三氧化二砷在髓母細胞瘤治療中對SHH通路抑制機制的研究進展

方黃毅 張 哲 龐 晨 盛漢松

髓母細胞瘤(MB)是兒童中樞神經系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，約占15歲以下兒童所有腦部腫瘤的20%[1]。MB具有惡性程度高、容易轉移、術后易復發(fā)等特點。通過對髓母細胞瘤的患者采取手術、放療及化療的綜合治療，髓母細胞瘤患者的術后生存率(0.1～20.3年)達到70%。盡管常規(guī)療法對大部分髓母細胞瘤患者有效果，但大多數(shù)存活者長期忍受放療和化療帶來的不良反應，包括發(fā)育、神經以及內分泌等方面的失調[2]。因此，尋找更加安全、高效及低廉的靶向抑制治療具有重要的意義。

在細胞分子研究中，MB包含了多個分子亞型：SHH型、WNT型、第3組型 (group3)、第4組型(group4) 。髓母細胞瘤亞群顯示高度不同的細胞遺傳學、突變譜和基因表達特征，此外還有不同的臨床表型，例如腫瘤細胞組織學和患者預后的差異[3]。SHH型基本為促纖維增生/結節(jié)型髓母細胞瘤，好發(fā)于嬰幼兒和成人，預后較差。在大多數(shù)情況下，SHH亞組涉及SHH通路的一個或多個基因(如PTCH1、SUFU或SMO等)的體細胞突變，導致通路異常激活，進一步導致MB的發(fā)生。

三氧化二砷(ATO)作為SHH信號通路的一種靶向抑制劑，主要通過抑制SHH信號通路下游GLI蛋白在腫瘤細胞中的特異性表達，從而抑制通路下游的靶基因的過度激活來發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖生長的作用[4]。

一、MB中SHH通路的異常表達與調節(jié)

SHH信號通路的激活在胚胎發(fā)育過程中對于不同組織和器官的增殖分化是必不可少的。在胚胎發(fā)育階段之后，該通路通過控制細胞增殖和分化來促進成體組織的穩(wěn)定和修復。然而，當這種途徑被異常激活時，會導致不同器官腫瘤的產生[1]。在小腦的胚胎發(fā)育過程中， SHH信號通路主要通過調控小腦外顆粒層的普肯野細胞(purkinje cell)增殖從而促進小腦發(fā)育增殖，但在胚胎期之后仍維持其激活可能導致MB的發(fā)生。通路的異常激活在MB中發(fā)生機制通常表現(xiàn)為PTCH1或者通路下游基因的突變[5]。SHH信號通路中的SHH蛋白的相對分子質量為45000，具有自催化活性，可分為N端和C端(分別為20000和25000)[6]。SHH的N端羧基發(fā)生變化，形成膽固醇，增強蛋白的結合、分泌和轉運活性。當SHH與PTCH1跨膜受體結合時，SMO(通常被PTCH1抑制的受體)被釋放，經歷構象改變，并轉移到細胞質中。SMO與細胞質中融合同源物(SUFU)的抑制劑結合，從而釋放屬于GLI家族的蛋白質。GLI蛋白轉運到細胞核，在細胞核中它們作為轉錄因子調節(jié)不同靶點的表達，例如GLI1、PTCH1、CYCLINED和MYC，這些靶點涉及細胞存活、增殖和分化，當這些轉錄因子異常激活或抑制則可能導致MB的發(fā)生[5]。研究表明，GLI家族蛋白中GLI2在SHH激活中起核心作用。GLI1蛋白與GLI2一起轉錄，但是沒有起主要作用，僅作為該通路的激活標記[7]。并且有相關實驗表明GLI2基因敲除引起的細胞數(shù)目減少是由G0細胞周期阻滯引起的，不會發(fā)生細胞凋亡[8]。這些發(fā)現(xiàn)表明在MB的治療中GLI2是可能的治療目標。導致SHH通路活化的一個機制是抑制調節(jié)基因的突變，這種機制的一個例子是PTCH1同源物編碼基因的體細胞突變和雜合性丟失[9]。

PTCH是一種 12 次跨膜蛋白受體，SMO是一種 7 次跨膜蛋白受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族的一員。在人類體內發(fā)現(xiàn)存在兩種PTCH 同源基因為PTCH1 和 PTCH2，PTCH蛋白位于細胞膜表面，具有兩種功能， 一是與SHH 蛋白結合，二是抑制 SMO 蛋白。當PTCH1同源物編碼基因發(fā)生改變，SHH 蛋白與 PTCH結合， PTCH 對 SMO 的抑制作用就被解除，SMO 將信號向胞內傳遞，可導致MB發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，兩個GLI等位基因的失活導致PTCH雜合小鼠中MB的形成，這表明SHH信號可以獨立指導腫瘤的發(fā)生[7]。SHH的激活還涉及其他基因的突變，嬰兒和成人中最常見的是SUFU和SMO突變[7]。在4～17歲的患者中TP53基因突變占到50%。這些結果表明考慮患者的年齡范圍和存在的遺傳改變，可以更好地指導MB的治療。此外，其他信號通路可與SHH通路發(fā)生交叉調節(jié)。通過血管內皮生長因子(EGF)和重組SHH(N-shh)刺激可上調細胞中PI3K、MAPK和SHH信號通路的表達，細胞表面生長因子(EGF)通過EGFR介導的信號的誘導強烈激活ERK1/2和AKT[10]。ERK1/2和AKT通過上調SHH下游靶基因GLI1的轉錄水平且不影響GLI3A/GLY3R比值來增強SHH通路活性。這些信號通路抑制劑的聯(lián)合使用是MB靶向治療的一種潛在的選擇。

二、當前針對SHH通路的靶向治療

SHH通路抑制劑是一類針對SHH通路基因異常激活進行靶向治療的藥物，天然甾體生物堿環(huán)杷明(cyclopmine)是最早發(fā)現(xiàn)具有SHH通路抑制活性的藥物之一。它通過選擇性地結合SMO發(fā)揮作用，具有抑制細胞增殖分化和體內腫瘤轉移的能力[11,12]。這些發(fā)現(xiàn)也促進了包括vismodegib(GDC-0449)在內的SMO抑制劑類藥物的發(fā)展[13]。首例接受SHH髓母細胞瘤治療的成人患者對vismodegib迅速產生耐藥性，后來發(fā)現(xiàn)其SMO點突變D473H，D473H突變破壞了vismodegib與SMO的結合能力，導致耐藥性的發(fā)生[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，vismodegib和mebendazole聯(lián)合使用可抑制SHH信號通路[13]。mebendazole是一種抗寄生蟲藥，通過抑制原纖毛的形成來抑制SHH信號通路的異常激活，這對于SMO突變的腫瘤細胞具有一定的抑制效果。此外，SHH信號通路上游的小分子抑制劑被證明能夠有效抑制SHH通路的異常表達。Robotnikin是該通路上游常見的小分子抑制劑，它能夠與SHH蛋白競爭性結合，拮抗SHH蛋白與PTCHI受體結合從而抑制SHH信號通路異常表達[15]。但是，在SHH基因發(fā)生突變時，這種抑制劑也可能會失去作用。所以，多種SHH信號通路靶向抑制劑的聯(lián)合使用可能減少耐藥性的發(fā)生。

有研究表明SHH型髓母細胞瘤尤其是合并有GLI2轉錄活躍的患者，其預后往往較差，拮抗SHH信號通路下游GLI基因的異常激活，可能能夠提高患者的預后[16]。GANT61、GANT58是SHH信號通路下游的GLI常見的轉錄拮抗劑，它們通過與GLI基因位點特異性結合，拮抗GLI蛋白轉錄活性從而抑制SHH信號通路的異常激活[17]。所以，SHH信號通路下游基因位點的靶向抑制對腫瘤治療同樣具有重要的作用，而且為解決抑制劑耐藥性等問題提供了新的思路。

三、ATO作用機制

ATO作為一種已知的用于治療急性早幼粒細胞白血病M3的藥物，其對早幼粒細胞白血病蛋白(PML)的影響已經得到很好的證實。ATO通過與目標蛋白附近的半胱氨酸的巰基直接相互作用而發(fā)揮其生物效應[7]。在SHH通路的研究中ATO主要通過抑制GLI2在纖毛積聚并促進GLI2降解從而抑制腫瘤生長。研究表明，砷與微管蛋白相互作用影響GLI蛋白向纖毛的轉移能力，并且這種作用可以通過破壞GLI蛋白結構來介導[18]。相關實驗還表明ATO抑制生長的作用與GLI蛋白水平有關，ATO影響了幾種GLI1或GLI2蛋白表達水平高的腫瘤細胞系的生長，但對GLI蛋白表達水平低的細胞系影響不大，這提示對于患者的預后有積極作用。在與人類腫瘤高度相似的小鼠胚胎腫瘤實驗中，用ATO處理后SHH通路中多個靶基因蛋白(PTCH1、GLI1和GLI2)顯著下調，同時檢測到腫瘤細胞中Ki67 蛋白減少，表明ATO通過抑制SHH信號通路下游的靶基因的過度激活而發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖生長的作用[19]。人骨腫瘤的實驗研究表明，ATO還可通過促進DNA損傷積累導致腫瘤細胞凋亡[20]。上述研究均提示ATO對于SHH信號通路異常激活的腫瘤細胞有著良好的抑制作用，尤其是在對SMO抑制劑產生耐藥性的情況下。在治療MB的藥物實驗中，ATO與SHH通路的其他靶向抑制劑聯(lián)合使用能夠更加有效地抑制MB的生長。在與ATO研究相關動物實驗中，伊曲康唑作為SMO的一種特異性抑制劑與ATO聯(lián)合治療MB有著不錯的效果，在PTCH陽性和TP53陰性的動物身上進行兩種藥物的試驗，發(fā)現(xiàn)對腫瘤體積的減少有協(xié)同作用[7]。許多研究表明ATO與SHH通路其他靶基因抑制劑聯(lián)合使用能夠更有效地拮抗通路多種靶基因的異常表達，從而抑制MB的生長。

四、ATO在MB治療的前景

當前對MB治療的策略還處于探索之中。早期研究集中在SHH通路及其組分PTCH1、SMO和SUFU，并開發(fā)阻斷通路的特異性藥物。治療初期，藥物干預的臨床結果是積極的。然而，在一段時間的治療后觀察到耐藥性。相對于通路中PTCH1和SMO，下游GLI基因是一個探索較少的基因，對該基因進行靶向抑制可能將會更有效地拮抗SHH通路的異常激活。所以，直接阻斷GLI的藥物可能將被包括在標準治療方案[多藥化療和(或)放療]中。ATO是具有獨特的歷史、豐富的臨床應用和良好的中樞神經系統(tǒng)滲透性的藥物，目前仍在白血病以外的領域對其進行研究。在涉及SHH通路的MB中ATO的臨床前研究已經得到證明，在聯(lián)合化療的MB動物模型中，該藥物的評估也較為良好[5]。