LC-ESI-M S/M S測定白酒中7種甜味劑的方法研究

周 玉，唐艷榮，余 義，劉 莎，毛從興，鄭 靜，孫 琳，劉 艷，時宏偉

（武漢天龍黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北武漢430050）

隨著社會發(fā)展和科技進步，人們越來越重視飲食健康問題。在食品工業(yè)中，甜味劑應(yīng)用范圍較為廣泛，且種類較多，按其來源可分為天然甜味劑和人工合成甜味劑；按其營養(yǎng)價值分為營養(yǎng)性甜味劑和非營養(yǎng)性甜味劑，按其化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分為糖類和非糖類甜味劑。葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉糖和乳糖等糖類物質(zhì)，雖然也是天然甜味劑，但因長期被人食用，且是重要的營養(yǎng)素，通常視為食品原料，在中國不作為食品添加劑。屬于非糖類的甜味劑有天然甜味劑和人工合成甜味劑。天然甜味劑有甜菊糖、甘草、甘草酸二鈉、甘草酸三鉀（鈉）等。人工合成甜味劑有糖精、糖精鈉、環(huán)己基氨基磺酸鈉、阿力甜等。為此,對于甜味劑合成工藝展開進一步地分析具有一定的現(xiàn)實意義[1-3]。甜味劑盡管應(yīng)用范圍很廣，但是在白酒中是不允許添加的[4-5]。

白酒是我國的傳統(tǒng)蒸餾酒，按其風(fēng)味特征可分為各種不同的香型，雖然每種香型各有其典型風(fēng)格，但是不論哪種香型的白酒，保持適度的甜味，不僅可以遮蓋其他一些苦澀雜味，而且還能使酒體甘洌、醇厚、綿軟，關(guān)鍵是這種甜味是來自于自然發(fā)酵產(chǎn)生的，而非添加甜味劑。

風(fēng)味化學(xué)研究表明，味覺是由一定的呈味物質(zhì)引起的，酒之所以具有醇甜之感，是因為酒中含有一定量的甜味物質(zhì)，如高級醇、多元醇、氨基酸等，多元醇的甜味隨著羥基數(shù)目的增加而加強，如丁四醇的甜味比蔗糖大兩倍，己六醇的甜味更強。此外，多元醇都是黏稠體，均能給酒帶來豐滿、濃厚感，使口味綿長。這些甜味物質(zhì)，對于名優(yōu)白酒，是由其特殊的生產(chǎn)工藝決定的，如濃香型大曲酒的低溫入池、緩慢發(fā)酵，就是為了有利于醇甜物質(zhì)的生成，無需另行添加[6-8]。

人工合成甜味劑可能對人體有致癌、致病的副作用[9]，因而已被許多國家限制使用。尤其在白酒行業(yè)，《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》GB 2760—2014中規(guī)定白酒中不得檢出甜味劑。所以對于白酒中甜味劑的測定應(yīng)該做到嚴格把關(guān)，防止行業(yè)和白酒企業(yè)中出現(xiàn)假冒偽劣產(chǎn)品，對消費者產(chǎn)生不利影響。目前，關(guān)于甜味劑的檢測方法主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-12]、高效液相色譜法[13-15]、高效液相色譜蒸發(fā)散射法[16]、高效毛細管電泳-間接紫外法[18]、核殼型色譜柱-反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法[19]、紫外衍生-高效液相色譜法[17]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：市售白酒樣品。

試劑及耗材：三氯蔗糖（規(guī)格1 g，儲存溫度2～8℃，日本和光純藥工業(yè)株式會社）；紐甜、阿斯巴甜、阿力甜（規(guī)格100 mg，儲存溫度-20℃，上海安譜實驗科技股份有限公司）；安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素（規(guī)格0.25 g，儲存溫度20℃±4℃，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；甲醇（色譜純，美國Baker公司）；乙酸銨（分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司，規(guī)格600 mL）。

儀器設(shè)備：Agilent 1260LC-Agilent 6460安捷倫三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀，安捷倫科技有限公司；Agilent ZORBAX RX-C18安捷倫色譜柱（4.6×50 mm，2.7μm），安捷倫科技有限公司；有機濾膜(孔徑0.22μm，天津津騰)；全玻璃微孔過濾器(規(guī)格1000 mL)，天津津騰實驗設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制

準確稱取10 mg(精確至0.0001 mg)紐甜標準品于100 mL容量瓶中，蒸餾水溶解并定容至100 mL)，配制成100 mg/L的標準儲備液，置于4℃冰箱中保存。根據(jù)需要用蒸餾水逐級稀釋成適當(dāng)濃度的混合標準工作液。

1.2.2 樣品前處理方法

用一次性注射器吸取均質(zhì)樣品，經(jīng)0.22 μm的有機濾膜過濾，濾液供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX RX-C18色譜柱(4.6×50 mm，2.7 μm)；流動相：A為0.02 mol/L乙酸銨溶液+0.1%乙酸溶液，B為甲醇；柱溫箱：30℃；進樣量：5 μL；采用梯度洗脫，洗脫程序見表1。

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)檢測模式；干燥氣體溫度：350℃；干燥氣體流速：8 L/min；噴霧電壓：206.8 kPa。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

表1 流動相梯度洗脫程序

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采取直接進樣的方式，將目標物標準溶液注入質(zhì)譜，分別進行正離子模式和負離子模式全掃描檢測，得到一級質(zhì)譜圖和準分子離子峰，再用惰性氣體氮氣攻擊該母離子，獲得其二級質(zhì)譜圖及相應(yīng)的子離子。結(jié)果表明，在負離子模式下響應(yīng)值及靈敏度均高于正離子模式，因此，本方法選擇負離子電離模式。利用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）對選定的定性離子和定量離子對碎裂電壓、碰撞能、保留時間、碰撞池加速電壓等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，使各監(jiān)測離子豐度和信號達到最佳。負離子模式下的質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。

表2 7種甜味劑的質(zhì)譜參數(shù)

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

分別以0.1%乙酸-甲醇、0.1%乙酸-乙腈、2 mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動相進行樣品分離。結(jié)果表明，用2 mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動相時物質(zhì)分離度、峰形、響應(yīng)值以及保留時間的穩(wěn)定性均優(yōu)于0.1%乙酸-乙腈、0.1%乙酸-甲醇，故本方法最終選用2 mmol/L乙酸銨-甲醇為流動相進行洗脫。圖1是7種甜味劑在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下的MRM色譜圖。

圖1 7種甜味劑的多反映監(jiān)測色譜圖

由圖1可知，安賽蜜的出峰時間為1.4 min，糖精鈉的出峰時間為1.5 min，甜蜜素的出峰時間為2.2 min，三氯蔗糖的出峰時間為3.0 min，紐甜的出峰時間為3.7 min，阿力甜的出峰時間為7.0 min，阿斯巴甜的出峰時間為11.7 min。

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

線性范圍、檢出限和定量限參照梅婕等[20]的方法，將7種甜味劑標準儲備液用蒸餾水稀釋，分別配制成5種濃度：安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素和阿力甜10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L、100 μg/L、200 μg/L；阿斯巴甜、紐甜 50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、500 μg/L、1000 μg/L；三氯蔗糖 40 μg/L、80 μg/L、160 μg/L、400 μg/L、800 μg/L，按1.5節(jié)所述的色譜-質(zhì)譜條件進行測定，繪制標準工作曲線。結(jié)果顯示，7種甜味劑在所配制的濃度范圍內(nèi)，所有分析物的質(zhì)量濃度x(ng/mL)和響應(yīng)值y之間線性相關(guān)系數(shù)為0.999；以性噪比為3確定檢出限，性噪比為10確定定量限，安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素和阿力甜檢出限是10 μg/L、定量限是20 μg/L；阿斯巴甜、紐甜檢出限是50 μg/L、定量限是100 μg/L；三氯蔗糖檢出限是40 μg/L、定量限是80 μg/L。

2.3 精密度和回收率

精密度和回收率參照孫棣等[23]的方法，采用在空白樣品中添加標準溶液的方法，選擇常見的濃香型和兼香型兩個不同香型白酒酒樣及乙醇進行7種甜味劑的檢測試驗，成品白酒1、白酒2和乙醇3的三氯蔗糖含量均為未檢出，并向兩個樣品中分別添加50 μg/L、100 μg/L濃度水平的甜味劑進行回收率實驗，重復(fù)測定2次。共6組平行，12次檢測，結(jié)果表明，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的相對偏差小于2%，且回收率均在85%～105%范圍內(nèi)，所以該方法的精密度和回收率均符合相關(guān)標準要求。

3 結(jié)論

本研究利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析了白酒中7種甜味劑化合物的分子信息，利用多反應(yīng)監(jiān)測模式的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀技術(shù)，建立了一個快速、穩(wěn)定、靈敏的可定性定量甜味劑的方法。該方法可在14 min內(nèi)完成，其檢測范圍內(nèi)線性良好（r=0.999）；安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素和阿力甜檢出限是10 μg/L、定量限是20 μg/L；阿斯巴甜、紐甜檢出限是50 μg/L、定量限是100 μg/L；三氯蔗糖檢出限是40 μg/L、定量限是80 μg/L；精密度＜2%；回收率＞85%；且與國標中的檢測方法相比檢出限更低，能更加有效的監(jiān)控白酒中甜味劑的含量，綜上所述該方法可以對甜味劑進行實際的定性定量檢測。