液基細胞學檢測聯(lián)合P16/Ki67蛋白、血清SCCA和CA125檢測對宮頸癌早期篩查的診斷價值

任瑩 叢玲華 何喻 方來福

[摘要] 目的 探討液基細胞學檢測聯(lián)合P16/Ki67蛋白表達以及血清SCCA和CA125的水平在宮頸癌早期診斷中的價值。 方法 患者宮頸脫落細胞采用液基細胞學檢測和P16/Ki67單克隆抗體CINtec PLUS雙染法檢測P16/Ki67蛋白，放射免疫法檢測患者血清SCCA和CA125水平，依據(jù)液基細胞學和病理活檢結(jié)果進行分組，應用ROC曲線分析液基細胞學檢測和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS雙染法對宮頸癌的早期診斷價值，同時比較分析血清SCCA和CA125的水平在宮頸癌早期診斷中的價值。 結(jié)果 非典型的鱗狀細胞異常ASC-US中病理學CIN1的所占比例較高，差異具有顯著性（P<0.05）。液基細胞學檢測結(jié)果非典型的鱗狀細胞異常各分型和病理學結(jié)果有差異（P<0.05），液基細胞學結(jié)果分類ASC-US和ASC-H與病理結(jié)果有一致性。鱗狀上皮病變各分型和病理學結(jié)果有差異（P<0.05），液基細胞學結(jié)果分類LSIL和HSIL和病理結(jié)果也有一致性。液基細胞學檢測和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS雙染法具有一致性，但CINtec PLUS雙染法靈敏度和特異度均高于液基細胞學檢測。兩法的平行并聯(lián)試驗與金標準的一致性較好，靈敏度和約登指數(shù)較兩者單獨試驗要高，串聯(lián)可提高特異度。SCCA和CA125的單獨或聯(lián)合敏感度和特異度均低于液基細胞學檢測和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS雙染法。 結(jié)論 P16/Ki67蛋白檢測和官頸液基細胞學檢查聯(lián)合具有更高的靈敏度，在宮頸癌早期臨床篩查工作中具有臨床應用價值。

[關鍵詞] 液基細胞學;宮頸癌;P16/Ki67;SCCA;CA125

[中圖分類號] R737.33? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）36-0120-05

Diagnostic value of liquid-based cytology combined with P16/Ki67 protein and serum SCCA and CA125 in early screening for cervical cancer

REN Ying? ?CONG Linghua? ?HE Yu? ?FANG Laifu

Department of Pathology， Ningbo Yinzhou People's Hospital， Ningbo? ?315040， China

[Abstract] Objective To investigate the value of liquid-based cytology combined with P16/Ki67 protein expression and serum SCCA and CA125 levels in early diagnosis of cervical cancer. Methods Cervical exfoliated cells were detected by liquid-based cytology. P16/Ki67 protein was detected by P16/Ki67 monoclonal antibody CINtec PLUS double staining method. The serum levels of SCCA and CA125 were detected by radioimmunoassay. And the patients were grouped according to liquid-based cytology and pathological biopsy. The ROC curve was used to analyze the early diagnosis value of liquid-based cytology and P16/Ki67 protein CINtec PLUS double staining method in the early diagnosis of cervical cancer. At the same time， the early diagnosis value of serum SCCA and CA125 levels in cervical cancer was compared. Results The proportion of pathological CIN1 in atypical squamous cell abnormalities ASC-US was significantly higher， and the difference was significant（P<0.05）. The results of liquid-based cytology showed that there were differences in the classification and pathological results of atypical squamous cell abnormalities（P<0.05）. The results of liquid-based cytology ASC-US and ASC-H were consistent with pathological results. The classification and pathological results of squamous epithelial lesions were different（P<0.05）， and the results of liquid-based cytology classification LSIL and HSIL were consistent with pathological results. The liquid-based cytology test was consistent with the P16/Ki67 protein CINtec PLUS double staining method， but the sensitivity and specificity of the CINtec PLUS double staining method were higher than those of the liquid-based cytology. The parallel test of the two methods was in good agreement with the gold standard， and the sensitivity and the Yoden index were higher than the two separate tests. The series connection could improve the specificity. The sensitivity or specificity of SCCA and CA125 alone or in combination was lower than that of liquid-based cytology and P16/Ki67 protein CINtec PLUS double staining. Conclusion The combination of P16/Ki67 protein detection and cervical liquid-based cytology has higher sensitivity and has clinical value in early clinical screening of cervical cancer.

[Key words] Liquid-based cytology; Cervical cancer; P16/Ki67; SCCA; CA125

在全球?qū)m頸癌仍然是威脅女性健康的惡性腫瘤，在腫瘤發(fā)病排序中占第2位，死亡率占第3位，發(fā)展中國家其發(fā)病率居第1位。2012年新報告宮頸癌約527 600例，死亡265 700例，占女性新發(fā)癌癥病例的15%[1]。日本學者報道妊娠中最常見的惡性腫瘤依次為宮頸癌、乳腺癌和卵巢癌[2]。目前低收入和中等收入國家的宮頸癌死亡率仍然很高，早期篩查、宮頸癌了解以及疾病風險知識的了解非常重要[3]。宮頸癌的微創(chuàng)根治性子宮切除術與IA2期或IB1期宮頸癌開放手術相比，總體生存期更短[4]。為進一步提高宮頸癌早期診斷，獲得更好的臨床治療效果和生存時間，尋求宮頸癌發(fā)生發(fā)展中早期敏感指標，對于阻斷早期宮頸癌癌前病變的發(fā)展、減少宮頸癌繼續(xù)發(fā)展十分必要?；诖吮狙芯恐荚趹靡夯毎麑W檢測（Liquid-based cytology，LBC）聯(lián)合P16/Ki67蛋白分析對早期宮頸癌的診斷價值，探討LBC檢測聯(lián)合P16/Ki67蛋白以及血清腫瘤標記物的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料

收集寧波市鄞州人民醫(yī)院2015年1月～2018年12月300例患者行宮頸病理學活檢標本，滿足納入標準：年齡大于25歲以上的女性;如姓名、年齡和病史等信息完整;同時有宮頸活檢結(jié)果又有有效宮頸脫落細胞，并附有一份完整的臨床病理數(shù)據(jù)。排除孕婦、產(chǎn)婦及哺乳期婦女、樣本不全、標本信息不全和不符合年齡要求者。患者平均年齡（54.15±15.41）歲，根據(jù)病理學檢查結(jié)果，分析LBC標本結(jié)果和病理檢查的一致性，總計300例，按組織病理學分級分為：慢性宮頸炎139例、CIN1 71例、CIN2 34例，CIN3 13例、宮頸癌43例。接受術前化療或放療排除在本研究之外。本研究試驗程序或研究方案經(jīng)寧波市鄞州人民醫(yī)院倫理學委員會批準，獲得知情同意并簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

液基細胞制片染色系統(tǒng)（Liquid-based Cytology Test，LBCT）為廣州安必平醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)。P16/Ki67蛋白CINtec PLUS雙染法試劑盒購自英國abcam公司。SCCA和CA125采用美國全自動生化儀進行檢測。

1.3 方法

1.3.1 液基細胞學標本采集和處理? 患者取膀胱截石位，陰道窺器充分暴露宮頸，醫(yī)生將細胞刷放入宮頸口，在宮頸癌好發(fā)部位即子宮頸移行帶順時針旋轉(zhuǎn)360°，刮取子宮頸細胞，將宮頸刷放入以甲醇為主要成分的細胞保存液中刷洗，收集宮頸脫落細胞在保存液中。細胞標本瓶進行標本核對、編號后，應用廣州安必平醫(yī)藥科技有限公司的LBCT 進行自動化移液及梯度離心，細胞沉降，制成一個直徑 1.3 cm 的細胞薄層，自動染色，染色方法為巴氏染色。依據(jù)子宮頸細胞學 Bethesda 報告系統(tǒng)發(fā)報告，先進行標本質(zhì)量評估，然后判讀。

1.3.2 免疫組織化學染色及結(jié)果判斷標準? 應用免疫組化高敏感的P16/Ki67蛋白CINtec PLUS雙染法試劑盒說明書進行操作，顯示P16INK4棕色染色定位在細胞漿中，顯示Ki67紅色染色定位在細胞核內(nèi)。根據(jù)宮頸Bethesda診斷報告系統(tǒng)指南2009年版或TBS來評估樣本的充分性。結(jié)果判讀：陽性：一個或多個宮頸上皮細胞在同一細胞中同時存在特異性棕色和紅色染色。陰性：無宮頸上皮細胞出現(xiàn)特異性棕色和紅色染色，或存在僅對一種而非兩種標記物有免疫染色，或存在對兩種標記物有反應性的宮頸上皮細胞，但兩種染色不是在同一細胞內(nèi)。

1.3.3血清學SCCA和CA125檢測? 入院患者清晨空腹抽取靜脈血4 mL，置凝膠促凝管管內(nèi)以3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心7 min后分離血清，采用放射免疫法檢測血清CA125和SCCA。結(jié)果判定標準：SCCA>2.5 ng/mL、CA125>35 U/mL為陽性。

1.3.4 ROC曲線分析? 根據(jù)病理檢查結(jié)果結(jié)合臨床資料，分為陰性組和陽性組，LBC和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS雙染法采用靈敏度為縱坐標，假陽性率（1-特異度）橫坐標繪制ROC曲線并計算曲線下面積。SCCA和CA125分別判斷對早期宮頸癌特異性和敏感性。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以百分比（%）表示，采用χ2檢驗。應用ROC曲線分析特異性和敏感性。檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 LBC后行病理活檢的患者結(jié)果

在對LBC結(jié)果和病理活檢結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，非典型的鱗狀細胞異常中ASC-US中病理學結(jié)果CIN1的所占比例較高，差異具有顯著性（P<0.05）。鱗狀上皮病變LSIL中病理學結(jié)果CIN2、CIN3以及癌雖然無顯著性差異，仍占有少量的比例。見表1。

2.2 LBCT結(jié)果對早期宮頸癌的診斷價值

LBC結(jié)果提示非典型的鱗狀細胞異常各分型和病理學結(jié)果有差異（P<0.05），LBC結(jié)果分類ASC-US和ASC-H與病理結(jié)果有一致性。鱗狀上皮病變各分型和病理學結(jié)果有差異（P<0.05），LBC結(jié)果分類LSIL和HSIL與病理結(jié)果也有一致性。見表2。

2.3 LBC和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS雙染法分析比較

LBC和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS雙染法和病理學結(jié)果比較，CINtec PLUS雙染法結(jié)果一致性非常好，LBC法一致性較好。CINtec PLUS雙染法靈敏度和特異度均高于LBC檢測，見表3。LBC和CINtec PLUS雙染法一致性較好（Kappa=0.550，P>0.05）。見表4。

Kappa≥0.75兩者一致性非常好;0.75>Kappa≥0.4兩者一致性較好;Kappa<0.4兩者一致性較差。

通過平行試驗（并聯(lián)）（該法提高靈敏度，但有可能降低特異度）：即只要有一個試驗結(jié)果陽性，即可判讀為陽性。兩者試驗結(jié)果均為陰性，才可判讀為陰性。系列試驗（串聯(lián)）（提高特異度，但有可能降低靈敏度）：只要有一個試驗結(jié)果為陰性，即可判讀為陰性。兩者試驗結(jié)果均為陽性，才可判讀為陽性。CINtec PLUS雙染法和宮頸LBCT作為宮頸癌及癌前病變的篩查試驗，其主要的胎床作用是提高診斷的靈敏度。根據(jù)以上數(shù)據(jù)顯示，兩者的平行并聯(lián)試驗的Kappa值大于0.4，其與金標準的一致性較好，且其靈敏度和約登指數(shù)均較兩者單獨試驗要高，認為其對臨床篩查宮頸癌及癌前病變具有實際應用價值。見表5。

2.4 LBC、P16/Ki67蛋白CINtec PLUS雙染法以及SCCA和CA125對早期宮頸癌診斷的價值比較

CINtec PLUS雙染法早期宮頸癌診斷的敏感性比較好，兩者并聯(lián)聯(lián)合試驗的靈敏度提高，但特異度降低，而兩者的串聯(lián)可提高特異度。SCCA和CA125的單獨或聯(lián)合敏感度和特異度均低于LBCT和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS雙染法。見表6和封三圖7。

3討論

高危人乳頭瘤病毒（HR-HPV）的檢測在宮頸癌高危人群的篩查中發(fā)揮很重要的作用，研究報道LBC中非典型腺細胞如低腫瘤細胞性和低級柱狀形態(tài)的細胞和組織學的腺癌有很大關聯(lián)，并且73%的腺癌HR-HPV陽性，HPV檢測結(jié)果陰性的偶發(fā)病例仍值得關注[5]。P16（基因位點：9p21）腫瘤抑制基因被認為是各種惡性腫瘤和癌前病變進展和預后的重要生物標志物，包括高危HR-HPV介導的鱗狀上皮內(nèi)病變（SILs）、基于細胞學和相應的宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）。P16作為細胞周期蛋白依賴性激酶-4抑制劑，負調(diào)節(jié)細胞周期，在持續(xù)性HPV感染中，E7致癌蛋白結(jié)合視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白導致其蛋白水解轉(zhuǎn)化，也引發(fā)E2F解離，其增加DNA轉(zhuǎn)錄并進展至S期，促進異常的P16過表達，LBC LSIL/HSIL病例與P16過表達高度相關，同時能反映更高的CIN診斷[6]。本觀察通過LBC和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS雙染法聯(lián)合比較對早期宮頸癌的價值，P16/Ki67蛋白檢測和宮頸LBC聯(lián)合具有更高的靈敏度。

回顧性分析300 800個宮頸癌和癌前病變（CIN3/AIS）在獲得明確診斷之前的篩查歷史評估成像LBC和HPV測試提示，LBC發(fā)現(xiàn)更多女性隨后被診斷出患有宮頸癌和CIN3/AIS，而不是HPV檢測[7]。并且LBC在鱗狀細胞癌的復發(fā)診斷后治療的檢測上優(yōu)于傳統(tǒng)的細胞學，其靈敏度、特異性和準確性遠高于傳統(tǒng)方法[8]。本觀察發(fā)現(xiàn)LBC提示非典型的鱗狀細胞異常ASC-US類型中病理學結(jié)果CIN1的所占比例較高，各分型和病理學結(jié)果有差異，LBC分類ASC-US和ASC-H與病理結(jié)果有一致性。鱗狀上皮病變各分型和病理學結(jié)果有差異，LBC分類LSIL和HSIL和病理結(jié)果有一致性。另外關于P16表達在ASC-US、LSIL、HSIL和SCC報道的陽性率分別為21.1%、39.0%、67.7%和85.4%[9]，宮頸癌普查中發(fā)現(xiàn)，使用活組織檢查作為金標準，P16/Ki67蛋白CINtec PLUS雙染法和LBC顯示相似的敏感性，但特異性較高[10]，本觀察LBC和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS雙染法具有一致性，但CINtec PLUS雙染法靈敏度和特異度均高于LBC，和上述文獻報道結(jié)果一致，在癌前病變和惡性宮頸病變中檢測到緊密連接蛋白claudin-1（CLDN1）的表達增加，近來有學者通過組織學為對照，平行P16/Ki67和CLDN1/Ki67雙染色細胞學的比較發(fā)現(xiàn)兩者在LBC樣品和組織切片上證明靈敏度和特異性相似[11]。故以后的宮頸癌高危篩查中可能高HR-HPV檢測的同時，引入LBC聯(lián)合P16/Ki67雙染有比較好的臨床實用價值。

基于上述的結(jié)果，本觀察通過兩法的平行并聯(lián)試驗與金標準的一致性較好，且其靈敏度和約登指數(shù)較兩者單獨試驗要高，兩者的串聯(lián)可提高特異度。故在臨床中應該結(jié)合應用，提高早期宮頸癌的篩查效果，本觀察同時比較婦科腫瘤臨床普遍應用的血清SCCA和CA125的臨床診斷價值，提示單獨或聯(lián)合敏感度和特異度均低于LBC和P16/Ki67蛋白CINtec PLUS雙染法。Papanicolau（Pap）試驗是用于早期檢測宮頸上皮發(fā)育不良病變的常規(guī)細胞學方法，后來發(fā)現(xiàn)P16和Ki67生物標志物作為診斷HR-HPV相關發(fā)育異常的輔助工具，以通過額外的比色特征補充細胞的形態(tài)特征[12]，發(fā)現(xiàn)無病變或輕微異常的HPV 16/18陽性婦女進展為HSIL/CIN2+的風險很高[13]。這表明臨床上要在LBC聯(lián)合P16/Ki67雙染的必要性和早期診斷中的價值。后來應用新的液相色譜-質(zhì)譜技術檢測HSIL相關代謝物與有HPV感染和無HPV感染的女性宮頸病變進行比較，發(fā)現(xiàn)HSIL的形成似乎影響神經(jīng)酰胺合成酶途徑，改變細胞調(diào)節(jié)和增加細胞鞘氨醇堿濃度（如二甲基二氫鞘氨醇）[14]。

綜上所述，隨著生物學技術的發(fā)展，關于標志性的生物學標記物是否改變細胞的生物學行為成為關鍵點。尋求有效的標記物可以提供新的分類診斷模型，可以更好地闡明和區(qū)分疾病表型而不是其基因型。相信在尋找宮頸癌診斷生物標志物時，已經(jīng)從宮頸組織、腫瘤組織和宮頸細胞學中進行了蛋白質(zhì)組學含量的研究[15]、使用尿液[16，17]或血漿和血清樣品的階段[18-20]。經(jīng)過適當?shù)姆椒炞C和優(yōu)化，專注于已知的預測標記，實現(xiàn)快速自動化以便更好地應用于臨床服務顯得更為重要。

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（收稿日期：2019-04-17）