ICSI周期顯微鏡下睪丸切開取精術(shù)治療非梗阻性無精子癥的臨床研究

孫建華，周梁，季興哲，張洲，師娟子，邢俊平

(1. 西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心，西安 710003；2. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，西安 710061)

非梗阻性無精子癥(nonobstructive azoospermia，NOA)是男性不育中最嚴(yán)重的一種疾病，無論是何種原因所致的NOA，共同的特點(diǎn)是睪丸生精功能衰竭，精子發(fā)生障礙[1]。近年來隨著ICSI輔助生殖技術(shù)的日臻成熟，以及顯微鏡下睪丸切開取精術(shù)(microdissection testicular sperm extraction，microTESE)的日漸普及，使得非梗阻性無精子癥患者有了越來越好的預(yù)后。ICSI技術(shù)的出現(xiàn)使得一個(gè)卵母細(xì)胞只需要一個(gè)精子成為現(xiàn)實(shí)，同時(shí)NOA中存在局灶性生精的理論基礎(chǔ)，讓microTESE獲取睪丸精子成為可能。目前，microTESE結(jié)合ICSI已經(jīng)成為治療NOA的金標(biāo)準(zhǔn)。在本研究中，我們評估分析了ICSI周期microTESE治療非梗阻性無精子患者的精子獲得率(sperm retrieval rates，SRR)，以及使用所獲得睪丸精子ICSI的臨床結(jié)局以及出生的新生兒的各種指標(biāo)。

資料與方法

一、研究對象

我們回顧性分析了2015年1月至2017年6月期間在西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心就診、采用microTESE的281例NOA患者的臨床資料，同時(shí)選取采用睪丸穿刺獲取精子的95例梗阻性無精子癥(obstructive azoospermia，OA)患者做為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)選擇每個(gè)使用新鮮精子用于ICSI的第一個(gè)治療周期的患者；(2)同一體外受精(IVF)實(shí)驗(yàn)室人員行ICSI助孕；(3)無精子癥診斷標(biāo)準(zhǔn)為至少3次精液離心后未檢見精子；(4)所有入組患者均進(jìn)行一般資料評估：病史、體格檢查、血清激素(FSH、LH、總T)和基因檢測(染色體核型和Y染色體的微缺失)；(5)所有病例均未進(jìn)行常規(guī)藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方影響生育的因素；(2)女方年齡>35歲。

二、研究方法

1.ICSI-ET方案：女方均采用常規(guī)促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)長方案促排卵。根據(jù)患者年齡、基礎(chǔ)FSH水平、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(AFC)決定促性腺激素起始劑量，當(dāng)有3個(gè)以上主導(dǎo)卵泡直徑≥17 mm時(shí)，當(dāng)晚注射HCG 5 000～10 000 U，36 h后在B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵，取卵后1～2 h脫顆粒，脫顆粒后1 h行ICSI。培養(yǎng)3 d后根據(jù)胚胎評分標(biāo)準(zhǔn)選擇1～2個(gè)胚胎移植或有4個(gè)以上優(yōu)質(zhì)胚胎者行囊胚培養(yǎng)到D5移植，剩余胚胎冷凍保存。于取卵日當(dāng)天開始黃體酮60 mg/d肌注，移植后14 d測尿HCG陽性及血清HCG≥50 U/L者繼續(xù)黃體支持，至移植后5周，B超見到孕囊為臨床妊娠。

2.觀察時(shí)間和指標(biāo)：D1早上觀察原核情況，D3觀察卵裂情況，根據(jù)胚胎特征對D3胚胎進(jìn)行分級。優(yōu)質(zhì)胚胎標(biāo)準(zhǔn)：1級和2級胚胎。

3.精子獲?。河谂饺÷讶涨耙惶旎蛘弋?dāng)天，NOA組男方行ICSI周期microTESE，按照Dabaja等[2]所描述的標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)施。OA組患者女方取卵當(dāng)日行經(jīng)皮睪丸精子抽吸術(shù)(testicular sperm aspiration，TESA)。所有患者在實(shí)施手術(shù)前，手淫留取精液標(biāo)本離心檢測證實(shí)無精子。如果一側(cè)睪丸術(shù)中未檢到精子，給另一側(cè)睪丸實(shí)施手術(shù)。所取得的睪丸組織碎片立即送IVF實(shí)驗(yàn)室檢查。若檢見精子，將盛有精子的培養(yǎng)皿放入37℃溫箱孵化培養(yǎng)，待女方取卵后行ICSI治療，ICSI治療后如有剩余精子或是卵子則進(jìn)行冷凍保存，以備再次助孕治療使用；若未檢見精子，或是精子不符合ICSI標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)患者夫妻雙方意愿選擇供精體外授精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer with donor semen，IVF-D)治療，或是冷凍保存卵子。

4.臨床妊娠診斷標(biāo)準(zhǔn)：胚胎移植后28～30 d行B超檢查見孕囊及心管搏動(dòng)為臨床妊娠。

5.觀察指標(biāo)：對兩組的精子獲得率(獲得精子的例數(shù)/手術(shù)例數(shù))、2PN受精率(2PN受精卵數(shù)/ICSI卵子數(shù))、優(yōu)胚率(優(yōu)胚數(shù)/卵裂數(shù))、臨床妊娠率(臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù))、活產(chǎn)率(活產(chǎn)嬰兒數(shù)/臨床妊娠數(shù))、流產(chǎn)率(流產(chǎn)數(shù)/臨床妊娠數(shù))、新生兒出生結(jié)局(單胎率、雙胎率、新生兒孕周、新生兒體重、男性性別比例)進(jìn)行比較。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料比較

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，281例NOA患者和95例OA患者的年齡相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而組間激素水平(FSH、LH、T)及獲精率(SRR)相比有顯著性差異(P<0.05)(表1)。成功使用獲取精子ICSI周期的NOA組和OA組在女方年齡、基礎(chǔ)FSH值、不育年限、獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)及平均移植胚胎數(shù)方面相比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

二、兩組患者的ICSI臨床結(jié)局

NOA組患者中睪丸獲得精子共118例，其中19例精子質(zhì)量較差未行ICSI治療，NOA組獲取精子成功行ICSI的99周期；OA組95例獲取精子均成功行ICSI周期，即95周期。兩組間2PN受精率及優(yōu)胚率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；NOA組第一周期新鮮移植68例，OA組62例，兩組間臨床妊娠率及活產(chǎn)率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

三、NOA和OA兩組的新生兒相關(guān)參數(shù)

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在新生兒相關(guān)參數(shù)比較上，兩組的出生新生兒胎數(shù)、孕齡、出生體重及男性性別比例的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

表1 兩組男方一般資料比較[(-±s)，%]

注：與OA組比較，*P<0.05

表2 成功使用獲取精子ICSI周期的兩組女方一般資料比較(-±s)

表3 兩組臨床結(jié)局(%)

表4 兩組新生兒結(jié)局比較[(-±s)，%]

討 論

無精子癥是一種描述射精的術(shù)語，它只能說明精液中缺乏精子而不能說明沒有精子的原因[3]。在臨床上，常以NOA或OA的方式對無精子癥患者進(jìn)行分類?；加蠳OA的男性的睪丸功能失調(diào)，包括遺傳和先天性異常、后天性感染性疾病、生殖腺毒素暴露、創(chuàng)傷、內(nèi)分泌失調(diào)和特發(fā)性病因[4]。除了由于腦垂體促性腺激素缺乏的極少數(shù)低促性腺激素性性腺功能減退癥的患者可以通過適當(dāng)?shù)闹委熁謴?fù)睪丸生精功能，絕大多數(shù)NOA患者都有不可挽回的睪丸功能衰竭。由于絕大多數(shù)NOA患者沒有合適的治療方案，一種選擇是嘗試睪丸內(nèi)獲取精子，并為ICSI尋找可用的睪丸精子[5]。這種方法的基本原理依賴于在NOA患者中，有60%的罕見灶狀精子的生成[6]。

對于NOA患者在microTESE前推薦的治療方法是睪丸切開取精術(shù)(testicular sperm extraction，TESE)，但是它的成功率波動(dòng)于25%～60%之間[7]。由于正常精子發(fā)生的位置是不可預(yù)測的，常常需要多點(diǎn)取精，出現(xiàn)并發(fā)癥的幾率大，因此有學(xué)者建議在這種情況下使用microTESE作為一種更好的方法[8-9]。microTESE能夠鑒別出可能有精子的粗大飽滿的曲精細(xì)管，微小組織的提取和保存，是microTESE的重要特征，從而降低了睪丸斷流的缺血風(fēng)險(xiǎn)，很好地保護(hù)睪丸的功能[10]。在既往文獻(xiàn)報(bào)道中，microTESE比TESE和經(jīng)皮睪丸抽吸術(shù)有更好獲精率和更少的術(shù)后并發(fā)癥[9]。因此，microTESE是我們在NOA中首選的精子獲取方法。由于microTESE是一種侵入性的手術(shù)，我們使用了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)來將患者歸類為NOA。我們的方法包括精液分析結(jié)果、病史和體格檢查、內(nèi)分泌概況和基因測試。此外，我們通過術(shù)后組織學(xué)評估證實(shí)了診斷。這些參數(shù)的結(jié)合可以非常準(zhǔn)確地診斷NOA[11]。在本研究中，SRR為41.99%，與文獻(xiàn)報(bào)道的相似[12-13]。

如果男方在ICSI周期前安排手術(shù)，所獲取精子需要冷凍保存，ICSI周期時(shí)解凍復(fù)蘇。由于NOA患者睪丸中獲取的精子數(shù)量極少，且精子細(xì)胞膜尚未完全成熟，精子核的穩(wěn)定性也較差，冷凍保存復(fù)蘇后的活率和回收率會(huì)明顯降低[14]，因此我們選擇ICSI周期女方取卵前一天或者當(dāng)天進(jìn)行手術(shù)。有研究表明NOA患者通過手術(shù)獲取并凍融的精子的生殖潛能顯著低于新鮮精子[15]。Meta分析結(jié)果表明，采用新鮮精子與凍融睪丸精子，ICSI受精率仍相似，但新鮮精子的著床率(約73%)顯著高于凍融睪丸精子[16]。而本研究中ICSI周期顯微鏡下睪丸切開取精術(shù)獲得精子后，無需冷凍保存，經(jīng)孵化培養(yǎng)后，更有利于檢見成熟的精子行ICSI治療。

與NOA不同的是，OA是在生殖道中包括輸精管、附睪或射精管的某一個(gè)部位發(fā)生機(jī)械阻塞，但具有正常的精子發(fā)生[17]。OA的治療方案包括顯微外科重建和獲取精子行ICSI[18]。在OA的SRR是100%，并且不受精子收集方法和阻塞原因的影響[19-20]。在本研究中，經(jīng)皮睪丸穿刺的SRR也為100%，同文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。

因?yàn)镹OA精子發(fā)生異常同時(shí)存在缺陷，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為即使獲取睪丸精子行ICSI，其預(yù)后不理想[5，21]。生精功能嚴(yán)重受損患者的睪丸精子的生育潛能似乎降低了，并且更可能攜帶與遺傳物質(zhì)相關(guān)的缺陷，最終影響雄性配子激活卵子，以及受精卵和存活胚胎形成和發(fā)育的能力[15]。目前的有限數(shù)據(jù)表明，取精技術(shù)本身并不影響ICSI成功率[15]。

ICSI被廣泛應(yīng)用于嚴(yán)重男性不育患者，但國內(nèi)外只有少數(shù)研究通過區(qū)分無精子癥的類型評估ICSI結(jié)局，并對比兩種不同類型無精子癥的出生后代的健康問題[22-23]。有研究表明，NOA患者通過microTESE取到睪丸精子行ICSI的臨床妊娠率，顯著低于通過睪丸獲取精子的OA患者[24]。然而在本研究中，我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NOA組和OA組間臨床妊娠率差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組之間的女方一般資料情況差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能同我們的樣本量較少有關(guān)。但結(jié)果提示，NOA和OA組的臨床妊娠率可能同精子發(fā)生的缺陷無關(guān)。

到目前為止，只有較少的研究比較了NOA和OA使用睪丸精子ICSI出生新生兒的基本參數(shù)[22-23]，以往研究結(jié)果表明出生新生兒的胎齡、體重、性別比例均無顯著性差異，我們本次研究結(jié)果顯示，96個(gè)新生兒中，NOA組和OA組在孕齡、出生體重、性別構(gòu)成比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與以往結(jié)果相似。目前收集到的懷孕和產(chǎn)后ICSI數(shù)據(jù)表明使用睪丸精子是安全的，但有限的樣本數(shù)量分析，限制了研究結(jié)果的可靠性，需要進(jìn)一步持續(xù)的監(jiān)控。此外，對后期兒童的身體、神經(jīng)和發(fā)育結(jié)果的研究仍然缺乏。未來的研究需要我們不僅應(yīng)該著眼于長期結(jié)局追蹤，更應(yīng)該有多中心合作及大樣本的研究。

綜上所述，本研究表明非梗阻性無精癥引起的不育可以通過睪丸顯微取精術(shù)獲取精子，采用獲取的精子ICSI助孕獲得同自己有血緣關(guān)系的孩子。一旦實(shí)現(xiàn)了活產(chǎn)，在后代新生兒的外形上沒有差異。ICSI周期顯微鏡下睪丸切開取精術(shù)治療非梗阻性無精子癥值得臨床推廣。