與MSC-EVs共培養(yǎng)的T細胞，其活化和分化被阻止，這與CD4+T細胞產(chǎn)生的γ干擾素減少有關(guān)。此外，MSC-EVs也可以減少B細胞增殖和分化，使免疫球蛋白的分泌減少[28]。然而有學(xué)者指出，MSC-EVs產(chǎn)生的免疫抑制效果較MSCs弱，且隨著MSC-EVs水平降低，其對T細胞增殖的抑制作用減弱[29]?？梢?，MSCs和MSC-EVs均可以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，且MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用部分是由EVs釋放調(diào)控分子介導(dǎo)。

3.3MSC-EVs在RA中的再生作用 MSC-EVs具有再生作用，包括促血管生成、抗凋亡、抗纖維化、促增殖，其已在一些動物模型中進行研究，包括心肌梗死、腦梗死和急性腎損傷等[30]。關(guān)于MSC-EVs的促血管生成活性，有研究表明，其可通過促血管生成效應(yīng)保護缺血再灌注損傷的腎損傷[24]。基于精準(zhǔn)分辨率的等電聚焦耦合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的蛋白組學(xué)分析顯示，MSC-EVs不僅包含生長因子，如表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、血小板衍生生長因子等，還含有核因子κB信號通路，這些均可促進血管的生成[31]。MSC-EVs中的蛋白質(zhì)因子與靶向血管內(nèi)皮細胞膜相互作用，通過細胞融合延遲信使RNAs的傳遞，最終誘導(dǎo)形成毛細血管樣結(jié)構(gòu)[32]。

MSC-EVs的增殖效應(yīng)在不同的模型，特別是皮膚修復(fù)中被研究。在皮膚損傷修復(fù)過程中，MSC-EVs 能被成纖維細胞吸收并內(nèi)化，以促進細胞遷移、增殖和膠原產(chǎn)生[33]。且四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷可通過MSC-EVs分泌的增殖細胞核抗原增加，促使肝細胞增殖[25]。在急性心肌梗死大鼠模型中，MSC-EVs干預(yù)后心臟功能得到明顯改善[34]。這是因為MSC-EVs可加速內(nèi)皮細胞生成和轉(zhuǎn)移，促進血管形成。

MSC-EVs不僅具有促增殖作用，還有明顯的抗凋亡能力。如當(dāng)骨肉瘤細胞與MSC-EVs共培養(yǎng)時，MSC-EVs通過運輸轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表現(xiàn)出明顯抗凋亡作用，包括單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白、骨形態(tài)生成蛋白2、成纖維細胞生長因子7、基質(zhì)金屬蛋白酶-1和黏著斑激酶1[35]。另一項對順鉑干預(yù)的人腎小管上皮細胞凋亡體外模型進行的研究發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs 可上調(diào)抗凋亡基因，如B細胞淋巴瘤/白血病-xL、B細胞淋巴瘤/白血病-2和人桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)序列8，抑制可誘導(dǎo)細胞凋亡的基因，如胱天蛋白酶(caspase)1、caspase-8和淋巴毒素α[36]。在結(jié)腸炎中，MSC-EVs通過減少caspase-3、caspase-8和caspase-9的裂解抑制細胞凋亡[37]。在單側(cè)輸尿管梗阻腎損傷中，MSC- EVs通過調(diào)節(jié)miRNAs表達，包括miR-299、miR-499、miR-302和miR-200c，發(fā)揮重要的抗凋亡作用[37]。MSC-EVs通過在體內(nèi)外下調(diào)凋亡信號增加腎臟細胞的生存概率。

Li等[38]的研究表明，MSC-EVs具有抗纖維化作用。MSC-EVs可通過減少肝臟組織中的膠原沉積，肝臟中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達，及肝纖維化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中白細胞抑制因子2的磷酸化減輕四氯化碳干預(yù)的肝纖維化肝炎。同樣，在甘油或順鉑引起的腎損傷中，MSC-EVs可減輕腎纖維化，恢復(fù)腎功能[39]。在這些模型中，MSC-EVs 改善了氧化應(yīng)激和減少細胞凋亡，最終增加細胞增殖。

MSC-EVs具有與親代MSCs類似的再生、抗凋亡、抗纖維化和抗炎功能，為其母體細胞在治療RA方面的應(yīng)用提供了新視角。但關(guān)于MSC-EVs治療RA國內(nèi)外研究較少。Zhang等[40]的研究證明，在免疫功能低下的大鼠骨軟骨缺損模型中，MSC-EVs 可促進軟骨再生，且注射EVs可加速組織填充、Ⅱ型膠原基質(zhì)的合成和增強黏多糖硫酸化，12周后，經(jīng)MSC-EVs干預(yù)的大鼠軟骨和軟骨下骨完全愈合[40]。該研究證明了MSC-EVs在體內(nèi)促進軟骨修復(fù)的有效性。

4 小 結(jié)

EVs維持著細胞之間的通訊，并在組織再生過程中發(fā)揮重要作用。但目前對EVs信使作用的認知仍處于初始階段。此外，不同類型的EVs的具體作用尚未明確，影響外泌體或微泡合成和釋放的因素尚未確定。但EVs在風(fēng)濕性疾病病理生理學(xué)中的重要作用，及其作為RA生物標(biāo)志物的可能性值得進一步研究。同時，不同細胞分離的EVs治療的有效性需要在不同的臨床前模型中被評估。雖然MSC-EVs已被證明可能有助于MSCs更好地發(fā)揮治療作用，其可能是RA治療的新手段之一，但對于MSC-EVs在風(fēng)濕性疾病的治療仍研究較少，未來需進一步探討。