尿外泌體與腎臟疾病相關(guān)性最新研究進(jìn)展

吳志佳 張 瑞

南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院，江蘇省連云港市 222000

我國是尿毒癥的高發(fā)國家，當(dāng)腎臟疾病發(fā)展至終末期階段，必定導(dǎo)致尿毒癥。引起尿毒癥的原因主要包括：原發(fā)性的或繼發(fā)性的慢性腎小球腎炎走向慢性腎衰竭，糖尿病腎病以及膜性增生性腎病等也是引起尿毒癥的原因之一。目前有遺傳性的多囊腎也逐漸成為我國腎病高死亡率的原因之一。當(dāng)腎臟發(fā)生病理上的壞死缺血及生理上的功能損傷是最先由尿液的性狀特征、氣味、顏色等方面表現(xiàn)出來。尿外泌體是一種細(xì)胞外囊泡，來源于腎臟和泌尿道的各種細(xì)胞釋放的。當(dāng)腎臟功能受損，及其腎小球、腎小管等結(jié)構(gòu)的損傷，都會(huì)排泄相應(yīng)的受損廢物——囊泡狀物質(zhì)，所以外泌體是直接反應(yīng)腎臟生理功能的最佳指標(biāo)。通過尿液中尿外泌體成分的分析，通過定量指標(biāo)檢測(cè)，可以精確地確定腎臟受損的嚴(yán)重程度及其生理功能的狀態(tài)，從而可以避免臨床上侵入性診斷腎臟疾病。

1 尿外泌體

1.1 概述 外泌體是一種形似于含有大量的活性物質(zhì)的囊泡狀顆粒物，并且通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在細(xì)胞間傳遞遺傳物質(zhì)。20世紀(jì)80年代，通過在體外培養(yǎng)的綿羊紅細(xì)胞培養(yǎng)液中， R.M.Johnstone[1]和Eberhard G.Trams這兩位科學(xué)家初次發(fā)現(xiàn)了外泌體[2]。到2007年，Valadi發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了外泌體中包含的mRNA以及microRNA具備良好的生物活性開發(fā)其研究?jī)r(jià)值。通過相關(guān)的研究實(shí)驗(yàn)，外泌體可以在人體的排泄物以及體內(nèi)流動(dòng)的血液和組織液中提取并分離出來。尿外泌體是由腎及泌尿道的相關(guān)器官中各種細(xì)胞合成并釋放到尿液中的胞外囊泡，因此尿外泌體中含有的氨基酸及核酸物質(zhì)可以作為衡量來源細(xì)胞生理狀態(tài)的最佳指標(biāo)。

1.2 尿外泌體的來源 除血液之外，尿液是另一種潛在的液體活檢樣本的來源。與血樣相比，尿液的侵入性更小，安全性更高，易于操作得以保存。尿外泌體是來自腎臟或其他泌尿系統(tǒng)細(xì)胞分泌的包含蛋白質(zhì)及核酸等物質(zhì)的細(xì)胞外囊泡(EVs)，腎小管、腎小球、膀胱細(xì)胞及前列腺的尿外泌體中所包含的蛋白質(zhì)及核酸物質(zhì)，可作為腎臟疾病的生物學(xué)標(biāo)志物，現(xiàn)階段，研究人員通過分析蛋白質(zhì)等組學(xué)成分，事實(shí)證明，幾乎所有腎臟的先天細(xì)胞都能分泌外泌體，小鼠腎細(xì)胞的足細(xì)胞在電鏡下可以看到多囊體和外泌體的存在[3]。隨著研究視角的轉(zhuǎn)變，小鼠的生殖道器官在電鏡下也能觀察到尿外泌體。有些尿外泌體是隨著血液循環(huán)，最后流入腎臟，通過相關(guān)的腎小球?yàn)V過功能排泄到體外，也可以成為尿外泌體，但所占比例微乎其微。

1.3 尿外泌體的提取分離 曾有研究利用兩步超速離心法，這是第一次從尿液中對(duì)尿外泌體進(jìn)行了成功的分離提取，隨著科學(xué)研究技術(shù)以及不斷發(fā)展成熟的技術(shù)手段，近年來可通過超速離心法、超濾法、磁珠免疫法等分離尿外泌體，這些方法各有利弊，若想要同時(shí)確保分離所得的尿外泌體的純度、產(chǎn)量及其生物活性的話到目前為止有一定難度，這也是實(shí)驗(yàn)后期我們亟須考慮解決的問題，使之盡可能達(dá)到最優(yōu)化。至今，人們對(duì)如何收集純化尿外泌體并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，超速離心法的使用較其他方法多一些，主要根據(jù)差速離心的原理進(jìn)行操作，該法操作簡(jiǎn)單，依次清除體內(nèi)的細(xì)胞，將殘余的碎片清理干凈，最后沉淀尿外泌體以到達(dá)收集純化的效果，由于處理起來產(chǎn)量不足相對(duì)耗時(shí)等缺點(diǎn)，需定制一個(gè)既省時(shí)產(chǎn)量又多的提取方法，在其純度及生物學(xué)活性上也需密切關(guān)注。

2 尿外泌體作為生物標(biāo)志物的應(yīng)用方面

大量研究表明，尿外泌體中的大量生物標(biāo)記物與腎臟疾病相關(guān)，為了在大量人群中廣泛篩查疾病，通過檢驗(yàn)入院患者尿液中的蛋白質(zhì)及核酸成分，據(jù)其成分組成推斷來源器官的生理狀態(tài)是否良好，判斷來源器官的結(jié)構(gòu)是否完整以及功能是否受到損傷破壞，目前已有大量新型生物標(biāo)記物可以標(biāo)記推斷出相關(guān)腎臟疾病。

2.1 急性腎損傷 急性腎損傷(Acute kidney injury，AKI)是臨床上常見的急性危重病，腎功能突然發(fā)生的(1～7d內(nèi))或持續(xù)(24h以上)下降，具有高死亡率特征的一種危重疾病[4]。臨床病診斷標(biāo)準(zhǔn)為血清肌酐(Scr)升高的含量至少達(dá)到0.5mg/d，出現(xiàn)氮質(zhì)血癥、水電解質(zhì)紊亂、酸堿平衡失調(diào)和一些其他的全身疾病癥狀?？砂橛猩倌?<400ml/24h或17ml/h)或無尿(<100ml/24h)，只有當(dāng)腎小球?yàn)V過率降低 50% 以上時(shí)，血清肌酐濃度才有明顯的上升現(xiàn)象，故臨床上迫切需要能夠提示早期腎功能下降的指標(biāo)。AKI動(dòng)物模型研究顯示，在早期(6～48h)水通道蛋白-1與鈉氫離子交換體[5]發(fā)生顯著的下降，相較于傳統(tǒng)的鈉排泄指標(biāo)分?jǐn)?shù)而言，尿視黃醇結(jié)合蛋白有高度的敏感性和高特異性等優(yōu)勢(shì)。此外，在損傷早期(2～6h)，尿外泌體的胎球蛋白-A、轉(zhuǎn)錄活化因子[6]和足細(xì)胞的骨架巢蛋白表達(dá)程度較高，較常規(guī)操作的血肌酐酶，可提前(18～48h)發(fā)生顯著的改變。

2.2 腎小管疾病 腎小管疾病(Renal tubular disorders)是指一組以腎小管功能障礙為主要特征的腎臟病變。該疾病的主要臨床表現(xiàn)包括腎性糖尿病、低分子量蛋白尿、氨基酸尿或電解質(zhì)紊亂及酸中毒，多種水轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在尿外泌體中被發(fā)現(xiàn)，側(cè)面可以反映出腎小管的生物轉(zhuǎn)運(yùn)活性的臨床豐度，因此這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可作為評(píng)價(jià)腎小管功能的生物標(biāo)志物。

2.3 多囊腎病 多囊腎病在臨床上屬于嚴(yán)重的遺傳性腎臟疾病，多囊腎是由腎小管的變形擴(kuò)張演變而來，又名Potter(Ⅰ)綜合征。1941年，我國朱憲彝首次報(bào)道多囊腎病，多囊腎有兩種類型，一種為常染色體顯性遺傳型，因其常在青中年時(shí)期發(fā)病，故又稱為成年型。另一種與之相反，常染色體隱性遺傳又稱嬰兒型，表現(xiàn)為雙腎腫大，在小兒上由于缺乏表達(dá)及相關(guān)癥狀，所以在臨床上很難被診斷出來，發(fā)病率為1∶1 000[7]，其發(fā)病機(jī)制與人體纖毛的發(fā)育異常密切相關(guān)。腎臟纖毛表達(dá)的多囊蛋白-1和多囊蛋白-2等其他囊蛋白共同參與形成囊蛋白復(fù)合體，腎小管受壓后使得腔內(nèi)水壓上升，促進(jìn)體內(nèi)鈣離子內(nèi)流增加，將機(jī)械能刺激轉(zhuǎn)變成化學(xué)信號(hào)，對(duì)生理性的左右不對(duì)稱發(fā)育有引導(dǎo)作用。通過對(duì)尿外泌體的蛋白組獨(dú)臂分析，在多囊腎病中可以檢測(cè)到4種蛋白組的物質(zhì)。最具有評(píng)估多囊腎病的預(yù)后價(jià)值的要數(shù)多囊蛋白與跨膜蛋白的相關(guān)性。因其具有遺傳相關(guān)性，在懷孕期間通過檢測(cè)PKD1或PKD2基因可有效降低新生兒缺陷率[8]。

2.4 腎小球疾病 腎小球足突細(xì)胞損傷狀態(tài)時(shí)，腎母細(xì)胞瘤蛋白-1(Wilms tumor 1 protein，WT1)是腎臟發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，尿外泌體是WT1內(nèi)載有的生物標(biāo)志物。WT1在局灶節(jié)段性腎小球硬化的動(dòng)物模型中腎穿標(biāo)本中表達(dá)有所上升，并早于蛋白尿出現(xiàn)[9]。Zhou 等在 FSGS 和塌陷性腎小球病兩種動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)尿外泌體的 WT1 早于蛋白尿升高，且升高幅度更明顯[10]，并可用來評(píng)估 ARB 類藥物的治療效果[11]。此外，尿外泌體 WT1 與早期 DN 患者的尿蛋白/血肌酐水平呈明顯相關(guān)[12]，可作為 DN 早期腎功能的監(jiān)測(cè)標(biāo)志。另有研究通過定量分析患者尿外泌體中與腎臟的足細(xì)胞生理相關(guān)的基因從而達(dá)到區(qū)分微小病變和局灶節(jié)段性腎小球硬化的目的[13]。對(duì)Ⅰ型糖尿病合并早期DN 患者尿外泌體的 miRNA 進(jìn)行表達(dá)差異分析，發(fā)現(xiàn)miR145 與對(duì)照組相比有顯著的升高。為進(jìn)一步提高檢測(cè)的陽性率，通過高濃度碳水化合物刺激腎小球系膜細(xì)胞后，細(xì)胞中的 miR145 升高更加顯著，暗示了miR145 可能成為1型糖尿病患者新的生物標(biāo)記物，成為臨床診斷的判斷依據(jù)。

3 尿外泌體在相關(guān)腎臟疾病中的臨床治療

外泌體，一種普遍存在人體血液、尿液中的囊泡物質(zhì)，不僅可以作為腎臟疾病診斷的相關(guān)性指標(biāo)，同時(shí)外泌體也不斷被挖掘在腎臟疾病治療中的未來臨床潛力。外泌體具有免疫作用、靶向運(yùn)輸作用以及保護(hù)修復(fù)三大作用[14]。

3.1 通過免疫作用的治療應(yīng)用 依據(jù)其免疫作用，在臨床上已經(jīng)得到較多的應(yīng)用。分泌腫瘤細(xì)胞的外泌體可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)與浸潤，抑制腫瘤的特異性免疫以及免疫監(jiān)視作用，但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤外泌體包含了一種抗原，此抗原可抑制癌基因生長(zhǎng)，促進(jìn)主要組織相容性復(fù)合體的一類分子細(xì)胞增殖分化[15]，并促使T細(xì)胞依賴的同種異型腫瘤進(jìn)行免疫防御。骨髓抑制細(xì)胞可以抑制T淋巴細(xì)胞的增殖與活化，在癌癥的發(fā)展進(jìn)程中，臨床可應(yīng)用MDSC對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)擴(kuò)散，在Stat3磷酸化與其外泌體的Hsp70的共同作用下，MDSC外泌體中所包含抗原可以發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的免疫作用[16]。在臨床診治中具有特異性，且靶向目標(biāo)明確，將其應(yīng)用于腎細(xì)胞癌相關(guān)的治療中，無疑是一項(xiàng)新的治療技術(shù)上的進(jìn)步。

3.2 通過靶向運(yùn)輸作用的治療應(yīng)用 靶向運(yùn)輸作用需要一個(gè)通常穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，內(nèi)皮組織可維持血流通暢，血壓穩(wěn)定，不易發(fā)生凝血阻塞，利于血脂清除，因而成為外泌體主要靶點(diǎn)的首選。研究證明上皮組織釋放一種叫促轉(zhuǎn)錄因子3(ATP3)的外泌體，在腎缺血再灌注損傷時(shí)可發(fā)揮巨大作用，該外泌體可抑制上皮細(xì)胞MCP-1的表達(dá)，抑制單核細(xì)胞促進(jìn)蛋白-1的釋放，抑制巨噬細(xì)胞向外周擴(kuò)散破壞組織結(jié)構(gòu)，從而腎缺血再灌時(shí)就不易發(fā)生大面積損傷甚至壞死，該種外泌體可針對(duì)腎缺血再灌注所造成的損傷進(jìn)行有效保護(hù)及治療[17]。

3.3 通過保護(hù)修復(fù)作用的治療應(yīng)用 外泌體作為間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的活性成分物質(zhì)，其保護(hù)修復(fù)作用在臨床應(yīng)用中意義非凡，可保護(hù)腎缺血再灌注造成的損傷現(xiàn)象并對(duì)其進(jìn)行修復(fù)作用，縮短腎臟功能的恢復(fù)時(shí)間，當(dāng)組織發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，含轉(zhuǎn)錄激活因子3 的RNA外泌體可減弱炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成的損傷，從而保護(hù)腎臟[18]。例如，在急性腎臟損傷時(shí)，外泌體通過旁分泌的作用，一方面減少腎臟的損傷程度，一方面也能提高腎臟缺損的修復(fù)速度。

目前運(yùn)用到臨床診斷腎病的主要依靠微蛋白、肌酐以及腎小球?yàn)V過率等測(cè)定。然而能夠精確的診斷某一種腎病類型以及損傷程度只能依靠侵入性的穿刺做病理活檢。尿外泌體在腎臟疾病方面有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。作為腎臟疾病發(fā)展的第一診斷指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)特異性的尿外泌體，通過對(duì)其篩查，必定可以作為疾病早期診斷的指標(biāo)。目前，越來越多的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了泌尿系統(tǒng)中尿外泌體的作用，對(duì)相關(guān)疾病的治療將會(huì)成為新時(shí)期的一個(gè)研究熱點(diǎn)。