DNA甲基化修飾在惡性胸腔積液診斷中的研究進(jìn)展

朱 葉，史家欣，李家樹

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 連云港222000)

惡性胸腔積液(malignant pleural effusion，MPE)是指原發(fā)于胸膜的惡性腫瘤或其他部位的惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至胸膜引起的胸腔積液。確定MPE診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”是在胸腔積液細(xì)胞沉淀中找到惡性細(xì)胞[1]。幾乎所有類型的腫瘤都可能發(fā)生胸膜受累，在所有的滲出性胸腔積液中MPE病死率居第二位，僅次于肺炎旁積液[2]。無論是代表真正的腫瘤侵犯還是疾病的間接影響(惡變性胸腔積液)，MPE均提示惡性腫瘤臨床分期進(jìn)入Ⅳ期，排除了治愈性治療方法的可能[3]，因此一旦確診，原發(fā)腫瘤部位的中位生存期為4～7個(gè)月，1年生存率為23%，2年生存率為7%，預(yù)后極差[4]。據(jù)調(diào)查，美國每天約有12.5萬人因?yàn)镸PE而住院，預(yù)估花費(fèi)超過50億美元[2]。隨著腫瘤治療手段的不斷發(fā)展和人口的老齡化，預(yù)計(jì)MPE發(fā)病率會(huì)逐年增加，帶來快速增長的醫(yī)療保健負(fù)擔(dān)。雖然細(xì)胞學(xué)仍然是胸腔積液的主要診斷工具，但陽性率較差，特別是當(dāng)腫瘤細(xì)胞不豐富時(shí)，可能會(huì)被胸腔積液中的反應(yīng)性間皮細(xì)胞混淆[5]。因此，早期、準(zhǔn)確診斷積液的性質(zhì)，是一個(gè)關(guān)鍵的臨床問題。隨著MPE的形成機(jī)制被不斷修訂和完善，人們認(rèn)為這可能依賴于特定且不同的轉(zhuǎn)錄程序[6]。現(xiàn)就DNA甲基化在MPE診斷中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 DNA甲基化

20世紀(jì)80年代后期，在分子生物學(xué)空前發(fā)展的形勢下，學(xué)科間的交叉會(huì)聚越來越明顯，1975年，英國分子生物學(xué)家對(duì)表觀遺傳學(xué)進(jìn)行了系統(tǒng)表述，即基因的核苷酸序列不變的前提下，研究導(dǎo)致基因表達(dá)出現(xiàn)差異的可遺傳的調(diào)控方式[7-9]。對(duì)基因組而言，不僅僅是序列包含遺傳信息，而且基因組的修飾也可以記載遺傳信息[10]。主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和RNA編輯、染色質(zhì)重塑等。這些表觀遺傳修飾通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)來確定每個(gè)細(xì)胞的身份，影響細(xì)胞因子的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，進(jìn)而影響免疫細(xì)胞(T細(xì)胞譜、B細(xì)胞等)的功能及免疫反應(yīng)，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[11-12]。近年研究發(fā)現(xiàn)，80%的疾病、腫瘤與表觀遺傳學(xué)相關(guān)，分析腫瘤標(biāo)本或體液中單個(gè)基因的表觀遺傳變化和基因特征，對(duì)于腫瘤的分子亞分類、預(yù)后、對(duì)治療的反應(yīng)預(yù)測以及治療后患者的隨訪都有幫助[9]。

DNA甲基化是指由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶的反應(yīng)[13]。DNA甲基化主要發(fā)生在-C-磷酸-G-(CpG)位點(diǎn)。CpG位點(diǎn)中，胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)毗鄰并以線性方式連接。哺乳動(dòng)物60%～90%的CpG處于甲基化狀態(tài)[14]，未甲基化的CpG通常成簇分布并形成CpG島，CpG島經(jīng)常存在于許多基因的5′調(diào)控區(qū)，特別是啟動(dòng)子區(qū)。目前發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞基因啟動(dòng)子區(qū)域高含量的5-甲基胞嘧啶可造成基因轉(zhuǎn)錄沉默，繼而抑制下游基因產(chǎn)物表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞功能異常，從而使細(xì)胞癌變風(fēng)險(xiǎn)增加[15]。因此，CpG島的甲基化修飾一直是研究的重點(diǎn)。

2 DNA甲基化與腫瘤

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)水平基因表達(dá)、細(xì)胞發(fā)育和細(xì)胞分化等過程調(diào)控的重要方式。異常的甲基化表現(xiàn)在癌癥發(fā)生過程中有重要作用，可作為一種標(biāo)記來區(qū)分癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞[13]。2018年6月，美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)年會(huì)上宣布了關(guān)于肺癌早期診斷的最新成果，表明在98%的特異度標(biāo)準(zhǔn)下，甲基化差異能成功檢出41%的早期肺癌(Ⅰ～ⅢA期)及89%的晚期肺癌(ⅢB～Ⅳ期)[16]。甲基化程度改變一般發(fā)生在腫瘤產(chǎn)生之前，隨腫瘤的發(fā)展，該變化是可逆的。一項(xiàng)測定空氣污染對(duì)肺癌影響的研究表明，大鼠肺組織中的特定基因在長期接受污染暴露后產(chǎn)生高甲基化，當(dāng)機(jī)體適應(yīng)污染后，甲基化的變化可以通過系統(tǒng)反應(yīng)來調(diào)節(jié)，從而恢復(fù)正常水平[17]。另外，還有研究表明，DNA甲基化異常與腫瘤的復(fù)發(fā)、預(yù)后及評(píng)估組織間風(fēng)險(xiǎn)等方面也存在一定的聯(lián)系[18-20]。同時(shí)，甲基化研究技術(shù)不斷得到發(fā)展，特異位點(diǎn)甲基化研究技術(shù)主要包括甲基化特異聚合酶鏈反應(yīng)、熒光定量法、亞硫酸氫鹽處理后測序、高分辨率熔解曲線、聯(lián)合亞硫酸氫鈉的限制性內(nèi)切酶分析法、焦磷酸測序等[21]，這些技術(shù)的發(fā)展為研究者們提供了充分的技術(shù)支持，使腫瘤的診斷更為方便、快捷。更令人震驚的是，2016年，研究人員根據(jù)2790個(gè)起源已知的腫瘤樣本(這些樣本代表了38類腫瘤，包括85個(gè)轉(zhuǎn)移病例)，建立了基于微陣列DNA甲基化標(biāo)簽的癌癥分類方法，并將之稱為微陣列DNA甲基化標(biāo)記，成為首個(gè)用于診斷腫瘤起源的表觀遺傳學(xué)檢測方法，使醫(yī)師能夠根據(jù)腫瘤類型來制訂更具體的治療方案[22]?；谏鲜鲅芯勘尘?，研究者們逐步探討甲基化譜在鑒別惡性和良性胸腔積液中的診斷價(jià)值，檢查血清和胸腔積液樣本中甲基化的一致性[23]。

3 DNA甲基化在非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的MPE中的診斷

MPE多繼發(fā)于其他部位腫瘤的胸膜轉(zhuǎn)移，臨床上以肺癌為主，最常見的組織學(xué)類型為腺癌[24]。研究表明，在首次使用侵入性程序分析(胸腔穿刺、經(jīng)皮肺穿刺活檢、支氣管鏡活檢等)的大約50%的疑似肺癌患者中診斷不能得到確認(rèn)[25-27]。因此，為了避免重復(fù)穿刺或支氣管鏡檢查，需要更有效的方法輔助確診，針對(duì)胸腔積液的表觀遺傳研究對(duì)MPE的早期診斷尤其重要。

Wnt基因編碼的Wnt分泌蛋白家族，通過與細(xì)胞表面不同的受體結(jié)合，與控制生長的喪失和細(xì)胞分化的損害有關(guān)，大多數(shù)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑存在細(xì)胞外拮抗劑，作為對(duì)細(xì)胞生長分化的調(diào)控[28]。其中，拮抗劑重組人Wnt抑制因子1(Wnt inhibitory factor 1，WIF-1)能夠與Wnt蛋白結(jié)合并抑制Wnt蛋白的活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖分化[29]。在75%～83%的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中發(fā)現(xiàn)，WIF-1啟動(dòng)子區(qū)域呈高甲基化狀態(tài)，下調(diào)WIF-1而異常激活Wnt通路[30]。后來人們發(fā)現(xiàn)，WIF-1中存在5個(gè)表皮生長因子樣域[31]。既往大量研究證實(shí)，表皮生長因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可促進(jìn)腫瘤血管生成與血管滲漏[32]。由此推斷，WIF-1對(duì)MPE的形成具有一定意義。Yang等[33]運(yùn)用甲基化特異聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對(duì)WIF-1啟動(dòng)子甲基化異常用于診斷NSCLC相關(guān)MPE的診斷價(jià)值做出了分析，靈敏度為69.4%，特異度為100%，提示W(wǎng)IF-1啟動(dòng)子區(qū)域在胸腔積液細(xì)胞中的高甲基化可以作為NSCLC相關(guān)MPE的輔助診斷標(biāo)志物。

抑癌基因p16是一種細(xì)胞周期中的基本基因，直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控，負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分裂。p16基因編碼產(chǎn)物是分子量為16 000的蛋白，即p16蛋白，定位于細(xì)胞核內(nèi)，p16蛋白是作用于細(xì)胞分裂周期關(guān)鍵酶之一的周期蛋白依賴性激酶4的抑制因子，p16基因的表達(dá)一旦失靈則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[34]，因此常將p16基因比作細(xì)胞周期中的剎車裝置[35]。曾有研究表明，在Ⅰ/Ⅱ期肺癌患者中，p16甲基化與整體生存率密切相關(guān)[36]。劉大鷹等[37]證實(shí)了在肺腺癌相關(guān)的MPE中p16基因甲基化的診斷價(jià)值，靈敏度為69.4%，特異度為86.7%，準(zhǔn)確率為77.3%，并表明p16基因的甲基化狀態(tài)與腫瘤的組織細(xì)胞類型及分化程度無關(guān)，進(jìn)一步表明了p16基因甲基化是肺癌發(fā)生發(fā)展中的早期事件。由于病例數(shù)量有限，劉大鷹等[37]的結(jié)果存在一定的爭議。2013年一項(xiàng)薈萃分析證實(shí)，在胸腔積液中，p16甲基化檢測在MPE的診斷中發(fā)揮著重要作用，靈敏度41%，特異度97%[38]。

人矮小同源盒基因SHOX2(short stature homobox 2)是同源盒基因家族的一員，位于X染色體短臂22.33(Xp22.33)和Y染色體短臂11.3位置(Yp11.3)，因最初被發(fā)現(xiàn)與一系列生長發(fā)育遲緩和身材矮小的疾病有關(guān)而得名，主要作用是編碼蛋白轉(zhuǎn)錄因子[39]。研究表明，SHOX2基因表達(dá)調(diào)控對(duì)骨骼、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起到重要作用[40]。SHOX2基因有2個(gè)較大的CpG島，1個(gè)在基因的5′端覆蓋約1 kb的區(qū)域，另1個(gè)在3′端覆蓋約0.5 kb的區(qū)域[41]。以肺癌組織或細(xì)胞為對(duì)象的甲基化研究均發(fā)現(xiàn)SHOX2基因CpG島的甲基化水平比正常組織或細(xì)胞顯著升高，即超甲基化現(xiàn)象[42-45]。推測由于SHOX2基因編碼蛋白轉(zhuǎn)錄因子，其基因的超甲基化對(duì)下游基因產(chǎn)物表達(dá)有很大影響，所以SHOX2基因超甲基化有可能影響多個(gè)蛋白的表達(dá)，從而促使細(xì)胞癌變。Ilse等[46]在胸腔積液標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)SHOX2基因的高甲基化是診斷MPE的高度特異性生物標(biāo)志物(特異度96.2%，靈敏度39.5%)，結(jié)果提示更側(cè)重于MPE的確診，而非篩選。栗少飛和聶立功[47]在60例胸腔積液中進(jìn)行研究，得出的結(jié)論與Ilse等[46]的結(jié)果(靈敏度35.7%，特異度100%)一致。一項(xiàng)薈萃分析表明，在NSCLC相關(guān)的MPE中，SHOX2甲基化較傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物(癌胚抗原、細(xì)胞角蛋白19片段抗原21-1、鱗狀細(xì)胞癌抗原和神經(jīng)元特異性烯醇化酶等[48])，具有更高的靈敏度(70%)和特異度(96%)[42]。

O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)是一種DNA修復(fù)蛋白，MGMT通過啟動(dòng)子甲基化沉默，導(dǎo)致MGMT蛋白低表達(dá)，可降低DNA修復(fù)活性[49]。此前，MGMT啟動(dòng)子甲基化被證實(shí)與肺癌p53基因G:C向A:T轉(zhuǎn)化突變有關(guān)，在非吸煙者肺腺癌中比在吸煙者中更常見，并與腫瘤進(jìn)展有關(guān)(晚期較早期更普遍)[50]。由此推測，MGMT甲基化檢測可能是一種有前途的非/微創(chuàng)檢測方法，在腫瘤組織難以獲取患者的臨床治療中具有特殊的應(yīng)用價(jià)值。Katayama等[51]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在81例胸腔積液患者(惡性47例、非惡性37例)中，MGMT甲基化未出現(xiàn)在非MPE中，推測MGMT基因甲基化可能是區(qū)別良惡性胸腔積液的生物學(xué)標(biāo)志物。但由于樣本量較少，仍需大量實(shí)驗(yàn)論證。

基于單基因的研究發(fā)現(xiàn)，單個(gè)表觀遺傳標(biāo)志物診斷MPE具有極高的特異性，但靈敏度似乎不夠理想[51]。因此猜測，一種以上基因同時(shí)甲基化的頻率可能為檢測提供一種更為敏感的方法。Botana-Rial等[52]使用甲基化特異聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測胸腔積液中腫瘤抑制基因p16、MGMT、乳腺癌1號(hào)基因和視黃醇受體β的甲基化水平，使用受試者操作特征曲線評(píng)估用于區(qū)分惡性和良性胸腔積液的各基因的準(zhǔn)確性；采用單變量和多變量Logistic回歸分析，檢測各基因甲基化水平與MPE之間的關(guān)系，結(jié)果在83.3%的MPE患者中檢測到至少一種基因的高甲基化。一項(xiàng)關(guān)于不同類型腫瘤導(dǎo)致的MPE中8種基因甲基化(視黃醇受體β、腺瘤樣結(jié)腸息肉易感基因、乳腺癌1號(hào)基因、MGMT、視黃醇結(jié)合蛋白1、脆性組氨酸三聯(lián)體、Ras相關(guān)區(qū)域家族1基因、p16)的前瞻性隊(duì)列研究表明，單獨(dú)細(xì)胞學(xué)診斷MPE的靈敏度為63%，單獨(dú)甲基化的靈敏度為67%，兩者的特異度均為100%，兩者結(jié)合分析可將MPE的診斷靈敏度提高至88%，表明胸腔積液的甲基化檢測可與細(xì)胞學(xué)產(chǎn)生互補(bǔ)作用，提高M(jìn)PE的診斷率[53]。上述研究均提示胸腔積液中DNA的異常甲基化可能是MPE的一種有價(jià)值的診斷標(biāo)志物。

4 DNA甲基化在惡性間皮瘤相關(guān)MPE中的診斷

惡性間皮瘤是與胸腔積液相關(guān)的最常見的原發(fā)性胸膜惡性腫瘤，患者中80%～95%在診斷時(shí)有大量胸腔積液[54]。但臨床上間皮瘤較少見，因此常會(huì)發(fā)生漏診。Fujii等[55]采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測了不同肺部疾病患者胸腔積液中特定DNA的甲基化狀態(tài)，包括惡性間皮瘤、肺癌和良性的石棉胸膜炎，結(jié)果表明，胸腔積液DNA中腫瘤抑制基因 Ras相關(guān)區(qū)域家族1基因、p16、視黃醇受體β異常啟動(dòng)子高甲基化的鑒定可能是鑒別惡性間皮瘤與肺癌的一個(gè)有價(jià)值的標(biāo)志物，在這3個(gè)基因中至少有1個(gè)基因甲基化的水平下，肺癌與惡性間皮瘤的區(qū)分靈敏度為67.4%，特異度和陽性預(yù)測值分別為79.5%和79.5%，證明了甲基化譜在胸腔積液DNA鑒別診斷惡性間皮瘤與肺癌的有效性。

5 小 結(jié)

DNA甲基化是轉(zhuǎn)錄和調(diào)控控制的重要表觀遺傳學(xué)改變，是表觀基因組領(lǐng)域最有前途的生物標(biāo)志物，它提供了一種強(qiáng)大的工具，可以根據(jù)直接從腫瘤或“偏遠(yuǎn)”位置(如痰、胸腔積液或血清)獲得的遺傳物質(zhì)進(jìn)行診斷，特別是當(dāng)細(xì)胞數(shù)量有限時(shí)，可擴(kuò)增的DNA標(biāo)記可以為癌癥檢測和分類提供非常敏感的工具[56]。因此，胸腔積液DNA中異常的甲基化狀態(tài)可能是MPE有價(jià)值的診斷標(biāo)志物。然而，在臨床實(shí)際工作中，甲基化檢測技術(shù)仍有引物設(shè)計(jì)較難、試劑價(jià)格昂貴等問題，因此還未廣泛推廣于臨床應(yīng)用，多見于科研研究。但胸腔積液的甲基化分析是一種很有前途的、適合臨床應(yīng)用的工具，有必要進(jìn)行進(jìn)一步研究以尋找每種疾病特異性甲基化的基因或基因組合。