滋腎通竅飲對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠血清生長(zhǎng)激素、視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜厚度的影晌

鐘瑞英，俞曉藝，田 妮

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的常見(jiàn)疾病，發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，患病10年以上2型DM患者大多數(shù)都會(huì)發(fā)展成糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR)）[1]。 DR 是 DM 最常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，是反映機(jī)體代謝、內(nèi)分泌及血液損害的典型微血管病變[2]，而傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療DR上已證實(shí)具有確切的療效[3-6]。中藥是否能通過(guò)對(duì)DM患者神經(jīng)內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，而發(fā)揮其防治DR特有的功效？從臨床應(yīng)用中藥滋腎通竅飲治療DR，發(fā)現(xiàn)治療DR非增殖前期病變有良好的療效[7]。本研究采用傳統(tǒng)的DM模型：即鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的SD大鼠模型，觀察滋腎通竅飲對(duì)DM大鼠的血清GH、視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜厚度的影響，從而探索滋腎通竅飲對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用機(jī)理，為中醫(yī)藥防治糖尿病性視網(wǎng)膜病變的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康成年SD大鼠50只 (約2月齡)，體質(zhì)量（350±20）g，雌雄各半，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。檢查屈光間質(zhì)清，瞳孔等大等圓，對(duì)光反射好。所有動(dòng)物全程分籠飼養(yǎng)在達(dá)標(biāo)動(dòng)物房?jī)?nèi)(由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，全程顆粒飼料喂飼，不限飲水、進(jìn)食，自然晝夜光線照明。室內(nèi)通風(fēng)良好，氨濃度小于2 QPPM，室溫保持 18～22°C，相對(duì)濕度為40%～70%。

1.2 藥品及試劑

滋腎通竅飲 處方組成：山萸肉20g、枸杞子15g、桑椹子 15 g、菟絲子 15 g、女貞子 15 g、石斛 12 g、黃芪 15g、太子參 20g、茯苓 15g、旱蓮草 10g、澤蘭 10g、田七 10g、丹參 10g、柴胡 12g、石菖蒲 15g、香附 12g、葛根20 g、升麻10g。由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室將中藥按比例每劑用300 ml清水浸泡30 min后，放入自動(dòng)煎藥機(jī)內(nèi)，在壓力1.5㎏、溫度100°C狀態(tài)下煎煮40 min，濃縮過(guò)濾，將藥液裝入真空袋內(nèi)，每劑濃縮成40 ml，其濃度為5.9 g/ml。

導(dǎo)升明膠囊（奧地利依比威大公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20070370）；鏈脲佐菌素(STZ美國(guó) Sigma公司，批號(hào)：HZB0894)。

1.3 主要儀器

Accutrend alpha血糖儀（美國(guó)強(qiáng)生公司）。YB-6型生物組織包埋機(jī) （湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所）。ZT-12H生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所）。LEICA RM2025石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leitz公司）。BH-2，BX-50生物顯微鏡（Olympus公司）。Cryostat172O恒溫箱切片機(jī) （德國(guó)Leitz公司）。超微切片機(jī)（德國(guó)Lei tz公司）。透射電鏡H-800（日本日立公司）。

1.4 造模方法

參考預(yù)實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)方法[8]制作一個(gè)實(shí)驗(yàn)誘發(fā)的2型糖尿病大鼠模型，其發(fā)病過(guò)程及特征與部分患者的臨床過(guò)程及代謝特征類似。將40只制模前大鼠禁食10h，自由飲水。將STZ溶于pH=4.5的0.1mmol/L枸椽酸鈉緩沖液，配成1%STZ溶液，經(jīng)紫外線消毒滅菌后，按60 mg/kg一次性大鼠腹腔注射。72 h后用尿糖試紙測(cè)尿糖，取鼠尾血測(cè)血糖，隨機(jī)血糖濃度≥16.65 mmol/L，尿糖在++～+++者即為DM大鼠成功模型。血糖低于＜16.65 mmol/L的大鼠于禁食10 h后再次注射上述相同劑量的STZ累加成模，同法測(cè)血糖篩選出DM大鼠。造模成功后開(kāi)始計(jì)算病程。此后每月測(cè)1次血糖，每周稱體質(zhì)量。所有大鼠在灌胃期間自由飲水進(jìn)食，根據(jù)體重變化調(diào)整藥物用量。

1.5 分組與給藥方法

將造模成功的DM大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為5組：正常組：灌胃蒸餾水2 ml，1次/d。模型組：灌胃蒸餾水2 ml，1次/d。滋腎通竅飲低劑量組：灌胃相當(dāng)成人劑量5倍滋腎通竅飲制劑(23.6 g/kg)，1次/d。滋腎通竅飲高劑量組：灌胃相當(dāng)成人劑量10倍滋腎通竅飲制劑，(47.2 g/kg)，1次/d。導(dǎo)升明組：灌胃相當(dāng)成人5倍制劑(0.107 g/kg)，1次/d。持續(xù)3個(gè)月。

1.6 血清GH測(cè)定

取有蓋的玻璃器皿放入適量的乙醚，待大鼠麻醉后，頸動(dòng)脈插管取血，保存于-20℃儲(chǔ)存待測(cè)。用低溫大容量離心機(jī)分離血清，于37℃水浴孵育3 h,經(jīng)三次非特異性洗脫,用放射免疫計(jì)數(shù)器測(cè)定血清GH。

1.7 電鏡樣品的制備及基底膜厚度測(cè)定

參考預(yù)實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)方法[9],過(guò)量麻醉處死大鼠，摘除眼球，自角膜緣后0.5 mm處剪開(kāi)眼球,去除眼前節(jié)和玻璃體，取大鼠右眼球視網(wǎng)膜組織切成面積為1.5 mm×3 mm的小塊，2.5%戊二醛、1%鋨酸后固定，梯度乙醇脫水，樹(shù)脂包埋，LKB超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾及枸椽酸鉛雙重染色，取每份視網(wǎng)膜透射電鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體質(zhì)量、血糖、生長(zhǎng)激素值

40只SD大鼠共有37只成模。1只于造模后1 d死亡，2只于造模后第2 d死亡。與正常組比較，STZ誘導(dǎo)的模型組大鼠的血糖和血清GH的含量顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05），提示STZ誘導(dǎo)的DM大鼠造模成功；造模成功后各實(shí)驗(yàn)組DM大鼠體質(zhì)量、血糖、血清GH值比較均未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 （表 1）

表1 實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體質(zhì)量、血糖、生長(zhǎng)激素值比較

表1 實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體質(zhì)量、血糖、生長(zhǎng)激素值比較

注：*與正常組比較，P＜0.05

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2.2 滋腎通竅飲對(duì)DM大鼠體質(zhì)量、血糖和血清生長(zhǎng)激素的影響

與模型組比較，滋腎通竅飲高和低劑量組對(duì)DM大鼠的體質(zhì)量具有升高的趨勢(shì)，但滋腎通竅飲高、低劑量與模型組組間體質(zhì)量值相比均未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。此外，滋腎通竅飲高和低劑量組對(duì)DM大鼠的血糖具有降低的趨勢(shì)，但滋腎通竅飲高、低劑量與模型組組間血糖值相比均未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。滋腎通竅飲高和低劑量組治療后DM大鼠的血清GH分別與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示滋腎通竅飲具有抑制STZ誘導(dǎo)DM大鼠的血清GH升高作用。導(dǎo)升明陽(yáng)性對(duì)照組治療后血糖和血清GH與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)意義 (P＜0.05)，提示導(dǎo)升明陽(yáng)性對(duì)照組可抑制STZ誘導(dǎo)的血糖和GH升高作用。（表2）

表2 滋腎通竅飲對(duì)DM大鼠體重、血糖和血清生長(zhǎng)激素的影響（s）

表2 滋腎通竅飲對(duì)DM大鼠體重、血糖和血清生長(zhǎng)激素的影響（s）

注：* 與正常組比較，P＜0.05；# 與模型組比較，P＜0.05

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2.3 滋腎通竅飲對(duì)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜厚度變化情況

正常組為連續(xù)的電子密度均勻的膜性結(jié)構(gòu)，環(huán)繞內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞，基底膜清楚，連續(xù)完整。模型組電子密度不均勻，節(jié)段性結(jié)節(jié)樣增厚。導(dǎo)升明組電子密度不均勻，連續(xù)彎曲增厚。滋腎通竅飲低劑量組電子密度不均勻，結(jié)構(gòu)模糊，連續(xù)彎曲增厚。滋腎通竅飲高劑量組電子密度較均勻，結(jié)構(gòu)清晰，增厚不明顯（圖1）。以上結(jié)果提示滋腎通竅飲可顯著改善視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜厚度的作用。

3 討論

非增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病性視網(wǎng)膜病變的早期階段，多數(shù)DM者特別是合并有DR的患者其血清GH水平一般較高[10-11]。血清GH能促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，能增強(qiáng)葡萄糖甙轉(zhuǎn)移酶和半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶的活性，因而促進(jìn)糖蛋白的合成，這些糖蛋白可沉積在毛細(xì)血管壁基底膜上，使基底膜不斷增厚，進(jìn)而促使糖尿病微血管病變的發(fā)生與發(fā)展[12]。研究證實(shí)，STZ誘導(dǎo)的DM大鼠的視網(wǎng)膜病變主要表現(xiàn)為外膜細(xì)胞損失，血-視網(wǎng)膜屏障損壞，毛細(xì)血管基底膜增厚，電子密度不均勻[9,13]。成模大鼠平均血糖值(21.47±1.99)mmol/L，DM 大鼠血清 GH 值（4.02±0.48）ug/L，成模大鼠與正常組大鼠的血糖值、血清GH值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。模型組DM大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜電子密度不均勻，節(jié)段性結(jié)節(jié)樣增厚（圖1）。本研究也證實(shí)了糖尿病大鼠的血清GH水平比正常大鼠增高；毛細(xì)血管基底膜增厚，電子密度不均勻。治療后，導(dǎo)升明組、滋腎通竅飲低劑量組及滋腎通竅飲高劑量組血清GH值比模型組低，而且中藥高劑量組血清GH值為最低 （表2）。分別與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示滋腎通竅飲具有改善STZ誘導(dǎo)DM大鼠的血清GH升高的作用。滋腎通竅飲低劑量組電子密度不均勻、結(jié)構(gòu)稍模糊、連續(xù)彎曲增厚；滋腎通竅飲高劑量組電子密度較均勻，結(jié)構(gòu)清晰，增厚不明顯；滋腎通竅飲低劑量組、導(dǎo)升明組、滋腎通竅飲高劑量組對(duì)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的病理?yè)p害保護(hù)作用逐漸增強(qiáng)，主要體現(xiàn)在基底膜增厚的差異，這提示滋腎通竅飲可抑制視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜增厚，對(duì)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管起到保護(hù)作用，尤其是滋腎通竅飲高劑量組療效更佳，優(yōu)于低劑量組表明本方的治療效果與藥物的劑量有關(guān)（圖1）。

圖1 滋腎通竅飲對(duì)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜厚度變化的影響 （電鏡，×10K）。1A正常組；1B模型組；1C導(dǎo)升明組；1D滋腎通竅飲低劑量組；1E滋腎通竅飲高劑量組

糖尿病視網(wǎng)膜病變屬于瞳神疾病的范疇，在五輪學(xué)說(shuō)中瞳神屬水輪，內(nèi)應(yīng)于腎，肝腎同源，肝開(kāi)竅于目，肝受血而能視，“五臟六腑之精氣，皆稟受于脾，貫于目”“氣脫者，目不明”。DR屬慢性病，發(fā)生于糖尿病中后期，久病及腎，病久則肝氣不舒，肝郁乘脾，脾虛失運(yùn)，聚濕生痰，脾不統(tǒng)血，血溢脈外。近年來(lái)的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，DR的治療所選用的單味中藥以補(bǔ)益藥和活血化瘀藥為多，補(bǔ)益藥以滋補(bǔ)肝腎、益氣養(yǎng)陰為主[14]。滋腎通竅飲以山萸肉、菟絲子、桑椹子、枸杞子、女貞子、石斛滋補(bǔ)肝腎生精血；黃芪、太子參、云茯苓等益氣養(yǎng)陰，健脾滲濕；旱蓮草、澤蘭、田七、丹參等活血止血；柴胡、香附、石菖蒲，疏肝通竅；升麻、葛根輕清上目，引藥上行。而且本方中所選的菟絲子、女貞子、葛根等有效成分有水飛薊賓、槲皮素、黃芩甙、柚皮素等具有抑制醛糖還原酶作用，而前兩者均含有中藥黃酮類成分，有抑制蛋白非酶糖化作用，有抑制GH作用[15-19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示滋腎通竅飲有改善STZ誘導(dǎo)DM大鼠的血清GH升高的作用，抑制視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜增厚。滋腎通竅飲對(duì)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管起到保護(hù)作用機(jī)理可能是通過(guò)降低DM大鼠的血清GH水平，抑制視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜增厚，實(shí)現(xiàn)對(duì)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管起到保護(hù)作用。