基因芯片在宮頸癌中的研究進(jìn)展

鄧波兒，孔為民

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科，北京 100006)

基因芯片又稱DNA微陣列，是從基因水平觀察細(xì)胞的差異，從而對(duì)不同細(xì)胞的生物學(xué)行為進(jìn)行分析的技術(shù)，目前已有大量研究證實(shí)基因芯片結(jié)果的可靠性和合理性[1]。與正常組織細(xì)胞對(duì)比，腫瘤細(xì)胞的原癌基因、抑癌基因和凋亡基因存在一定程度的異常表達(dá)和功能紊亂。了解腫瘤細(xì)胞的突變基因靶點(diǎn)及下行通路，并進(jìn)行人為干預(yù)，可能為治療腫瘤提供新方法?；蛐酒蚩筛咄俊⒋笠?guī)模檢測(cè)基因，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤研究[2]，不僅提高了研究效率，也為深入研究基因功能提供了可能[3]。腫瘤性疾病是一種基因性疾病。成松桃等[4]通過(guò)基因芯片篩選出可能作為膀胱癌潛在生物學(xué)標(biāo)志的候選基因，為后續(xù)研究膀胱癌提供了有價(jià)值的線索。胡曉霞等[5]通過(guò)基因芯片技術(shù)對(duì)宮頸癌和正常宮頸組織中微RNA(microRNA，miRNA)的表達(dá)進(jìn)行差異分析，并借助基因本體功能富集分析及京都基因與基因組百科全書信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析技術(shù)，預(yù)測(cè)了可能與腫瘤發(fā)生有關(guān)的靶點(diǎn)，為后續(xù)研究提供了依據(jù)。隨著基因本體功能富集分析、京都基因與基因組百科全書信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和蛋白質(zhì)印跡法等技術(shù)的逐漸完善，一方面為研究基因功能、蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)控分析提供了更多的信息；同時(shí)，為進(jìn)一步探討基因表達(dá)差異及細(xì)胞生物信息學(xué)分析創(chuàng)造了條件?，F(xiàn)就基因芯片在宮頸癌中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 基因芯片概述

基因芯片是一種測(cè)定基因信息的生物芯片，其表面固定了大量的基因探針，根據(jù)載體性質(zhì)不同，基因芯片的種類包括硅片、玻璃片及尼龍膜等。以基因芯片技術(shù)為代表的宏觀基因組學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，在近20年得到了飛速發(fā)展[6]。為了促進(jìn)交流和比較，2001年基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)協(xié)會(huì)提出了基因芯片試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方案，即MIAME(minimal information about a microarray experiment)原則[7]，使芯片的數(shù)據(jù)結(jié)果更具有可比性和可靠性。

1.1原理 基因芯片的原理為核酸雜交原理，與Southern印跡雜交、Northern印跡雜交原理類似，即堿基對(duì)之間的配對(duì)，使一組已知的核酸探針與目的核酸之間進(jìn)行雜交，從而對(duì)目的核酸序列進(jìn)行測(cè)定[8]。基因芯片技術(shù)是同時(shí)將大量的已知序列的DNA探針固定在載體上，再與熒光標(biāo)記后的待測(cè)樣本進(jìn)行雜交，一次可獲得大量基因信息。一個(gè)基因芯片上往往包含了上萬(wàn)種已知的核酸序列，稱為核苷酸探針。通過(guò)熒光顯像的原理，根據(jù)雜交情況不同，基因芯片掃描儀得到的芯片熒光圖不同，最后，將獲得的圖像信息轉(zhuǎn)化成數(shù)據(jù)信息，即可獲得一組基因序列，從而對(duì)基因序列進(jìn)行測(cè)序。

1.2基因芯片技術(shù)的基本步驟 基因芯片是由平面微細(xì)加工技術(shù)和超分子自組裝技術(shù)將大量已知的基因探針集成在一個(gè)微小的固體基片表面。根據(jù)固體表面材質(zhì)的不同，所固定的基因探針長(zhǎng)度和數(shù)量均不相同，應(yīng)用范圍也不相同。借助該集成技術(shù)，基因芯片可同時(shí)對(duì)大量的核酸和蛋白質(zhì)等生物分子實(shí)現(xiàn)高效、快速、低成本的檢測(cè)和分析?；蛐酒瑱z測(cè)DNA序列的步驟主要包括：芯片制備、樣品制備、生物分子反應(yīng)、芯片信號(hào)檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。其中，基因芯片的制備是實(shí)現(xiàn)該技術(shù)可靠性和真實(shí)性的關(guān)鍵。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)基因芯片的制備主要包括兩種方法：原位合成法和合成后交聯(lián)法，原位合成法適用于高密度寡核苷酸芯片，合成后交聯(lián)法合成方法較簡(jiǎn)單，多利用手工或自動(dòng)點(diǎn)樣，將制備好的互補(bǔ)DNA樣品點(diǎn)在載體上，密度較低[9]?；蛐酒靡源罅繎?yīng)用于實(shí)驗(yàn)得益于可將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷?，通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高于400。原位合成法因密度高、重復(fù)性好有較大的應(yīng)用前景?；蛐酒瑪?shù)據(jù)的預(yù)處理方法主要包括LnMR和RAln兩種方法，鄭喬舒等[10]對(duì)這兩種方法進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)LnMR法更適合檢測(cè)不同組間微生物的結(jié)構(gòu)差異，而RAln法一定程度上可以消除基因芯片測(cè)定的系統(tǒng)誤差。兩者都是有效的預(yù)處理方法，具體如何選擇需要結(jié)合實(shí)際分析問(wèn)題。

2 基因芯片在宮頸癌研究中的作用

2.1通過(guò)繪制表達(dá)譜，尋找宮頸癌相關(guān)基因 基因芯片可從DNA水平探究疾病的發(fā)病機(jī)制。通過(guò)對(duì)正常組織細(xì)胞和宮頸癌組織細(xì)胞的差異基因的篩選，有助于尋找宮頸癌相關(guān)基因，在了解靶基因的基礎(chǔ)上開展下一步研究。張蔚等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-497-195基因簇在宮頸癌組織中低表達(dá)，可能是宮頸癌的抑制因子，對(duì)預(yù)測(cè)宮頸癌的靶基因提供了一定幫助。Zhu等[12]通過(guò)寡核苷酸基因芯片對(duì)正常組織和宮頸癌組織凋亡基因進(jìn)行了研究分析，確定了正常宮頸組織和宮頸癌組織存在上千個(gè)差異基因，其中BCL2、BCLXL和細(xì)胞凋亡抑制蛋白1等基因在晚期宮頸癌組織中較早期癌癥表達(dá)上調(diào)，提示可能與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，或可作為治療的靶基因，為進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。由于互補(bǔ)DNA表達(dá)譜芯片的存在，基因芯片可直接檢測(cè)miRNA的種類及豐富度，利用基因芯片技術(shù)，可對(duì)某一基因功能進(jìn)行深入研究。朱正等[13]對(duì)宮頸癌組織及癌旁組織進(jìn)行了差異表達(dá)基因的篩選，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于癌旁組織，宮頸癌異常表達(dá)的miRNAs共有27個(gè)，表達(dá)上調(diào)超過(guò)1.5倍的有3個(gè)，包括hsa-miR-891a、hsa-miR-937、hsa-miR-F114；表達(dá)下調(diào)超過(guò)1.5倍的miRNAs有24個(gè)，主要包括hsa-miR-126和hsa-miR-26a，而hsa-miR-126和hsa-miR-26a可能與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可作為宮頸癌發(fā)生的靶基因進(jìn)行深入的研究。韋麗婭等[14]對(duì)上調(diào)miR-205表達(dá)的HeLa細(xì)胞與正常表達(dá)miR-205的HeLa細(xì)胞進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞的差異表達(dá)基因中，許多參與了細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期，表明miR-205表達(dá)引發(fā)宮頸癌的過(guò)程是多因素、多基因共同作用的結(jié)果，為今后進(jìn)一步研究證實(shí)宮頸癌發(fā)生的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。此外，Wang等[15]借由基因芯片技術(shù)首次對(duì)宮頸鱗癌患者手術(shù)前后循環(huán)中的miRNA表達(dá)差異進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)循環(huán)中miR-646、miR-141和miR-542-3p可以作為宮頸鱗癌的非入侵性生物標(biāo)志物，可能對(duì)疾病進(jìn)展的治療后監(jiān)測(cè)有用。

2.2宮頸癌人乳頭瘤病毒 (human papilloma virus，HPV)感染情況的研究 HPV是一種嗜上皮性DNA病毒，與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，是宮頸癌發(fā)生的必要條件[16]。目前已發(fā)現(xiàn)HPV有超過(guò)近百種分型，低危型HPV(如HPV6、HPV11型)主要引起良性病變；高危型HPV(如HPV16、HPV18型)不僅可導(dǎo)致宮頸癌前病變，還可促使宮頸癌前病變向?qū)m頸癌遷移[17]。另外，基因芯片對(duì)了解宮頸癌的流行病學(xué)分布具有較大臨床意義。蔡為民等[18]對(duì)1 047例正常宮頸細(xì)胞、161例宮頸鱗癌組織和82例宮頸腺癌組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HPV的感染率分別為10.41%(109/1 047)、90.68%(146/161)和71.95%(59/82)，提示HPV與不同病理分型的宮頸癌均關(guān)系密切。Kim等[19]也發(fā)現(xiàn)，HPV的陽(yáng)性率與宮頸癌細(xì)胞來(lái)源有很大程度的關(guān)系。宮頸腺癌是宮頸癌的一種特殊病理類型，近年來(lái)宮頸腺癌在宮頸癌中所占的比例有所上升，并呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)[20]。宮頸腺癌因?qū)Ψ呕熭^鱗癌不敏感，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也更早，因此，早期診斷并治療對(duì)宮頸腺癌更為重要。鄒琳等[21]對(duì)HPV在宮頸腺癌中的感染情況及分型進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)47例宮頸腺癌標(biāo)本中，HPV陽(yáng)性率為93.6%(44/47)，單一型感染以HPV16型最為常見，占14.9%(7/47)；混合型感染以HPV16+HPV18型為最主要類型，占19.4%(6/31)，對(duì)明確HPV在宮頸腺癌中的作用及了解感染情況有較大意義。

近年來(lái)，HPV-DNA基因芯片發(fā)展迅速，已經(jīng)可以同時(shí)檢測(cè)多種HPV亞型。李明等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Luminex液相基因芯片技術(shù)作為目前進(jìn)行HPV分型評(píng)價(jià)最高的檢測(cè)手段，不僅可以一次性完成26種亞型的檢測(cè)，通過(guò)與基因測(cè)序結(jié)果對(duì)比，準(zhǔn)確率也較高(90%)，是HPV分型檢測(cè)及大規(guī)模篩查的理想方法。另外，導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)也是檢測(cè)HPV感染和分型的常用技術(shù)之一。劉永良[23]利用導(dǎo)流雜交基因芯片對(duì)1 760例疑為HPV感染的門診患者進(jìn)行HPV感染的流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示，HPV檢出率為27.2%，高危型以HPV16型最高(21.4%)，其次為HPV58(12.2%)，再次之為HPV52(11%)，而低危型以HPV81和HPV11最為多見。袁征等[24]利用核酸分子快速導(dǎo)流雜交芯片技術(shù)對(duì)HPV感染進(jìn)行研究，結(jié)果表明，宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期及宮頸癌的HPV檢出率分別為32.0%、51.9%、80.0%和94.4%，診斷率與宮頸病情成正比，應(yīng)用核酸分子快速導(dǎo)流雜交芯片可有效提高宮頸病變的診斷水平。黃德秋等[25]的研究也發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)流雜交法基因芯片技術(shù)對(duì)了解HPV感染和亞型分布情況有積極意義。

2.3宮頸癌病理分型相關(guān)基因研究 宮頸癌的病理分型主要包括鱗癌、腺癌及腺鱗癌等，不同的病理類型預(yù)后差別較大，術(shù)后采用的輔助治療方案也有差異。因此，明確病理分型對(duì)宮頸癌的治療和改善患者預(yù)后有較大意義。已有研究表明，應(yīng)用基因芯片技術(shù)可對(duì)鱗癌及腺癌中不同的基因序列進(jìn)行分析，幫助診斷癌癥的病理類型[26]。利用基因芯片進(jìn)行腫瘤分型可幫助指導(dǎo)臨床決策，制訂更個(gè)體化的治療方案。Fujimoto等[27]通過(guò)基因芯片篩選出可能與病理類型相關(guān)的10個(gè)差異基因，并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，其中9個(gè)基因在不同病理分型的宮頸癌中差異表達(dá)，可能與宮頸癌組織類型有關(guān)。當(dāng)臨床病理不明確，或免疫組織化學(xué)結(jié)果不能充分區(qū)分病理類型時(shí)，可通過(guò)基因芯片進(jìn)行差異表達(dá)基因的分析，輔助診斷病理組織學(xué)類型，指導(dǎo)治療。但具體與宮頸癌病理類型相關(guān)的基因研究目前較少，仍需大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

2.4宮頸癌浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究 宮頸癌主要轉(zhuǎn)移機(jī)制為淋巴轉(zhuǎn)移，應(yīng)用基因芯片技術(shù)可了解可能參與淋巴轉(zhuǎn)移機(jī)制的靶基因。林穎等[28]利用基因芯片對(duì)早期宮頸鱗癌的淋巴轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行了研究，分別對(duì)發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移、未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的宮頸鱗癌組織及正常宮頸上皮之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明，早期宮頸鱗癌淋巴轉(zhuǎn)移是由多個(gè)基因共同作用的結(jié)果，其中LRRC4(leucine rich repeat containing 4)、VSNL1(visinin-like protein-1)和表面生長(zhǎng)因子受體可能與宮頸癌的轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。Huang等[29]對(duì)發(fā)生盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，發(fā)現(xiàn)11個(gè)可能與盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，且具有該11個(gè)基因的高風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)患者的5年生存率和無(wú)病生存率較低風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)患者低，為進(jìn)一步研究宮頸癌的轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)機(jī)制提供了依據(jù)。ΔNp63a是p63基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物之一，已被證實(shí)與宮頸癌組織分化程度及預(yù)后有關(guān)，低表達(dá)該基因的患者發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的可能性較高[30]。韓曉慧等[31]對(duì)ΔNp63a過(guò)表達(dá)和正常表達(dá)的宮頸SiHa細(xì)胞進(jìn)行差異基因的篩選，發(fā)現(xiàn)在ΔNp63a過(guò)表達(dá)的宮頸SiHa細(xì)胞中有834個(gè)上調(diào)基因和562個(gè)下調(diào)基因；結(jié)合京都基因與基因組百科全書通路分析，發(fā)現(xiàn)與ΔNp63a直接相關(guān)的基因編碼蛋白為骨形成蛋白7和白細(xì)胞抗原74，骨形成蛋白7和白細(xì)胞抗原74作為ΔNp63a的候選基因可能與ΔNp63a共同介導(dǎo)宮頸癌中免疫相關(guān)的信號(hào)通路，從而影響腫瘤的發(fā)展。

2.5宮頸癌治療機(jī)制的研究 基因芯片在研究腫瘤的治療方法中也發(fā)揮著重要作用。隋成君等[32]對(duì)行介入治療前后的宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行了基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)行介入治療后的腫瘤細(xì)胞有939個(gè)下調(diào)基因，223個(gè)上調(diào)基因，這些差異基因主要參與DNA修復(fù)、乳腺癌1號(hào)基因、抑制蛋白及乳腺癌2號(hào)基因相關(guān)通路，為進(jìn)一步研究宮頸癌介入治療的分子機(jī)制提供了思路。另外，放療是宮頸癌中晚期患者的主要治療方式。放療的本質(zhì)是通過(guò)放射線使DNA失去雙螺旋結(jié)構(gòu)，變成單鏈結(jié)構(gòu)，從而使腫瘤細(xì)胞失去增殖的能力。然而，腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的DNA雙鏈修復(fù)能力，使腫瘤細(xì)胞擁有一定的放療抵抗性。腫瘤對(duì)放療的敏感性決定了放療的臨床效果。因基因芯片用于篩選與放療敏感性的相關(guān)基因，一方面可確定不同腫瘤細(xì)胞株對(duì)放療的敏感性，另一方面還可以比較兩者基因之間的差異，幫助尋找放療敏感性相關(guān)的靶基因。王鳳玫等[33]通過(guò)基因表達(dá)譜芯片對(duì)宮頸癌放療敏感性進(jìn)行了相關(guān)研究，篩選出了可能與宮頸癌放療抵抗相關(guān)的差異表達(dá)基因，并通過(guò)熒光定量PCR對(duì)部分基因進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，反轉(zhuǎn)錄PCR與基因芯片結(jié)果一致，差異表達(dá)基因(如BCL2、MDM2等)主要參與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等功能。

3 基因芯片研究基因的優(yōu)缺點(diǎn)

3.1基因芯片的優(yōu)點(diǎn) 基因芯片技術(shù)根據(jù)自身高通量、自動(dòng)化等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，不僅可以用于基因組學(xué)的研究、疾病的檢測(cè)，還可以診斷基因序列突變等[8]。基因芯片的飛速發(fā)展對(duì)于腫瘤科學(xué)的研究有重要價(jià)值。如上所述，基因芯片技術(shù)在宮頸癌HPV感染的相關(guān)研究中發(fā)揮了重要作用，在檢測(cè)宮頸癌HPV感染情況上有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，可同時(shí)進(jìn)行多種HPV型的檢測(cè)；同時(shí)，基因芯片也提高了宮頸癌篩查和臨床檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。目前，臨床上檢測(cè)HPV分型常采用PCR法。與傳統(tǒng)方法相比，基因芯片可同時(shí)檢測(cè)幾十種不同分型的HPV感染，并可避免假陽(yáng)性及假陰性結(jié)果，且靈敏度無(wú)差異，特異性強(qiáng)[20]?；蛐酒夹g(shù)可與HPV檢測(cè)的傳統(tǒng)技術(shù)結(jié)合，提高臨床診斷率，幫助早期診斷宮頸癌前病變及宮頸癌。

3.2基因芯片的缺點(diǎn) 基因芯片作為一項(xiàng)分子生物學(xué)技術(shù)，需要強(qiáng)大的理論基礎(chǔ)和較強(qiáng)的操作能力。伴隨基因芯片高通量而來(lái)的還有龐大的數(shù)據(jù)結(jié)果，需要應(yīng)用相關(guān)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，一定程度上加大了基因芯片技術(shù)的難度。有研究顯示，基因芯片對(duì)染色體倍數(shù)正常的基因組發(fā)生倒位和易位等突變不能有效篩查，限制了其在產(chǎn)前診斷等方面的應(yīng)用，且基因芯片費(fèi)用昂貴[34]。此外，基因芯片可以檢測(cè)的基因型仍有限，只能對(duì)已知序列的基因組進(jìn)行分析，而對(duì)于未知物種的基因測(cè)序及發(fā)生變化的基因序列進(jìn)行分析等尚不能實(shí)現(xiàn)，且成本相對(duì)較高[35]。

4 小 結(jié)

基因芯片是一種基因測(cè)序方法，在腫瘤醫(yī)學(xué)中的臨床應(yīng)用較多，近年來(lái)發(fā)展迅速?；蛐酒夹g(shù)可以用于宮頸癌的表達(dá)譜繪制、宮頸癌HPV感染情況的分析、宮頸癌的病理、轉(zhuǎn)移及治療機(jī)制的研究等，可以為臨床治療提供思路和依據(jù)。但目前基因芯片技術(shù)仍有許多不足之處，例如，可檢測(cè)的基因型有限、成本相對(duì)較高、結(jié)果分析需要較高的理論基礎(chǔ)、基層醫(yī)院開展較困難等。相信隨著未來(lái)基因芯片技術(shù)的不斷提高和更新，隨之可能會(huì)出現(xiàn)更加有效的宮頸癌預(yù)防及治療方法。未來(lái)，快速、準(zhǔn)確且低成本基因芯片篩查方法的出現(xiàn)及普遍應(yīng)用，將為宮頸癌的防治做出巨大貢獻(xiàn)。