Non-coding RNAs在肺纖維化發(fā)病機制中的作用的研究進展

郭玉娟，顏天華

中國藥科大學 基礎醫(yī)學與臨床藥學學院，南京 210009

目前，肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）已成為全球范圍內(nèi)關注的健康問題，發(fā)病率和患病率高，患者的預后極差。由于沒有特異性的治療策略，多數(shù)患者死于進行性呼吸功能衰竭[1]。利用基因組學技術對肺纖維化的分子機制和新靶點進行研究，已成為目前的研究熱點?；蚪M中大量基因并不編碼蛋白質(zhì)，卻又會轉(zhuǎn)錄成非編碼RNA （Non-coding RNAs，ncRNA）。其中微小 RNA（microRNA，miRNA）和長鏈非編碼 RNA（lncRNA）[2]在PF的病理過程和發(fā)病機制中研究較多，本文對此作一綜述，旨在為探索肺纖維化的新治療靶點提供參考。

1 非編碼RNA

1.1 非編碼RNA

ncRNA是一類內(nèi)源的非蛋白質(zhì)編碼RNA，存在于各種細胞中，具有多樣化的生物學功能。根據(jù)長度，ncRNA可分為兩大類：（1）短 ncRNAs（＜200 個核苷酸），如 miRNA；（2）長ncRNAs（lncRNAs）（＞200 個核苷酸），如 lncRNA[3]。此外，還有一種閉合環(huán)狀的內(nèi)源性RNA，稱為環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA），不具有5'端帽子和3'端尾巴結(jié)構。

1.2 lncRNA的作用機制

lncRNAs通常定位在細胞核和細胞質(zhì)中，它調(diào)控基因表達的機制有：（1）在表觀遺傳學水平：可以通過DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑等形式，對生物體的表觀遺傳進行調(diào)控；（2）在轉(zhuǎn)錄水平；（3）在轉(zhuǎn)錄后水平：主要涉及 miRNA水平、mRNA水平和蛋白質(zhì)水平；（4）在翻譯水平：可作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）與miRNA相互作用，或直接與mRNA結(jié)合，參與靶基因的表達調(diào)控；（5）在細胞外的調(diào)控：通過包裹在細胞外分泌物中于細胞之間轉(zhuǎn)移[4，5]。

1.3 miRNA的作用機制

miRNA是一類長約18～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA。其作用機制主要有：（1）翻譯抑制：在大多數(shù)情況下（主要是哺乳動物中），單鏈miRNA與靶mRNA不完全互補配對，抑制靶基因的翻譯過程，從而調(diào)節(jié)基因表達。這種方式只影響蛋白質(zhì)的翻譯水平，并不影響mRNA的穩(wěn)定性。（2）mRNA的降解：當miRNA與mRNA完全互補配對時，引起靶mRNA的降解，從而導致基因沉默。一個miRNA可以調(diào)控多個靶mRNA，而特定的mRNA也可以與多個miRNA結(jié)合，從而達到不同的調(diào)控效果[6，7]。

1.4 lncRNA與miRNA相互作用

lncRNA與miRNA的雙向調(diào)節(jié)作用使其調(diào)控基因表達，共同影響多種疾病的發(fā)展過程。miRNA通過直接或間接方式調(diào)控lncRNA。當miRNA與lncRNA的3'UTR不完全匹配時，可直接負性調(diào)節(jié)lncRNA；miRNA也可以與其他分子相互作用，間接作用于lncRNA[8]。lncRNA調(diào)控miRNA可通過作為內(nèi)源性miRNA海綿、與miRNA競爭性結(jié)合mRNA的3'UTR、剪切產(chǎn)生miRNA前體等途徑[9]。

2 miRNA在肺纖維化中的研究現(xiàn)狀

肺纖維化是一種由于過度的細胞外基質(zhì)沉積而導致瘢痕形成的病理狀態(tài)，與miRNA的失調(diào)有關。越來越多的研究正在篩選和鑒定在肺纖維化中失調(diào)的miRNA。miRNA可通過正或負調(diào)控其靶蛋白的表達而參與肺纖維化的過程。

2.1 let-7

let-7家族是發(fā)現(xiàn)最早、研究最深入的miRNA之一。其中l(wèi)et-7d在正常的肺泡上皮細胞中高豐度表達，能維持上皮細胞表型并抑制細胞過度增殖分化，是正常肺功能所必需的[10]。高遷移率族蛋白A2（HMGA2）是let-7的重要靶基因，也是上皮間質(zhì)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的激活劑。在肺纖維化中，TGF-β1能通過Smad3與let-7d的啟動子結(jié)合來下調(diào)let-7d，從而減弱了let-7d對HMGA2的抑制，促進EMT，使肺泡細胞增厚和膠原沉積增加[11]。此外，RAS也是let-7家族的靶基因，與細胞增殖具有密切關系，也參與let-7抗 EMT效應[12]。

2.2 miR-21

miR-21是人肺中最常表達的miRNA，在肺纖維化的發(fā)病機制中起著重要的作用。miR-21在博來霉素（BLM）誘導的纖維化小鼠的肺中和特發(fā)性肺纖維化（IPF）患者的肺中表達增加，主要定位于肌成纖維細胞[13]。抑制miR-21可減輕纖維化和肌成纖維細胞分化的程度。miR-21能抑制smad7蛋白而促進TGF-β1/smad信號通路增強EMT的過程，反之，TGF-β1可增強miR-21的表達[14]。因此，miR-21是開發(fā)肺纖維化新療法的潛在目標。

2.3 miR-29

miR-29家族由 miR-29a、miR-29b和miR-29c組成，能抑制細胞外基質(zhì)（ECM）的合成，miR-29在肺纖維化中顯著減少[15]，表明其具有抗纖維化功能[16]。miR-29的靶標包括ELN、FBN1、COL1A1、COL1A2 和 COL3A1 等 ECM 基 因[17]。Cushing L等[15]發(fā)現(xiàn)，在IMR-90細胞和BLM處理的小鼠肺中，miR-29及其下游靶基因COL3A1、COL4A1被 TGF-β1下調(diào)，使纖維化相關基因的表達上調(diào)，從而導致肺纖維化。Xiao J等[18]發(fā)現(xiàn)miR-29是Smad3的下游靶基因，在肺纖維化中受TGF-β/Smad信號傳導的負調(diào)控。因此，miR-29是TGF-β介導的纖維化基因調(diào)節(jié)的重要促進因子。

2.4 miR-155

miR-155是正常免疫功能所必需的，其過度表達與炎癥、自身免疫和癌癥有關，而miR-155缺陷型小鼠則發(fā)生與年齡相關的氣道纖維化。Pottier N等[19]發(fā)現(xiàn)，在用TNF-α和IL-1β處理人肺成纖維細胞后，miR-155的表達增加，而用TGF-β1處理后表達降低。miR-155的表達增加可使纖維化細胞因子7（FGF-7）的表達下調(diào)，促進成纖維細胞遷移。Kurowska-Stolarska M等[20]發(fā)現(xiàn)，miR-155敲除的小鼠出現(xiàn)肺纖維化加劇、膠原沉積增加、TGF-β產(chǎn)生以及巨噬細胞的活化。在肺成纖維細胞和巨噬細胞中，miR-155的靶基因肝X受體（LXR）α顯著下調(diào)。說明miR-155/LXR途徑可能具有治療IPF的潛力。

2.5 miR-200

miR-200家族主要包括 miR-200a、miR-200b和 miR-200c，能維持上皮細胞表型并參與EMT進程[21]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-200在肺纖維化小鼠和IPF患者肺中下調(diào)，并且miR-200s的表達增加可抑制TGF-β誘導的肺泡上皮細胞EMT發(fā)生，發(fā)揮抗肺纖維化作用[21]。miR-200s可通過E-cadherin的轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和SIP1靶向抑制EMT。此外，miR-200能靶向抑制β-catenin基因的表達，從而調(diào)控Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導途徑的活性[22]。

3 lncRNA在肺纖維化中的研究現(xiàn)狀

lncRNA雖不編碼蛋白質(zhì)，但能通過控制基因循環(huán)、調(diào)節(jié)mRNA剪接、調(diào)節(jié)mRNA衰變以及將染色體組織成基因鄰域等方式調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[23]。

3.1MRAK088388和MRAK081523

Song X等[24]首次揭示了lncRNA可能在肺纖維化中作為ceRNA。在BLM誘導的肺纖維化大鼠模型中，發(fā)現(xiàn)兩個上調(diào)的lncRNA MRAK088388和MRAK081523，它們的序列與肺纖維化中兩個上調(diào)的基因 （N4bp2和Plxna4）高度相似。MRAK088388 和 N4bp2 對 miR-200、miR-429、miR-29 和miR-30具有相同的miRNA反應元件（MRE），而MRAK081523和Plxna4對miR-218、miR-141、miR-98和let-7具有相同的MRE。MRAK088388通過miR-29b-3p調(diào)節(jié)下游的N4bp2，而MRAK081523通過與let-7i-5p競爭性結(jié)合調(diào)控Plxna4表達。因此，MRAK088388和MRAK081523可作為ceRNA，促進成纖維細胞的增殖分化而導致肺纖維化的發(fā)生。

3.2 n341773和CD99P1

Huang C等[25]發(fā)現(xiàn)在IPF中l(wèi)ncRNA n341773和CD99P1的表達下調(diào)。n341773是miR-199的ceRNA，其表達和功能與miR-199的表達和功能呈負相關[26]。在LL29細胞中，n341773的下調(diào)使肺成纖維細胞中膠原蛋白的表達增加。CD99P1雖具有miR-101的結(jié)合位點，但兩者的表達和功能并不相關。而CD99P1的敲除能抑制α-SMA的表達和成纖維細胞的增殖。由于α-SMA是成纖維細胞分化為肌成纖維細胞的標志，CD99P1和n341773可能參與肺成纖維細胞增殖和分化的調(diào)節(jié)。

3.3 uc.77和05Rik

在百草枯誘導的肺間質(zhì)纖維化小鼠中，發(fā)現(xiàn)兩個上調(diào)的lncRNA uc.77和05Rik，它們分別調(diào)節(jié)靶基因Zeb2和Hoxa3（EMT的關鍵調(diào)節(jié)劑）的表達而引起EMT，導致肺纖維化[27]。uc.77的過表達可增加Zeb2的表達，而05Rik的過表達則抑制Hoxa3的表達。uc.77和05Rik的過表達改變EMT標志物的表達，如降低E-cadherin的表達、增加Vimentin和α-SMA的表達，表明uc.77和05Rik通過調(diào)節(jié)EMT在肺纖維化中發(fā)揮作用[28]。

3.4 H19

lncRNA H19在胎兒組織和成人肌肉中大量表達，具有發(fā)育調(diào)節(jié)作用，與人類遺傳疾病和癌癥有關[29]。H19含有l(wèi)et-7家族的結(jié)合位點，可以充當靶基因let-7的ceRNA，調(diào)節(jié)let-7的轉(zhuǎn)錄表達。let-7過表達能減輕H19敲除引起的早熟肌肉分化[30]。H19在BLM誘導的小鼠中和TGF-β誘導的成纖維細胞中上調(diào)，并且其敲除能改善肺纖維化癥狀。H19直接與 miR-29b的 3'UTR相互作用，抑制 miR-29b，使COL1A1表達增加，表明H19通過miR-29參與肺纖維化[31]。此外，H19是miR-196a的直接靶標，通過與miR-196a競爭作為ceRNA來調(diào)節(jié)COL1A1[32]。因此，H19對BLM誘導的IPF具有促進作用，為IPF提供了新的治療靶標。

3.5 lincRNA-p21

LincRNA-p21在細胞增殖、凋亡和DNA損傷反應中發(fā)揮重要作用，如調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的生長和角質(zhì)形成細胞的凋亡等[33]。LincRNA-p21 作為“腫瘤抑制因子 ncRNAs”或“致癌ncRNAs”，位于p53調(diào)節(jié)基因的啟動子中，調(diào)節(jié)p53介導的凋亡途徑中的基因表達[34]。在脂多糖（LPS）處理的肺成纖維細胞和小鼠模型中[33]，lincRNA-p21隨著Thy-1的下調(diào)而上調(diào)。Thy-1糖蛋白在正常的肺成纖維細胞中表達，但在IPF的成纖維細胞灶中不表達。Thy-1能影響纖維化表型，起到“纖維化抑制劑”的作用[35]。LincRNA-p21過表達可促進成纖維細胞的增殖，抑制H3和H4在Thy-1啟動子上的乙?；约癏LF1細胞中Thy-1的活性，參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。

4 小 結(jié)

ncRNA是肺纖維化中重要的調(diào)節(jié)因子，在肺纖維化發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用。目前的藥物開發(fā)重點是通過單分子檢測分析等新技術，來降低成本并提高lncRNA和miRNA生物測定的準確性。增加lncRNA和miRNA生物標記領域的標準化，例如尋找可靠的數(shù)據(jù)標準化因子，可進一步提高結(jié)果的準確性和可重復性。