“發(fā)汗”與非“發(fā)汗”丹參中10種活性成分含量測定及其質(zhì)量的主成分分析

王 婷，于 凡，李國轉(zhuǎn)，邱 鎮(zhèn)，陳衛(wèi)東 ，彭代銀，俞年軍，王國凱

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230012；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥物代謝研究所,安徽 合肥 230012)

丹參又稱赤參、紅根、紫丹參，為唇形科植物丹參SalviaMiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩等功效[1]?！鞍l(fā)汗”是一種常見的中藥材產(chǎn)地初加工技術(shù)，即將新鮮藥材堆積起來，把水分散發(fā)到藥材表面[2]?！鞍l(fā)汗”不僅有利于藥材的干燥，還可調(diào)節(jié)組織細(xì)胞中酶系統(tǒng)和微生物群落的活性[3]，對藥材品質(zhì)的形成有一定影響。丹參“發(fā)汗”后，藥材條直，表面呈暗棕色，斷面變紫[4]，被認(rèn)為是質(zhì)量上乘的表現(xiàn)。目前，四川中江一直沿用“發(fā)汗”的加工方法[5-6]，其他各產(chǎn)地常常忽略“發(fā)汗”環(huán)節(jié)，而市售丹參品質(zhì)不一，與產(chǎn)地加工工藝密切相關(guān)[7]。本研究使用高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography, HPLC)測定“發(fā)汗”與非“發(fā)汗”兩種加工方法對丹參中10種成分含量的影響，為丹參產(chǎn)地加工方法的選擇提供依據(jù)。

1 儀器與材料

LC-16C高效液相色譜儀、SPD型紫外檢測器：日本島津公司；AB135-S型十萬分之一電子天平：德國Mettler Toledo公司；AS20500BDT超聲波清洗機(jī)：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；HC-1000Y多功能粉碎機(jī)：浙江省永康市諾邦富貿(mào)易有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司。

“發(fā)汗”丹參、非“發(fā)汗”丹參均為安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥物代謝動力學(xué)研究室自制；丹參素(批號1108755-201210)、原兒茶酸(批號110809-201205)、原兒茶醛(批號110810-200506)、迷迭香酸(批號111871-201404)、異阿魏酸(批號111698-201103)、咖啡酸(批號110885-200102)、丹酚酸B(批號11156-201111)、丹參酮ⅡA(批號110766-200619)、隱丹參酮(批號110852-200806)、丹參酮Ⅰ(批號110867-200406)均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純；其余試劑為分析純。

丹參(鮮品)樣品是由安徽春之蔚農(nóng)業(yè)科技有限公司規(guī)范化生產(chǎn)基地提供的1年生栽培丹參。原植物及藥材經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)生藥系俞年軍教授鑒定為鼠尾科丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)。取同一批次鮮品丹參置于空曠場地攤開，使其自然失水(過程中避免積壓，防止產(chǎn)熱)，去泥，去除蘆頭，選擇粗細(xì)均勻的藥材隨機(jī)分為兩組進(jìn)行“發(fā)汗”與非“發(fā)汗”處理。參照LIANG等[8]“發(fā)汗”制備方法：將新鮮的丹參根(約250 kg)堆積7 d以使其根條內(nèi)部水分外溢，丹參堆中預(yù)留稀松間隙用以通風(fēng)，外周稍作覆蓋，定時將覆蓋物掀開，期間每隔2 d將丹參堆攤開晾一夜，重新堆積成堆，使丹參堆“發(fā)汗”均勻，當(dāng)?shù)⒏膬?nèi)部斷面變?yōu)樽霞t色時，攤開，置于潔凈陰涼干燥通風(fēng)處晾干。非“發(fā)汗”丹參通過常規(guī)處理方法進(jìn)行，即將新鮮的丹參根(約250 kg)置于背陰干燥潔凈通風(fēng)的地方陰干。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取適量的原兒茶酸、原兒茶醛、異阿魏酸、迷迭香酸、咖啡酸、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA對照品，加入甲醇配制成對照品儲備液；精密吸取各成分儲備液于同一容量瓶中，稀釋定容，得到各成分質(zhì)量濃度分別為80、40、22、40、35、100、100、50、40、40 μg/mL。

2.2 供試品溶液的制備 參照2015版《中華人民共和國藥典》[1]取干燥的“發(fā)汗”與非“發(fā)汗”丹參進(jìn)行打粉，保存在密封袋中儲存?zhèn)溆?。精密稱定“發(fā)汗”與非“發(fā)汗”丹參粉末各1.0 g，放入具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇25.0 mL，密塞，稱質(zhì)量，超聲(功率140 W，頻率42 kHz)40 min，稱質(zhì)量并用90%甲醇補足減失質(zhì)量，收集上清液，再在錐形瓶中精密加入純水25.0 mL，超聲40 min，收集上清液，合并2次提取液，過濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.3 HPLC測定條件 色譜分析條件：COSMIL C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.05%磷酸(B)；梯度洗脫(0～7 min，10% A；7～15 min，10%～20% A；15～35 min，20%～25% A；35～55 min，25%～60% A；55～85 min，60%～80% A；85～87 min，80%～10% A)；流速：1.0 mL/min；檢測波長280 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。色譜圖見圖1。

注：1.丹參素；2.原兒茶酸；3.原兒茶醛；4.咖啡酸；5.異阿魏酸；6.迷迭香酸；7.丹酚酸B；8.隱丹參酮；9.丹參酮Ⅰ；10.丹參酮ⅡA

圖1 “發(fā)汗”丹參(A)、非“發(fā)汗”丹參(B)以及混合對照品(C)的HPLC圖

2.4 線性試驗及方法學(xué)考察

2.4.1 單體類成分線性關(guān)系考察 按“2.1”項下操作方法，精密量取一定容積的10個化合物的混合對照品儲備液，加甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為丹參素160 μg/mL、原兒茶酸1.28 μg/mL、原兒茶醛0.64 μg/mL、咖啡酸16 μg/mL、異阿魏酸16 μg/mL、迷迭香酸160 μg/mL、丹酚酸B 1 024 μg/mL、隱丹參酮128 μg/mL、丹參酮I 64 μg/mL、丹參酮ⅡA 128 μg/mL的混合對照品溶液，用甲醇進(jìn)行逐級稀釋，得到一系列不同濃度的混合對照品溶液，按“2.3”項下的色譜參數(shù)進(jìn)樣測定，記錄各色譜峰峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程，見表1。

表1 回歸方程及線性范圍

2.4.2 精密度試驗 按“2.3”項下色譜條件，分別取20 μL的對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，結(jié)果見表2，得到10種標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的RSD≤2.74%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 在同一“發(fā)汗”樣品粉末中取6份，每份精密稱定1.0 g，按“2.2”項下制備供試品，平行進(jìn)樣，記錄色譜圖，并計算10種活性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD≤2.94%，表明該方法重復(fù)性良好。見表2。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取上述“發(fā)汗”丹參供試品溶液，分別在室溫放置0、8、16、24、48 h時進(jìn)樣，記錄色譜圖，各成分峰面積的RSD≤2.42%，說明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。見表2。

2.4.5 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品溶液6份，分別加入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液200 μL，制備供試液，按“2.3”項下色譜條件測定，得到各成分的平均回收率≤107.40%，RSD≤2.77%，說明該方法回收率較好。見表2。

表2 方法學(xué)考察結(jié)果(n=6)

2.5 樣品含量測定 從“發(fā)汗”與非“發(fā)汗”兩組丹參樣品中各組隨機(jī)選取6批，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜方法進(jìn)行測定，記錄各化合物峰面積，將所得峰面積代入回歸方程中，計算“發(fā)汗”與非“發(fā)汗”丹參藥材樣品中10種成分含量，并采用兩個獨立樣本t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果見表3，將得到的數(shù)據(jù)作圖，得到的直觀顯示圖見圖2。

表3 “發(fā)汗”與非“發(fā)汗”丹參10種活性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

注：與非“發(fā)汗”丹參比較，*P<0.05

注：與非“發(fā)汗”丹參比較，*P<0.05

2.6 主成分分析 為綜合評價“發(fā)汗”與非“發(fā)汗”兩種加工方法對丹參效應(yīng)成分的影響，隨機(jī)選取“發(fā)汗”與非“發(fā)汗”丹參各6批，以丹參中10種活性成分峰面積為分析指標(biāo)，采用SPSS 23.0數(shù)據(jù)處理軟件，對其進(jìn)行主成分分析。結(jié)果顯示，前兩個主成分的特征值均大于1，而且前兩個特征值之和占總特征值的90.618%，因此，提取前兩個因子進(jìn)行主成分分析，能夠客觀反映兩種加工方法丹參的內(nèi)在質(zhì)量。見表4。

由因子載荷矩陣可以看出，丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹參酮ⅡA在第1個因子上載荷較大，是對第一主成分影響大的特征向量，原兒茶酸在第2個因子上載荷較大(見表5)，說明第一主成分包含丹參質(zhì)量效應(yīng)成分的大部分信息。

表4 主成分的特征值及貢獻(xiàn)率

表5 旋轉(zhuǎn)后的成分矩陣

采用上述得到的兩個主成分對丹參兩種加工方法進(jìn)行評價，以各主成分因子得分與方差貢獻(xiàn)率乘積之和相加，得到丹參兩種加工方法的各類成分的總因子得分值F[9],F=0.766 42F1+0.139 75F2，得到6批“發(fā)汗”丹參的綜合評分的平均值 大于6批非“發(fā)汗”的綜合評分平均值，可初步確定“發(fā)汗”丹參質(zhì)量優(yōu)于非“發(fā)汗”丹參。以12批丹參效應(yīng)成分為峰面積進(jìn)行主成分分析，可以很好地將“發(fā)汗”與非“發(fā)汗”丹參進(jìn)行區(qū)分。見圖3。

圖3 “發(fā)汗”與非“發(fā)汗”丹參10種活性成分主成分分析圖

3 討論

本研究以HPLC同時測定了“發(fā)汗”與非“發(fā)汗”兩種加工方法丹參藥材中7種水溶性酚酸類成分和3種脂溶性酮類成分含量，而2015版《中華人民共和國藥典》中采取了兩種測定方法分別測定丹參酮類(隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA)和丹酚酸B成分的含量，相比較而言，本研究中的方法增加了對丹參素等有效成分的測定且能同時檢測酮類和酚酸類成分，方法穩(wěn)定，結(jié)果可靠，可用于后續(xù)相關(guān)研究中丹參多指標(biāo)成分的測定。

丹參作為廣泛應(yīng)用的大宗藥材，其質(zhì)量直接影響著臨床用藥的有效性和安全性，丹參藥材質(zhì)量的優(yōu)劣與產(chǎn)地加工工藝密切相關(guān)，含量測定結(jié)果表明，“發(fā)汗”與非“發(fā)汗”丹參差異較大。經(jīng)“發(fā)汗”處理后，水溶性成分含量明顯升高，研究[3,10]表明，藥材在“發(fā)汗”過程中自行產(chǎn)熱，溫度上升，為細(xì)胞中酶的活動創(chuàng)造有利條件，促進(jìn)酚酸類成分的生成；本研究中隱丹參酮和丹參酮Ⅰ含量略有下降，丹參酮ⅡA含量上升，與袁瑤等[11]研究結(jié)果一致，可能是因為在相關(guān)活性酶如脫氫酶的作用下，顏色較淺的隱丹參酮等成分轉(zhuǎn)化成顏色較深的丹參酮ⅡA[4,12]，此現(xiàn)象與“發(fā)汗”后藥材斷面顏色變深相一致。

主成分分析是將多個具有一定相關(guān)性的變量通過變換以選出互相無關(guān)聯(lián)的幾個綜合變量的一種方法[13]，便于直觀觀測各變量間的關(guān)系。主成分分析結(jié)果表明，丹參“發(fā)汗”樣品綜合評分更高，綜合質(zhì)量更好，且“發(fā)汗”丹參與非“發(fā)汗”丹參能很好地區(qū)分。今后應(yīng)進(jìn)一步規(guī)范丹參的產(chǎn)地加工方法，以保證臨床療效。