獨(dú)活藥材香豆素類成分的高效液相色譜指紋圖譜研究

王 斌，周 安，楊 沫，劉先華，韓燕全

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗中心，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，安徽 合肥 230038；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

獨(dú)活始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品?！爸黠L(fēng)寒所擊，金瘡止痛，奔豚癇痙,女子疝瘕，久服輕身耐老?！睂ζ渲参飦碓?，歷代本草諸說不一[1]。現(xiàn)在所用品種也依地區(qū)不同而差異很大。《中藥大辭典》共收載了13種之多，直到1959年的《中藥志》[2]根據(jù)實(shí)際調(diào)查才逐步理清，獨(dú)活來源于2科多種植物，主要為川獨(dú)活類型(來源于當(dāng)歸屬植物重齒毛當(dāng)歸AngelicapubescensMaxim. f.biserrataShan et Yuan)，香獨(dú)活類型(來源于當(dāng)歸屬毛當(dāng)歸A.pubescensMaxim.)，牛尾獨(dú)活類型(來源于獨(dú)活屬Heracleum植物)及九眼獨(dú)活類型(來源于五加科植物AraliacordataThunb.)?！吨腥A人民共和國藥典》規(guī)定獨(dú)活正品為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸的干燥根，臨床上主要用于風(fēng)寒濕痹、腰膝疼痛、少陰伏風(fēng)頭痛等癥?，F(xiàn)代植物化學(xué)提取分離研究已經(jīng)證實(shí)，獨(dú)活中主要含有傘形花內(nèi)脂、二氫歐山芹醇乙酸酯、蛇床子素、二氫歐山芹素等數(shù)十種香豆素類化合物[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，獨(dú)活有抗炎、抗腫瘤、抗菌等作用[1，3]。

羌活藥材因外觀與獨(dú)活藥材相似，市場上常將羌活與獨(dú)活藥材混用。因此，為了保障藥材質(zhì)量，對獨(dú)活藥材的質(zhì)量控制顯得尤為重要。然而，目前對獨(dú)活藥材的質(zhì)量控制主要集中于藥材中幾種主要成分的含量測定。如2010年版《中華人民共和國藥典》一部[4]以蛇床子素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯作為獨(dú)活藥材含量檢測指標(biāo)控制藥材質(zhì)量。然而，含有數(shù)十種藥理活性成分的藥材僅通過幾個指標(biāo)成分的含量測定尚不能全面評價藥材質(zhì)量的優(yōu)劣。鑒于此，筆者在前期研究[3，5]基礎(chǔ)上，收集了包括GAP種植基地在內(nèi)的不同產(chǎn)地的15批獨(dú)活藥材，建立了獨(dú)活藥材香豆素類成分高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)指紋圖譜，并對指紋圖譜中15個共有峰進(jìn)行指認(rèn)與推斷，首次從定性角度深入分析獨(dú)活藥材，通過數(shù)據(jù)化處理并結(jié)合相似度評價、模糊聚類分析等方法從整體角度進(jìn)一步評價，以期能為全面控制該藥材的質(zhì)量提供實(shí)驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260型HPLC(包括在線脫氣機(jī)、二元泵、恒溫自動進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測器)：美國安捷倫公司；Finnigan Surveyor-LCQ XL二維線性離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀，質(zhì)譜(Mass,MSn)配有電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)；高效液相色譜儀：美國Thermo Finnigan公司；BP211D型十萬分之一電子天平：德國賽多利斯公司；HS10260D型超聲清洗器：天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.2 試藥 對照品蛇床子素(批號 110822-201308)和補(bǔ)骨脂素(批號 110739-201115)：中國食品藥品檢定研究院；對照品傘形花內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯、花椒毒素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯：天津士蘭科技有限公司。2批GAP種植基地獨(dú)活藥材于2014年6月采于湖北省五峰縣牛莊鄉(xiāng)，11批不同產(chǎn)地獨(dú)活藥材(產(chǎn)地：湖北省、四川省、甘肅省)由安徽省亳州市食品藥品檢驗所劉軍檢驗員收集，2批市售藥材購自北京同仁堂合肥藥店和立方大藥房合肥藥店。所購獨(dú)活藥材經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院孟楣主任藥師鑒定為重齒毛當(dāng)歸(AngelicapubescensMaxim. f.biserrataShan et Yuan)的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件 色譜柱為Hypersil ODS XB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以水為流動相A、以甲醇為流動相B進(jìn)行梯度洗脫。洗脫程序：0～10 min，30% B；15～17 min，42% B；20～30 min，52% B；35～45 min，60% B；50～60 min，65% B；65～70 min，70% B。流速為1.2 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為330 nm。采用ESI，噴霧電壓為4.0 kV；鞘氣為高純氮?dú)?，壓力流速?5個單位；碰撞氣體為高純氦氣；金屬毛細(xì)管溫度300 ℃；采用正離子方式檢測模式，掃描范圍從m/z80到m/z800，二級質(zhì)譜離子隔離寬度2(m/z)，碰撞裂解能量(collision-induce dissociation，CID)為35%。

2.2 對照品溶液的制備 稱取對照品傘形花內(nèi)酯、補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、蛇床子素和二氫歐山芹素，精密稱定，用甲醇-二氯甲烷(容積比為1∶1)溶解，制成質(zhì)量濃度分別為0.504、0.916、0.600、0.900、0.571、0.553 mg/mL的對照品儲備液，分別取上述標(biāo)準(zhǔn)品0.5 mL于10 mL容量瓶中，定容至10 mL，得混合對照溶液，進(jìn)樣前用0.45 μL微孔濾膜過濾。

2.3 供試品溶液的制備 稱取獨(dú)活藥材約20.0 g，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過180目篩。稱取獨(dú)活藥材粉末約2.0 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，用甲醇與二氯甲烷混合溶液(容積比為1∶1)超聲萃取3次，萃取容積依次為30、30、20 mL，每次30 min，濾過，合并提取液，旋干，用甲醇與二氯甲烷混合溶液(容積比為1∶1)溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容，進(jìn)樣前用0.45 μL微孔濾膜過濾。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 精密吸取S1號供試品溶液(甘肅-1)，按照“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄獨(dú)活HPLC圖譜。結(jié)果顯示，以蛇床子素峰為參比峰，15個共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.06%～0.31% 和0.28%～1.67%。將這6張色譜圖經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004年A版)評價，其相似度均大于0.995，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取S9號供試品溶液(湖北五峰-2)，采用“2.1”項下的色譜條件，分別在0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣，記錄獨(dú)活HPLC圖譜。結(jié)果顯示15個共有峰的相對保留時間和相對峰面積(參比峰為蛇床子素峰)的RSD分別為0.02%～0.63%和0.82%～2.29%，將這6張HPLC圖譜經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004年A版)評價，其相似度均大于0.994，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗 稱取S14號獨(dú)活供試品(四川-3)6份，每份約2.0 g，按標(biāo)準(zhǔn)方法制備供試品溶液，按上述優(yōu)化的色譜條件進(jìn)樣10 μL，記錄獨(dú)活的HPLC圖譜。結(jié)果表明，以蛇床子素峰為參比峰，15個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.03%～0.67%和0.62%～2.48%，表明該方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.4.4 獨(dú)活藥材特征峰解析 取15批不同產(chǎn)地的獨(dú)活藥材，按標(biāo)準(zhǔn)方法制備樣品溶液，并在上述優(yōu)化的色譜條件下測定樣品的HPLC圖譜。根據(jù)指紋圖譜軟件處理圖譜，自動生成獨(dú)活藥材共有模式的對照圖譜，見圖1。確定了15個色譜峰作為共有特征色譜峰，并對其進(jìn)行HPLC-ESI-MSn分析，各峰的質(zhì)譜信息見表1。通過對照質(zhì)譜信息和保留時間，指認(rèn)了其中的6個峰，通過質(zhì)譜信息并結(jié)合文獻(xiàn)報道[6-12]，推斷了15個特征峰中的另外9個峰。

注：1.腺苷；2.傘形花內(nèi)酯；3. 3-O-反式阿魏?；鼘幩?；4.紫花前胡苷；5.二氫歐山芹醇；6.補(bǔ)骨脂素；7.花椒毒素；8.異當(dāng)歸醇；9.佛手柑內(nèi)酯；10.歐芹烯酚；11.二氫歐山芹醇乙酸酯；12.川白芷素；13.當(dāng)歸三醇；14.蛇床子素；15.二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯

圖1混合對照品色譜圖(A)和獨(dú)活藥材的共有模式圖(B)

2.5 指紋圖譜建立及分析評價

2.5.1 參比峰的選擇 從15批次獨(dú)活樣品的HPLC圖譜中可知，14號蛇床子素色譜峰峰面積最大，保留時間穩(wěn)定，且為獨(dú)活的主要活性成分，所以選擇其作為參照峰(即S峰)。

2.5.2 獨(dú)活藥材HPLC指紋圖譜的建立 將每個樣品的AIA格式文件導(dǎo)入相似度評價軟件，以湖北省五峰縣牛莊鄉(xiāng)GAP種植基地樣品(S9號，湖北五峰縣-2)為參照圖譜，采用中位數(shù)法，時間窗寬度設(shè)為0.1 min且對色譜圖上保留時間在5～65 min時間段的色譜峰進(jìn)行分析，選定了15個色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正，自動匹配，最終獲得了15個共有特征峰，見圖2。表2為不同產(chǎn)地獨(dú)活藥材的相似度數(shù)據(jù)。

表1 獨(dú)活樣品中15個共有峰的HPLC-ESI(+)-MSn數(shù)據(jù)及鑒定

注：tR(retention time)為保留時間；*表示與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對照

圖2 15批獨(dú)活藥材HPLC指紋圖譜疊加圖

樣品編號樣品名稱相似度樣品編號樣品名稱相似度S1甘肅-10.908S9湖北五峰-20.975S2甘肅-20.950S10市售-立方藥業(yè)0.874S3甘肅-30.925S11市售-北京同仁堂0.844S4甘肅-40.944S12四川-10.899S5湖北-10.963S13四川-20.848S6湖北-20.977S14四川-30.922S7湖北恩施0.979S15四川-40.797S8湖北五峰-10.974

2.5.3 獨(dú)活藥材聚類分析 以15個共有峰的峰面積作標(biāo)，運(yùn)用SPSS 16.0軟件，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，樣品相似度的距離公式選擇夾角余弦，對15個批次獨(dú)活樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類，得到聚類樹狀圖。從聚類分析結(jié)果可知，15批獨(dú)活樣品被聚為五類，S1、S14聚為Ⅰ類；S2、S4、S7、S9聚為Ⅱ類；S3、S5、S8聚為Ⅲ類；S6、S10、S11聚為Ⅳ類；S12、S13、S15聚為Ⅴ類。

2.5.4 共有峰主成分分析 用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件對原始數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn)化處理，以主成分的特征根及貢獻(xiàn)率作為選擇主成分的依據(jù)進(jìn)行主成分分析。取主成分對應(yīng)的特征值大于1的前4個主成分，對15個樣品(觀測對象)的15個共有峰(變量)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果顯示4個主成分累計貢獻(xiàn)可以達(dá)到89.854%。其中第一、第二、第三和第四主成分特征值分別為7.253、2.718、1.951和1.556，相應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率分別為48.357%、18.119%、13.005%和10.374%。分別以第一、第二、第三主成分來建立坐標(biāo)系，進(jìn)行投影后可得到所有樣本的主成分分析三維投影圖，結(jié)果顯示15個共有峰可大致分為3類。經(jīng)旋轉(zhuǎn)后得到公共因子載荷矩陣，每一個載荷量表示主成分與對應(yīng)變量的相關(guān)系數(shù)，再經(jīng)SPSS 16.0軟件計算可得主成分模型，從上述主成分模型可以看出，4個主成分中，A1是特征值最大的峰。第一主成分中前5名變量系數(shù)分別為0.330、0.275、0.214、0.202和0.121，分別為指紋圖譜中的13號色譜峰(當(dāng)歸三醇)、5號色譜峰(二氫歐山芹醇)、10號色譜峰(歐芹烯酚)、11號色譜峰(二氫歐山芹醇乙酸酯)和14號色譜峰(蛇床子素)；系數(shù)的大小反映指標(biāo)成分貢獻(xiàn)率的大小。

3 討論

3.1 共有峰的鑒定 取“2.3”項下的獨(dú)活提取液10 μL進(jìn)行HPLC-ESI-MSn多級質(zhì)譜分析。本實(shí)驗關(guān)注的成分主要是香豆素類，為苯并吡喃酮結(jié)構(gòu)。香豆素化合物在進(jìn)行HPLC-MSn分析時易產(chǎn)生丟失m/z28(CO)或m/z44(CO2)的碎片離子。本實(shí)驗結(jié)合前期研究，運(yùn)用香豆素化合物的HPLC-ESI-MSn裂解規(guī)律，對未知峰的多級質(zhì)譜信息進(jìn)行分析并結(jié)合6個標(biāo)準(zhǔn)品信息，在獨(dú)活的植物化學(xué)提取相關(guān)文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)上，鑒定了全部共有峰。1號峰，tR=8.389 min， 正離子模式可見m/z268[M+H]+，分子中應(yīng)含有奇數(shù)氮原子，將[M+H]+峰進(jìn)行MS2分析，通過丟失132的核糖基碎片而產(chǎn)生m/z136離子，結(jié)合文獻(xiàn)[6]報道推測為腺苷。3號峰，tR=20.755 min，正離子模式可見m/z369[M+H]+，對該[M+H]+峰進(jìn)行MS2分析，通過丟失192的碎片產(chǎn)生m/z177離子，將m/z177離子進(jìn)行MS3和MS4分析，通過連續(xù)丟失CO產(chǎn)生m/z145和m/z117離子，結(jié)合文獻(xiàn)[6]報道推測為3-O-反式阿魏?；鼘幩?。4號峰，tR=22.319 min，正離子模式可見m/z409[M+H]+，對該[M+H]+峰進(jìn)行MS2分析，通過丟失162的葡萄糖基碎片產(chǎn)生m/z247離子，后將m/z247離子進(jìn)行MS3和MS4分析，通過連續(xù)丟失H2O和C3H6產(chǎn)生m/z229和m/z187離子，結(jié)合文獻(xiàn)[7]報道推測為紫花前胡苷。5號峰，tR=24.378 min，正離子模式可見m/z247[M+H]+，將[M+H]+峰進(jìn)行MS2分析，通過丟失水分子產(chǎn)生m/z229離子，再將m/z229離子進(jìn)行MS3和MS4分析，通過連續(xù)丟失CO產(chǎn)生m/z201和m/z173離子，結(jié)合文獻(xiàn)[8]報道推測為二氫歐山芹醇。8號峰，tR=29.545 min，正離子模式可見m/z377[M+H]+，將[M+H]+峰進(jìn)行MS2分析，通過丟失18 Dau的水分子產(chǎn)生m/z359離子，再將m/z359離子進(jìn)行MS3和MS4分析，通過連續(xù)丟失CH3COCH3、C5H6O和CO產(chǎn)生m/z301、m/z219和m/z191離子，結(jié)合文獻(xiàn)[9]報道推測為異當(dāng)歸醇。10號峰，tR=39.325 min，正離子模式可見m/z231[M+H]+，對該[M+H]+峰進(jìn)行MS2分析，通過丟失C4H8的丁烯碎片產(chǎn)生m/z175離子，后將m/z175離子進(jìn)行MS3和MS4分析，通過連續(xù)丟失CO和CO2產(chǎn)生m/z147和m/z103離子，結(jié)合文獻(xiàn)[10]報道推測為歐芹烯酚。11號峰，tR=41.647 min，正離子模式可見m/z289[M+H]+，對該[M+H]+峰進(jìn)行MS2分析，產(chǎn)生m/z229的川白芷素型特征離子，對該m/z229離子進(jìn)行MS3和MS4分析，通過連續(xù)丟失C3H6和CO產(chǎn)生m/z187和m/z159離子，結(jié)合文獻(xiàn)[10]報道推測為二氫歐山芹醇乙酸酯。12號峰，tR=46.575 min，正離子模式可見m/z229[M+H]+，對該[M+H]+峰進(jìn)行MS2分析，通過丟失C3H6的丙烯碎片產(chǎn)生m/z187離子，對該m/z187離子進(jìn)行MS3和MS4分析，通過連續(xù)丟失CO產(chǎn)生m/z159和m/z131離子，結(jié)合文獻(xiàn)[11]報道推測為川白芷素。13號峰，tR=48.860 min，正離子模式可見m/z295[M+H]+，對[M+H]+峰進(jìn)行MS2、MS3和MS4分析，結(jié)果顯示，通過連續(xù)丟失H2O產(chǎn)生m/z277，m/z259和m/z241離子，結(jié)合文獻(xiàn)[12]報道推測為當(dāng)歸三醇。

3.2 相似度評價 15批相似度為0.797～0.979。其中2批市售獨(dú)活藥材(S10，S11)與3批四川產(chǎn)地獨(dú)活藥材(S12，S13，S15)相似度小于0.900，4批樣品(S1，S3，S4，S14)的相似度為0.908～0.950，6批樣品(S2，S5，S6，S7，S8，S9)的相似度大于0.950。以上數(shù)據(jù)反映不同來源的獨(dú)活藥材的質(zhì)量間存在一定的差異。甘肅和湖北產(chǎn)地的藥材具有較高的均一性。

3.3 聚類分析 聚類分析是根據(jù)相似度大小將樣品歸類。從聚類分析結(jié)果可知，市售藥材(S10和S11)聚為一類，而產(chǎn)地相近的藥材并未全部聚為一類，如四川產(chǎn)地藥材(S12，S13，S15)聚為一類，而甘肅產(chǎn)地(S2，S4)和湖北產(chǎn)地(S7，S9)藥材交叉聚為一類。值得一提的是，同為GAP種植基地藥材(S8和S9)卻未能聚為一類，這些差異性表明，地理環(huán)境中的土壤酸堿度、光照時間、水分以及藥材的采收季節(jié)等因素可能會對獨(dú)活中化學(xué)成分的含量變化產(chǎn)生一定影響。聚類分析結(jié)果與相似度結(jié)果基本一致。

3.4 主成分分析 在中藥材鑒別方面，主成分分析方法有較多應(yīng)用。本實(shí)驗選取15個主要色譜峰的相對峰面積作為變量(將蛇床子素的峰設(shè)為參照峰)，根據(jù)主成分分析法的降維對獨(dú)活藥材的HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)快速分析，不僅能判別藥材的真?zhèn)闻c優(yōu)劣，還可以作為獨(dú)活藥材質(zhì)量檢測的一種手段。

3.5 真?zhèn)嗡幉蔫b別 常艷旭等[13]報道了獨(dú)活的指紋圖譜研究，主要側(cè)重于對指紋圖譜方法的建立及含量測定，而本實(shí)驗在建立獨(dú)活指紋圖譜的基礎(chǔ)上，采用相似度分析、聚類分析、主成分分析和HPLC-MSn分析對獨(dú)活指紋圖譜進(jìn)行更深入的定性研究，并將市售藥材和GAP種植基地藥材納入指紋圖譜評價范圍內(nèi)，應(yīng)用范圍更廣。在與獨(dú)活混品羌活的對比研究中發(fā)現(xiàn)，獨(dú)活藥材中峰面積最大的蛇床子素峰和二氫歐山芹素峰在羌活藥材中幾乎未被發(fā)現(xiàn)，由此可將本實(shí)驗所建立的指紋圖譜用于獨(dú)活與其混品的鑒別。

本實(shí)驗首次采用指紋圖譜結(jié)合HPLC-ESI-MSn、聚類分析等方法對包括GAP種植基地在內(nèi)的15批獨(dú)活藥材進(jìn)行質(zhì)量評價，建立了獨(dú)活藥材香豆素類成分的HPLC指紋圖譜，選取15個共有特征峰進(jìn)行分析，采用對照品、LC-MS信息和文獻(xiàn)報道等多手段對共有峰進(jìn)行指認(rèn)和推斷，主要包括1個腺苷和14個香豆素類成分，首次從定性角度深入分析獨(dú)活藥材。單純的中藥指紋圖譜由于缺乏對指紋峰化學(xué)信息的了解而不能反映中藥的藥物活性。因此，本研究從指紋圖譜的整體性入手，為獨(dú)活的質(zhì)量評價以及臨床應(yīng)用提供更完善的依據(jù)。

(致謝：北京大學(xué)楊秀偉教授和湖北省中醫(yī)藥研究院王克勤研究員在采購GAP種植基地獨(dú)活藥材上給予了熱心幫助，安徽省亳州市食品藥品檢驗所劉軍檢驗員幫助收集不同產(chǎn)地獨(dú)活藥材，在此一并感謝！)