新城疫病毒抗惡性腫瘤研究進展

徐婷婷，韓繼武

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院消化科，哈爾濱 150001)

腫瘤是威脅人類生命健康的難治疾病，腫瘤細胞利用自身的高突變性逃避免疫監(jiān)視，抑制免疫反應[1]；同時，腫瘤細胞可進行無限復制、轉移、侵襲組織，最終導致器官衰竭甚至死亡。雖然現(xiàn)有的治療方法在不斷改善，并出現(xiàn)了新的創(chuàng)新療法，但新病例數(shù)每年都在增加[2]。通過避免暴露于常見的危險因素，如煙草、煙霧、酒精和核輻射等，可以預防一部分腫瘤的發(fā)生；此外，通過手術、放療、化療、激素和單克隆抗體治療可以治愈一部分腫瘤，特別是一些發(fā)現(xiàn)較早的腫瘤。但這些針對腫瘤患者的治療方法常在治療后出現(xiàn)嚴重不良反應。理想的腫瘤治療劑是可以選擇性地殺死惡性細胞，同時對正常細胞和組織沒有副作用。溶瘤病毒療法是指通過選取自然界中存在的一些致病力較弱的病毒株或通過對某些病毒進行有目的性的基因改造而形成的具有靶向及殺傷腫瘤細胞功能的病毒來治療腫瘤的一種新方法[3]。其中，新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)可以特異地殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞沒有傷害，是安全、有效的溶瘤試劑[4]。NDV本身的高靶向性及分子生物技術的成熟使其在癌癥治療中的應用研究越來越深入。現(xiàn)就NDV抗惡性腫瘤研究進展予以綜述。

1 NDV的腫瘤選擇性

NDV是一種有包膜、非節(jié)段的負鏈RNA病毒，為副黏病毒亞科的禽副黏病毒屬，共編碼6個結構蛋白：核衣殼蛋白、磷蛋白、基質蛋白、融合蛋白、血凝素-神經氨酸酶蛋白和大聚合酶蛋白。核衣殼蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白形成核糖核蛋白復合物，負責病毒的轉錄和復制[5]；血凝素-神經氨酸酶蛋白和融合蛋白作為表面糖蛋白錨定在病毒包膜中，其中血凝素-神經氨酸酶蛋白負責病毒與宿主細胞受體的連接，融合蛋白負責宿主細胞膜與病毒包膜相融合[6]。

所有RNA病毒的復制生命周期均涉及雙鏈RNA的形成，該雙鏈RNA結構激活基于Ⅰ型干擾素的重要細胞防御系統(tǒng)(α干擾素和β干擾素細胞防御系統(tǒng))發(fā)揮清除病毒的作用。突變的腫瘤細胞通常會使干擾素系統(tǒng)癱瘓，使防御系統(tǒng)細胞增殖受到抑制，清除病毒能力下降[7]。故突變的腫瘤細胞允許NDV在其自身腫瘤細胞中大量復制。NDV的腫瘤選擇性機制可概括為：抗病毒信號轉導途徑激活的缺陷、Ⅰ型干擾素信號通路的缺陷[8]。

NDV對細胞的感染包括兩個步驟：①細胞結合、膜融合、病毒基因組的轉導和轉錄。②使用新生成的核衣殼作為基因組進行病毒復制。NDV感染人或小鼠的正常細胞通常不會進入第二步，但在幾乎所有測試的人或小鼠腫瘤細胞中，NDV感染均進行到第二步，允許腫瘤選擇性復制[9]。與大多數(shù)人類正常細胞相比，NDV在人類腫瘤細胞中的復制速度增加了10 000倍。

2 NDV的抗腫瘤作用機制

2.1誘導腫瘤細胞凋亡 研究表明，NDV能夠通過觸發(fā)內在線粒體途徑和外在死亡受體途徑誘導腫瘤細胞凋亡[10]。在線粒體途徑中，NDV感染在降低腫瘤細胞線粒體膜電位的同時釋放細胞色素C和其他膜間隙蛋白，激活下游胱天蛋白酶9，產生凋亡小體并激活下游胱天蛋白酶3，從而引起腫瘤細胞凋亡。已檢測到NDV血凝素-神經氨酸酶蛋白誘導被感染腫瘤細胞釋放腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體，并與其相應死亡受體結合形成死亡受體復合物，通過Fas相關蛋白和死亡結構域的中間銜接蛋白激活胱天蛋白酶8。內在線粒體途徑和外在死亡受體途徑最終將促進機體啟動胱天蛋白酶級聯(lián)反應，而胱天蛋白酶通過裂解核蛋白及相關細胞器來造成腫瘤細胞凋亡[11]。迄今為止，NDV介導腫瘤細胞凋亡所產生的溶瘤效果已在乳腺癌[12]、宮頸癌[13]、結直腸癌[14]等惡性腫瘤中被證實。

2.2誘導腫瘤細胞自噬性死亡 自噬是一種分解代謝且高度保守的細胞過程。它的基本作用是在營養(yǎng)饑餓和其他壓力條件下回收細胞成分，并被認為是細胞保護事件[15]。對于NDV，只有少數(shù)研究探索病毒感染期間自噬的誘導和影響。而自噬似乎是NDV介導腫瘤細胞死亡反應的重要組成部分，并在感染早期觸發(fā)。NDV感染腫瘤細胞的早期階段產生的自噬反應能夠防止腫瘤細胞的過早消除，有益于病毒自身的復制和存活，并在感染后期誘導腫瘤細胞死亡。Meng等[16]研究發(fā)現(xiàn)，NDV可觸發(fā)人神經膠質瘤中自噬體的形成，表現(xiàn)為膠質瘤細胞在感染病毒后顯示完全自噬通量、自噬蛋白早期的增加和持續(xù)存在以及自噬底物p62的逐漸減少。且使用自噬正調節(jié)劑雷帕霉素病毒的產量增加，使用自噬抑制劑氯喹病毒的產量減少。有研究表明，敲除自噬相關基因可導致NDV復制產量減少[17]，再次證明自噬有益于細胞中NDV的復制。為闡明早期階段自噬能夠抑制腫瘤細胞的過早清除，Meng等[18]研究了人非小細胞肺癌A549細胞對NDV感染的反應。他們觀察到，感染細胞中p62依賴性線粒體自噬過程的誘導，導致NDV感染時受損線粒體的消除、細胞色素C釋放減少，從而抑制腫瘤細胞過早消除。

2.3誘導抗腫瘤免疫 免疫原性細胞死亡是細胞死亡的重要形式，其能誘導強效抗腫瘤免疫的危險相關分子模式(鈣網(wǎng)蛋白、熱激蛋白、高遷移率族蛋白1等)的釋放[19]。這些關鍵危險相關分子模式不僅可以激活一些先天免疫細胞(自然殺傷細胞、單核細胞、巨噬細胞)，還可以活化腫瘤特異性T細胞，同時將抗原呈遞細胞吸引到腫瘤組織來啟動免疫應答。與傳統(tǒng)免疫原性細胞死亡誘導劑一樣，溶瘤病毒亦是很有潛力的免疫原性細胞死亡誘導劑[20]。Ye等[21]的研究顯示，溶瘤性NDV能在體外觸發(fā)人肺癌細胞免疫原性細胞死亡并使鈣網(wǎng)蛋白暴露、高遷移率族蛋白1和熱激蛋白釋放，而來自NDV感染肺癌細胞的上清液在異種移植物模型中能減少腫瘤的形成，表明NDV誘導肺癌細胞死亡具有免疫原性，并與主要免疫原性細胞死亡決定簇(鈣網(wǎng)蛋白、高遷移率族蛋白1、熱激蛋白)的釋放有關。同時，肺癌細胞中自噬相關基因的消耗顯著抑制了NDV對免疫原性細胞死亡決定簇的誘導，證明自噬在NDV誘導的免疫原性細胞死亡中起一定作用。在原位小鼠神經膠質瘤模型中，NDV不僅能誘導鈣網(wǎng)蛋白、熱激蛋白和高遷移率族蛋白1釋放，還能誘導腫瘤特異性免疫T細胞記憶[22]。

NDV除了能誘導免疫原性細胞死亡釋放危險相關分子模式改變免疫抑制性腫瘤微環(huán)境外，其病原體相關分子模式(雙鏈RNA、血凝素-神經氨酸酶蛋白等)還可以被先天免疫細胞的相關模式識別受體識別，啟動多種反應途徑，最終誘導促炎細胞因子的釋放和免疫細胞的激活[9]。此外，NDV感染還可以打破機體腫瘤細胞對免疫療法的抵抗。研究證明，人類T細胞對黑素瘤的耐受性能被NDV的感染破壞；同時在小鼠黑色素瘤模型中，局部溶瘤性NDV療法被證明可以克服對免疫檢查點阻斷免疫療法的系統(tǒng)性腫瘤抗性[23]。這為臨床研究免疫檢查點阻斷劑與溶瘤性NDV聯(lián)合治療提供了強有力的理論依據(jù)。

3 NDV為載體的抗腫瘤治療作用

雖然NDV是腫瘤治療的理想候選者，但其溶瘤效果仍需提高。近年來，反向遺傳學技術提供了一種可用于研究和開發(fā)具有更強溶瘤能力的NDV方法。該技術是在體外將NDV基因組RNA逆轉錄成互補DNA，在DNA分子水平上對其進行各種體外人工操作(外源基因的插入)，再將NDV基因組的互補DNA轉染適當細胞以獲得重組NDV(recombinant newcastle disease virus，rNDV)。現(xiàn)已應用該技術構建了許多表達外源基因的rNDV[24-27]，其與親本病毒相比表現(xiàn)出更強的腫瘤治療效果。

3.2增強對腫瘤細胞的凋亡作用 腫瘤抑制因子是一種應激激活轉錄因子，可調節(jié)多種基因的功能，包括DNA修復、細胞凋亡、細胞周期停滯、代謝和衰老。在大約50%的人類腫瘤中，腫瘤抑制因子發(fā)生基因突變并喪失其功能，故恢復腫瘤抑制因子的活性來預防腫瘤形成或導致腫瘤消退是一種潛在治療方法[37]。p53作為轉錄因子可以調節(jié)多種蛋白質的功能，如促凋亡蛋白、胱天蛋白酶、死亡受體等[38]。表達p53基因的rNDV能使肝癌細胞的線粒體膜電位降低，這是腫瘤細胞開始凋亡的關鍵步驟[39]。同時，其還能使膠質瘤細胞中p53下游蛋白p21和胱天蛋白酶3的轉錄活性顯著上調，并顯著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bim和Bax的表達[40]，表明p53基因的插入提高了NDV誘導腫瘤細胞凋亡的能力。為補充和增加NDV的促凋亡能力，Cuadrado-Castano等[41]構建了編碼人腫瘤壞死因子受體Fas的rNDV，感染期間Fas受體的過表達可促進外源性凋亡途徑的上調和細胞死亡水平的升高。與親本NDV相比，用表達腫瘤壞死因子相關細胞凋亡誘導配體的rNDV處理小鼠的腫瘤組織中可見腫瘤細胞排列松散、腫瘤細胞體積減小、腫瘤細胞出現(xiàn)核固縮及更多壞死病灶[42]?？梢姡褂肗DV為載體遞送外源治療基因可以顯著增強促腫瘤細胞凋亡作用，是治療腫瘤的理想方法。

4 小 結

惡性腫瘤是全球人類死亡的常見原因，但目前的治療方法并未大大提高患者的生存率，尤其是轉移瘤。插入外源治療基因的rNDV代表一類新的具有增強NDV治療效果的獨特生物制劑，其優(yōu)勢在于：①rNDV維持了親本病毒的安全性；②rNDV可以穩(wěn)定表達外源治療基因的功能；③rNDV仍然保留親本病毒的腫瘤殺傷能力，且能夠增強宿主抗腫瘤免疫應答。但其抗腫瘤的效果有待進一步研究。未來，可探索NDV的外源基因最佳插入位點，使外源治療基因達到最高表達水平，且對NDV復制影響最小；同時，也可探索最佳注射時間和注射次數(shù)以優(yōu)化治療效果。