血清維生素D水平與體外受精-胚胎移植長方案新鮮周期妊娠結(jié)局的相關(guān)性研究

王馥新，高靚，石燕，李紅*

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院，蘇州市立醫(yī)院本部生殖與遺傳中心，蘇州 215000； 2. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院，蘇州市立醫(yī)院本部檢驗科，蘇州 215000)

維生素D(vitamin D，Vit D)是一種脂溶性維生素，主要調(diào)節(jié)人體鈣磷平衡，促進骨礦化。它有VitD2和VitD3兩種形式，其中VitD3占人體總量的90%～95%。在紫外線的作用下，皮膚中的7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)化為前體VitD3，然后在體內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化為VitD3。這種VitD3無活性，需經(jīng)兩次羥基化才有生物學(xué)活性。在肝臟第1次羥基化，產(chǎn)生25(OH)D3，在腎臟經(jīng)1α羥化酶發(fā)生第2次羥基化，產(chǎn)生生物活性代謝物1，25(OH)2D3。近年來越來越多的證據(jù)表明，維生素D除了經(jīng)典的調(diào)節(jié)骨骼鈣磷代謝的作用外，也存在其他作用。

研究發(fā)現(xiàn)，人體卵巢、胎盤、子宮內(nèi)膜均含有1α羥化酶[1]，能代謝合成有活性的1，25(OH)2D3；同時，卵巢顆粒細胞[2-3]、子宮內(nèi)膜細胞、子宮蛻膜[4]、胎盤[4-5]、輸卵管上皮細胞及垂體[6]均存在維生素D受體(VDR)。維生素D在生殖領(lǐng)域的功能日益受到重視。動物實驗表明，維生素D缺乏的小鼠，其卵母細胞成熟受阻、子宮發(fā)育不全，不孕癥及妊娠期并發(fā)癥發(fā)生率增加[7-9]。近年來，在IVF領(lǐng)域，維生素D對妊娠結(jié)局的影響也備受關(guān)注，但目前爭議較多，未達成共識。本研究旨在探討HCG日次日患者血清維生素D水平與IVF新鮮周期妊娠結(jié)局的相關(guān)性，探討維生素D能否作為預(yù)測IVF妊娠率的指標。

資料與方法

一、研究對象

選取2017年3月至2018年2月在蘇州市立醫(yī)院本部生殖中心因輸卵管因素接受IVF/ICSI長方案治療并新鮮周期移植、年齡<35歲的不孕癥患者，共147例。排除PCOS、卵巢功能減退、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥、高泌乳素血癥、子宮畸形、甲狀腺功能異常等其他內(nèi)分泌疾病及全身疾病。

二、分組

1.按維生素D水平分組：按目前國際普遍接受的北美內(nèi)分泌協(xié)會對維生素D缺乏狀態(tài)的定義[10]，由25羥化酶在肝臟代謝為25羥維生素D[25(OH)D]是血液循環(huán)中濃度最高的維生素D衍生物，包括25(OH)D2和25(OH)D3，因其不受攝取的鈣的量所影響，而且半衰期長，故可代表體內(nèi)維生素D的狀態(tài)，被認為是評價體內(nèi)維生素D水平的最佳指標。若測出的總25(OH)D值≥30 ng/ml(75 nmol/L)，說明維生素D充足；如<20 ng/ml(50 nmol/L)說明維生素D缺乏；總25(OH)D值介于20～30 ng/ml之間，定義為維生素D不足。依此標準，將納入患者分為3組。

2.按季節(jié)分組：因人體血清維生素D水平主要與日照強度相關(guān)，進一步將納入人群按冬、春、夏、秋四季分組。

3.按妊娠結(jié)局分組：為進一步比較血清維生素D與IVF新鮮周期妊娠結(jié)局的影響，按臨床妊娠結(jié)局分為妊娠組及未妊娠組。

三、促排卵及胚胎移植回顧

自月經(jīng)第3天口服避孕藥(達英-35，拜耳，德國)15 d，皮下注射短效GnRH-a(達必佳，輝凌制藥，瑞士)，降調(diào)14 d；根據(jù)血清FSH、LH、E2、孕酮(P)水平，及陰道B超監(jiān)測竇卵泡情況，符合降調(diào)標準者(FSH<5 U/L，最大竇卵泡平均直徑<5 mm)開始給予促性腺藥物刺激，至少3個卵泡直徑≥16 mm時，當(dāng)晚注射重組人HCG(艾澤，默克雪蘭諾，德國)250 μg；36 h后行經(jīng)陰道穿刺取卵術(shù)。所有患者均于取卵次日起每日肌注黃體酮60 mg支持黃體。取卵后3 d，若患者無明顯OHSS征象，當(dāng)日在超聲引導(dǎo)下移植D3胚胎1～2枚。移植后12 d抽血檢測β-HCG，陽性者于移植后25 d行陰道B超檢查，見胎心搏動為臨床妊娠。

于HCG日次日清晨空腹靜脈采血，采用雅培Abbott ARCHITECT i2000sr自動免疫分析儀(雅培，美國)，化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法測定血清25(OH)D水平。

四、觀察指標

比較各組間年齡、不孕年限、體重指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)內(nèi)分泌等一般情況；獲卵數(shù)、MII卵率、優(yōu)胚率、移植胚胎數(shù)等實驗室指標；Gn總天數(shù)、Gn總劑量、移植日子宮內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、異位妊娠率等臨床指標。

五、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、不同血清維生素D水平組比較

出于分組標準，三個水平組間的血清維生素D水平有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；三組間患者平均年齡、不孕年限、體重指數(shù)、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH、基礎(chǔ)E2、AMH均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；三組間胚胎實驗室指標(獲卵數(shù)、MII卵率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、移植胚胎數(shù))均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；三組間妊娠結(jié)局相關(guān)指標(臨床妊娠率、異位妊娠率、活產(chǎn)率)亦均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；早期流產(chǎn)率絕對數(shù)值隨維生素D水平升高而降低，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 不同血清維生素D水平組間一般情況及妊娠結(jié)局比較[(-±s)，%]

注：與其他兩組比較，*P<0.05

二、按季節(jié)分組比較

因人體內(nèi)90%的維生素D來源于光照后皮膚的轉(zhuǎn)化，蘇州地處長江中下游平原，一年中日照呈現(xiàn)四季變化，季節(jié)因素是影響維生素D水平的主要因素。因此進一步按四季分組比較。各季節(jié)組間患者一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；冬季及春季患者維生素D水平顯著低于夏秋季(P<0.05)，冬季組臨床妊娠率絕對數(shù)值較低，但各組患者間臨床妊娠率、流產(chǎn)率、異位妊娠率等妊娠結(jié)局相關(guān)指標均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

三、按臨床妊娠結(jié)局分組比較

按臨床妊娠結(jié)局，分為妊娠組(79例)和非妊娠組(68例)。兩組間HCG次日血清維生素D水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；同時，兩組在年齡、不孕年限、體重指數(shù)、基礎(chǔ)FSH、LH、E2、AMH等一般情況均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；促排卵天數(shù)、藥物總劑量、獲卵數(shù)、移植日內(nèi)膜厚度均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；妊娠組優(yōu)質(zhì)胚胎率數(shù)值上高于未妊娠組，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表2 按季節(jié)分組各組一般情況及臨床結(jié)局比較[(-±s)，%]

注：與夏、秋組比較，*P<0.05

表3 妊娠組與未妊娠組一般情況比較[(-±s)，%]

討 論

維生素D在女性生殖生理中發(fā)揮著重要作用，國內(nèi)外關(guān)于維生素D與IVF臨床妊娠結(jié)局相關(guān)性研究較多，但結(jié)論不一。Ozkan等[11]對84例接受IVF治療的不孕婦女的研究發(fā)現(xiàn)，血清和卵泡液中的維生素D水平高者，胚胎種植率及臨床妊娠率均高，卵泡液中維生素D含量每增加1 ng/ml，臨床妊娠率增加6%，作者認為維生素D是預(yù)測IVF周期成功的獨立因素。Budick等[12]回顧性分析了99例供卵凍融胚胎移植周期，維生素D含量充足的患者臨床妊娠率高于維生素D缺乏者，推測維生素D可能是通過影響子宮內(nèi)膜容受性而影響臨床妊娠率。一項對188名接受IVF治療的患者的回顧性研究顯示，美國非西班牙裔白種人中，血清維生素D水平與妊娠結(jié)局正相關(guān)，而在亞裔患者中無明顯相關(guān)性[13]。然而，F(xiàn)ranasiak等[14]研究了移植優(yōu)質(zhì)囊胚的患者中血清維生素D水平與妊娠結(jié)局的關(guān)系，提示兩者不相關(guān)。Aleyasin等[15]則認為高水平維生素D與IVF妊娠結(jié)局呈負相關(guān)，卵泡液維生素D水平較高患者獲卵數(shù)略增加，其胚胎質(zhì)量卻較維生素D水平低者更差。

我中心HCG日扳機后12 h常規(guī)留取患者血清測定激素變化情況，因此本研究中選取此日同時留取的患者血清測定血清維生素D水平，在不增加患者痛苦的同時，該日血清維生素D水平與取卵日及胚胎移植日的血清維生素D水平更接近，更具參考意義。我們按國際普遍接受的北美內(nèi)分泌協(xié)會維生素D分組標準，將輸卵管因素接受IVF治療的患者分為“維生素D缺乏組”、“維生素D不足組”、“維生素D充足組”，比較發(fā)現(xiàn)年齡<35歲、因輸卵管因素行IVF助孕患者中，維生素D充足者僅占24.48%，維生素D缺乏狀態(tài)較為普遍。蘇州地區(qū)，不同季節(jié)，患者體內(nèi)維生素D 水平呈現(xiàn)較大波動，冬春季節(jié)因日照較少，維生素D水平較低。無論是根據(jù)北美內(nèi)分泌協(xié)會維生素D營養(yǎng)狀態(tài)分組，還是按季節(jié)進行分組，各組患者間一般情況相似，具有可比性，然而組間成熟卵率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、異位妊娠率等指標，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

值得注意的是，本研究數(shù)據(jù)提示早期流產(chǎn)率絕對值隨維生素D水平升高而逐漸降低，維生素D缺乏組為9.34%，維生素D不足組為4.41%，維生素D充足組為2.78%。維生素D能作用于子宮內(nèi)膜VDR，上調(diào)著床相關(guān)基因如HOXA10表達[16]。徐士儒等[17]研究發(fā)現(xiàn)，維生素D能降低復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血NK細胞毒性，降低復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者流產(chǎn)率。有文獻報道，維生素D能調(diào)節(jié)母胎界面免疫狀態(tài)，使局部免疫平衡從TH1向TH2傾斜，有利于妊娠的維持[18]。這可能是早期流產(chǎn)率隨維生素D水平增高而降低的原因。但遺憾的是，由于本研究樣本量較小，早期流產(chǎn)率在不同維生素D水平組并無統(tǒng)計學(xué)差異。

上述分組標準參照的是北美內(nèi)分泌學(xué)會的建議，主要適用于評價骨質(zhì)疏松、鈣磷代謝的狀態(tài)，在不孕癥人群中是否適用，目前尚無證據(jù)。因此，我們進一步按臨床妊娠結(jié)局分為“臨床妊娠組”及“未妊娠組”，兩組年齡、體重指數(shù)、不孕年限、基礎(chǔ)內(nèi)分泌等背景情況相似，但兩組HCG日次日血清維生素D水平分別為(24.05±7.59)ng/ml、(25.27±7.10)ng/ml，十分接近。較多證據(jù)表明維生素D缺乏可能與PCOS和子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病相關(guān)。維生素D參與胰島素代謝，維生素D缺乏會引發(fā)胰島素抵抗，因此維生素D缺乏可能會導(dǎo)致PCOS的發(fā)生[19]。同時，維生素D具有免疫調(diào)節(jié)及抗炎功能，參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。體外實驗結(jié)果顯示，1，25(OH)2D3能上調(diào)IL-8及前列腺素的表達，進而顯著對抗IL-1β及TNF-α誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，對抗子宮內(nèi)膜異位癥患者局部的免疫異常[20]。本研究的研究對象為僅為輸卵管因素所致不孕的年輕女性，不包含PCOS和子宮內(nèi)膜異位癥患者，因而可能輸卵管因素人群妊娠結(jié)局與維生素D缺乏狀態(tài)關(guān)聯(lián)性較小，導(dǎo)致“妊娠組”與“未妊娠”組間維生素D水平不存在差異。

卵泡液中25(OH)D水平較外周血循環(huán)更能反映卵泡局部微環(huán)境的情況，但目前結(jié)果也不一致。Antunes等[21]認為卵泡液中維生素D水平越低，卵母細胞質(zhì)量越好；Farzadi等[22]則認為，卵泡液中維生素D水平與IVF種植率及IVF妊娠結(jié)局呈正相關(guān)。而另有學(xué)者認為無論血清維生素D抑或卵泡液維生素D水平與IVF妊娠結(jié)局均不存在相關(guān)性[23]。以上這些學(xué)者測定的均是25(OH)D，然而卵巢局部或是子宮內(nèi)膜局部有活性的1，25(OH)2D3水平更能直接說明維生素D對妊娠結(jié)局的影響，但目前對于1，25(OH)2D3尚無很好的檢測手段。本研究中未能測定卵泡局部的維生素D水平，且目前尚缺乏有效手段檢測維生素D活性產(chǎn)物1，25(OH)2D3的水平，這也是造成本研究中維生素D水平對組間妊娠結(jié)局無影響的可能因素。

此外，最近兩篇薈萃分析結(jié)果提示，血清維生素D水平不影響IVF臨床妊娠率，但維生素D缺乏患者其持續(xù)妊娠率和活產(chǎn)率低于維生素D充足者[24]。維生素D本身參與調(diào)節(jié)胎盤功能，參與妊娠[25]。本研究中因部分患者尚無最終妊娠結(jié)局，未能比較組間最終活產(chǎn)率的差異。但檢索現(xiàn)有文獻，未查詢到比較血清維生素D水平在IVF受孕婦女及自然受孕婦女間對圍產(chǎn)結(jié)局的影響。我們推測維生素D水平可能與妊娠本身相關(guān)，對妊娠中晚期的影響更大，而與IVF這項技術(shù)本身關(guān)聯(lián)性較小，但仍需進一步深入探討。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，HCG日次日血清維生素D水平與因輸卵管因素行IVF新鮮移植周期妊娠結(jié)局不相關(guān)，無法預(yù)測其妊娠結(jié)局。但由于研究對象病因及樣本量的局限性，對維生素D與IVF妊娠結(jié)局的影響仍需更多更深入的研究。