內(nèi)皮祖細胞與組織工程皮膚構(gòu)建

李 潔 李 欣 蔣如如 閻春生 哈小琴

1963年，首次報道了血液中可能存在內(nèi)皮細胞，而后在心臟移植患者的冠狀動脈內(nèi)壁發(fā)現(xiàn)了受體來源的內(nèi)皮細胞，提示受體血液中的內(nèi)皮細胞定居于移植物并參與血管壁的構(gòu)建，再次證明移植物表面存在內(nèi)皮細胞，而這些內(nèi)皮細胞只可能來源于血液。1997年，Asahara等[1]首次證明循環(huán)外周血中存在能分化為血管內(nèi)皮細胞的前體細胞,并將其命名為血管內(nèi)皮祖細胞。內(nèi)皮祖細胞來源于骨髓,它們進入循環(huán)血,在血管移植物上分化為內(nèi)皮細胞[2]。內(nèi)皮祖細胞是在缺氧等病理條件下從骨髓中募集的，在缺血組織的新生血管形成中起著至關重要的作用。

目前已經(jīng)建立了兩種主要的EPCs亞型：所謂的“早期”EPCs(隨后稱為早期EPCs)和后期衍生的EPCs(晚期EPCs)[3]。在體外培養(yǎng)過程中，根據(jù)其生物學特性和外觀可對其進行分類?！霸缙凇盓PCs出現(xiàn)在外周血來源的單核細胞在內(nèi)皮細胞特異性培養(yǎng)基中培養(yǎng)后不到1周，而在2～3周后可以發(fā)現(xiàn)晚期的EPCs。晚期EPCs被認為主要是通過其分化成成熟內(nèi)皮細胞的能力直接參與新生血管的形成，而早期EPCs將各種血管生成因子表達為內(nèi)源性貨物，以旁分泌的方式促進血管生成。

一、內(nèi)皮祖細胞在改善皮瓣血運狀況中的研究進展

作為最大的器官，皮膚覆蓋整個身體的外部，占總體重的8%左右。由于其直接暴露于潛在有害的微生物、熱、機械和化學損傷，皮膚的損失可能由于多種原因而發(fā)生，包括紊亂、急性創(chuàng)傷、慢性傷口甚至手術(shù)干預。皮瓣的愈合是一個復雜的過程，主要涉及多種細胞、生長因子、炎性介質(zhì)等，由多種因子相互交錯、重疊而有序地完成，整個過程要經(jīng)過炎性反應期、細胞增殖期與組織重建期。血液供應的不足，將直接影響愈合的時間及質(zhì)量，充足的血液供應能夠加速組織的新陳代謝，改善組織循環(huán)，修復組織缺血、缺氧的狀態(tài)，而充足的血液供應來自血管的再生和重建，因此血管再生在皮瓣修復過程中是治療的關鍵。堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是一類多肽生長因子，其作為細胞有絲分裂源，可促進細胞的增殖、分化，且在機體的各種損傷中起著重要的修復作用[4]。

相關研究表明，bFGF可誘導血管內(nèi)皮細胞增殖、加快細胞遷移速率，促進內(nèi)皮細胞形成管腔，改善組織的血液循環(huán)，增加供氧量，加速組織的新陳代謝，進而縮短愈合時間[5]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是促進血管內(nèi)皮細胞有絲分裂的細胞因子，能促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、變形、移動，使其進入膠原，形成新生血管[6]；增加微靜脈、小靜脈通透性，有利于蛋白質(zhì)大分子外滲，部分外滲的蛋白質(zhì)可形成纖維蛋白原，支持內(nèi)皮細胞生長，從而促進血管生成及生長。在促進血管再生過程中VEGF與bFGF具有協(xié)同作用，其機制在于皮瓣移植后吻合區(qū)處于缺血狀態(tài)，缺血誘導bFGF 分泌，其作用于血管內(nèi)皮后，調(diào)節(jié)VEGF基因表達，進而增加VEGF的產(chǎn)生。兩者協(xié)同，共同誘導血管內(nèi)皮細胞的增殖、分化、遷移的過程，從而起到修復血管的作用[7]。

現(xiàn)如今，已經(jīng)在組織中成功建立了皮瓣預制技術(shù)，這項技術(shù)可以通過構(gòu)造顯微外科血管環(huán)在體內(nèi)形成缺失組織的內(nèi)在血管，可以通過顯微外科手術(shù)將組織移動到缺陷中。但在文獻中，用皮膚覆蓋的工程化組織的組合還沒有得到廣泛報道。顯微外科手術(shù)現(xiàn)在是日常臨床生活的重要組成部分，可以在移植、再植和皮瓣手術(shù)中獲得優(yōu)異的結(jié)果，但其在優(yōu)化、修改和創(chuàng)新仍然是當代社會的重要問題。

迄今為止，顯微外科研究的不可替代的主力仍是動物模型，因為在大鼠中進行的實驗性皮瓣模型適用于涉及生理學、神經(jīng)再支配以及皮瓣的設計和功能的研究，而它們能提供與臨床情況精確相似的條件。文獻中的實驗模型設計的數(shù)量與各種組織瓣相關，例如包含皮膚、肌肉、骨骼或神經(jīng)的組織瓣。另外，已經(jīng)出現(xiàn)了多種所謂的復合皮瓣，其包括一種以上組織結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)移，例如肌皮瓣、骨肌瓣、神經(jīng)皮膚瓣、筋膜皮膚瓣、神經(jīng)肌肉皮膚或骨肌皮瓣等[8]。由于這些技術(shù)受到血管系統(tǒng)解剖學的限制，外科醫(yī)生開始預制皮瓣：將確定組織的血液供應輸送到自體顯微手術(shù)產(chǎn)生的椎弓根，以便隨后將其作為游離皮瓣轉(zhuǎn)移。有研究建立了一個包含生物材料和全層皮膚覆蓋的預制復合皮瓣的實驗模型來研究支架預制、全層皮膚移植覆蓋和組織自由移植，此外，還研究了在受體部位轉(zhuǎn)移的復合皮瓣的功能完整性，最終成功建立了用于預制復合皮瓣外科轉(zhuǎn)移的臨床模型[9]。同時，該實驗證明，可持續(xù)優(yōu)化移植皮瓣活力的策略可能是有效的，即在今后的研究中可對即將到來的缺血狀態(tài)進行預處理或進行延遲。另外，在組織由支架到皮膚是否代表了血管形成過程的惡化這一問題中，研究人員認為支架和皮膚覆蓋之間的接觸可能起決定性作用。然而，支架或者皮膚接觸是動物術(shù)后活動和活動過程中的伴隨現(xiàn)象。盡管如此，在未來的實驗中可以嘗試更為細致的固定，如組織膠或其他方式的縫合，以最大限度地減少這種問題。就血管形成而言，皮瓣預制涉及一定程度的不可預測性，因此需要繼續(xù)成為未來實驗研究的重點，直到它能夠更成功地整合到臨床常規(guī)的標準中去。

EPCs已被用于改善缺血皮瓣的血運重建，但效果不佳。體外沖擊波療法(extracorporeal shock-wave therapy, ESWT)是一種新的治療方法，它是物理學和醫(yī)學相結(jié)合的一種新技術(shù)，因其基本無不良反應被稱為是骨科疾病的綠色療法。ESWT可有效治療骨折不愈合、肌腱炎和骨無菌性壞死，還被用于治療心臟病學中的心絞痛和缺血性心力衰竭等缺血性疾病。ESWT是一種有前景的非侵入性血管生成方式，雖然沖擊波治療的確切機制尚不確定，但一些研究表明，沖擊波治療可以顯著上調(diào)趨化因子和血管生成細胞因子的表達，還可以通過上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)和VEGF的表達以及轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-beta, TGF-β)的表達來促進糖尿病傷口愈合并避免大鼠游離皮瓣壞死[10]。有研究對EPCs植入聯(lián)合ESWT對動物模型中缺血性皮瓣存活的復合作用進行了探討，在大鼠背部制作缺血性皮瓣并相應地進行治療，術(shù)后定期測量皮瓣的血流量，比較皮瓣成活率[11]。結(jié)果顯示，在改善大鼠缺血性皮瓣的存活中，EPC和ESWT的聯(lián)合治療優(yōu)于單獨的EPC或ESWT處理。單獨使用EPC或ESWT處理可以為長寬比低于2∶1的大鼠皮瓣提供保護，而使用EPC和ESWT的雙重治療對于大鼠中長寬比高于2∶1的皮瓣是有效的。然而，該結(jié)果基于動物模型，人的真皮結(jié)構(gòu)與大鼠不同，因此該技術(shù)的臨床應用還有待進一步研究。

二、內(nèi)皮祖細胞在組織工程皮膚構(gòu)建中的意義

組織工程皮膚替代品是治療急性和慢性皮膚傷口的合理治療選擇。自1975年人類表皮角質(zhì)形成細胞的成功分離和培養(yǎng)以來，組織工程皮膚(tissue-engineered skin, TES)已經(jīng)從表皮替代品發(fā)展到含有不同種子細胞的全層皮膚[12]。根據(jù)其解剖結(jié)構(gòu)，皮膚替代產(chǎn)品可分為細胞上皮自體移植物、工程化真皮替代物和工程化的真皮-表皮復合替代物。所有這些產(chǎn)品已成為臨床治療大面積全層皮膚缺損的前瞻性措施。

由于內(nèi)皮源性細胞直接參與血管形成，因此，在TES等效物中，傳遞內(nèi)皮源性細胞仍然是增強新生血管形成最系統(tǒng)的方法。此外，不同種子細胞與EPCs之間的相互作用可能通過血管生成和(或)血管發(fā)生促進TES的血管化。通過在體外共培養(yǎng)膠原海綿中的真皮成纖維細胞和EPCs，形成具有分支結(jié)構(gòu)的復雜血管網(wǎng)絡。在后續(xù)的的研究中證實成纖維細胞可以相互作用，并支持EPCs的遷移、生存和網(wǎng)絡形成[13]。而有研究表明，含有真皮成纖維細胞的無支架雙層TES與真皮微血管EPCs在培養(yǎng)多天后可以形成毛細血管樣結(jié)構(gòu)[14]。此外，這種血管形成過程與角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞和ECs之間的相互作用有關。然而，為了進一步促進EPCs的臨床應用，需要克服其體外擴增能力有限、免疫原性強等缺點。

當前，不同的實驗室和公司正在開發(fā)不同的方法，一些人造皮膚等價物已經(jīng)商業(yè)化，許多其他方法也在開發(fā)中[15]。根據(jù)TES解剖結(jié)構(gòu)的復雜性，其構(gòu)造可分為單層替代品和雙層替代品。在體外培養(yǎng)和擴增人角質(zhì)形成細胞的基礎上，通過各種方式開發(fā)了多種自體表皮替代物來替代再上皮化。表皮替代物的應用直接緩解了皮膚活檢的不足[16]。然而，這種培養(yǎng)的上皮自體移植物的臨床整合是不可預測的，主要依賴于創(chuàng)面床的情況，而不是最終分化的角質(zhì)形成細胞。此外，由于缺乏真皮而導致的攣縮力學性能差和發(fā)育不良也是表皮替代物的問題。這就對開發(fā)真皮替代品提出了進一步的要求。真皮層提供的機械穩(wěn)定性和彈性可以防止創(chuàng)面收縮和瘢痕增生。對于全層燒傷，必須連續(xù)應用真皮當量和表皮當量，以便在應用表皮層前形成合適的營養(yǎng)和免疫環(huán)境。大量非細胞化真皮替代物主要由異體真皮基質(zhì)或合成材料產(chǎn)生，可刺激自體EPCs和成纖維細胞向內(nèi)生長，幫助移植后缺損區(qū)域形成真皮結(jié)構(gòu)，而由人類新生兒成纖維細胞組成的一些具有生物活性的真皮替代物自發(fā)地顯示出血管形成、表皮化以及細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的形成方面的益處。雙層皮膚替代品結(jié)合表皮和真皮兩層，在組織學上模擬正常皮膚的結(jié)構(gòu)。如果不考慮經(jīng)濟因素，目前與單層產(chǎn)品比較，表皮/真皮復合TES是皮膚修復的最佳治療方案。

在皮膚組織工程中，實質(zhì)與基質(zhì)的相互作用對表皮形成過程中組織結(jié)構(gòu)和功能的規(guī)劃具有指導意義，人們普遍認為成纖維細胞對上皮形態(tài)學的誘導作用是通過細胞-細胞相互作用和ECM分泌介導的，由于多種種子細胞類型之間的相互作用，表皮/真皮替代物表現(xiàn)出更強的創(chuàng)面閉合和角質(zhì)化能力。而除了臨床上可用的TES外，人們還在探索優(yōu)化的3D構(gòu)建體以修復皮膚組織[17]。皮膚生物學的最新進展強調(diào)了表皮形態(tài)發(fā)生過程中細胞-細胞相互作用的重要性。特別是皮膚組織工程領域的進步極大地促進了對體外表皮形態(tài)發(fā)生的認識，從而重建了高度復雜和創(chuàng)新的3D皮膚等效物，模仿人體皮膚的組織結(jié)構(gòu)和功能，包括毛囊、毛細血管網(wǎng)、感覺神經(jīng)支配、脂肪組織和色素生產(chǎn)[18]。隨著傷口愈合機制的逐步深入，細胞的合理組合及其在創(chuàng)面愈合中的相互作用可能是永久性TES構(gòu)建的出路[19]。

三、展 望

目前，大多數(shù)TES只能作為皮膚創(chuàng)傷愈合的臨時替代品。缺乏及時的血液供應和免疫排斥反應的激活是阻礙同種異體TES永久整合的兩個主要問題。有證據(jù)表明，TES中所含的大部分細胞在移植后1個月內(nèi)無法存活[20]。這種臨時性質(zhì)，無論替代品是可降解的還是必須去除的，都使得TES主要用作覆蓋物，而不是真正的有機再生器。然而，有理由相信，隨著皮膚生物學、材料科學和工程技術(shù)的發(fā)展，TES最終將具有與自體皮膚移植相同結(jié)構(gòu)和功能的治療效果。