刷狀聚磷酸酯包載阿霉素形成的納米顆粒對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株的殺傷效應(yīng)

楊席席，任 樂，高 萌，許 朝,余 躍

胰腺癌是一種惡性程度高，病情進(jìn)展迅速，且預(yù)后較差的消化道腫瘤，5年存活率目前已不足5%[1-2]。大多數(shù)患者被診出時已錯過手術(shù)機(jī)會，目前臨床中晚期多以化療為主。阿霉素(doxorubicin，Dox)是一種廣譜的腫瘤化療藥物，臨床上已應(yīng)用于多種癌癥的治療，但Dox對骨髓及心臟等明顯的毒副作用，限制了其在臨床癌癥治療的應(yīng)用[3-4]。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修飾的聚磷酸酯化合物近年來越來越受到人們的關(guān)注，在多種癌癥治療方面有顯著療效，PEG修飾的納米顆?？梢杂行г黾悠渌幬锏乃苄?，且隨其密度增大，可以顯著延長血液中循環(huán)，這些將使得其包載的藥物能夠在腫瘤部位富集而發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)[5-6]。該研究旨在設(shè)計不同PEG密度刷狀聚磷酸酯納米顆粒，探究其被胰腺癌細(xì)胞攝取差異，及對胰腺癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，為進(jìn)一步將聚磷酸酯納米材料應(yīng)用于胰腺癌臨床治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料阿霉素鹽酸鹽/Dox購自北京華豐有限公司；NoPEG-NP、LowPEG-NP、HighPEG-NP系華南理工大學(xué)楊顯珠教授饋贈；人胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3購自上海細(xì)胞庫；噻唑藍(lán)(MTT)購自美國Sigma -Aldrich公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國 Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1納米顆粒的制備 將已制備的刷狀聚磷酸酯聚合物NoPEG-NP、LowPEG-NP、HighPEG-NP和Dox溶于二甲亞砜(DMSO)溶液中，再通過攪拌、透析、濃縮等過程將Dox通過疏水間作用力包載其中而獲得納米顆粒NoPEG-NPDox、LowPEG-NPDox及HighPEG-NPDox。

1.2.2納米顆粒的粒徑(particle size，PS)及其血清穩(wěn)定性檢測 分別取制備好的納米顆粒NoPEG-NPDox、LowPEG-NPDox及HighPEG-NPDox溶液各100 μl加入到不同的比色皿中，用動態(tài)光散射儀(dynamic light Scatterometer，DLS)來檢測顆粒PS，溫度控制在25 ℃，需重復(fù)此實(shí)驗(yàn)3次。其次為了了解各種納米藥物是否能在血清中穩(wěn)定存在，將其加入含10% 胎牛血清的RPMI-1640 溶液中邊孵育邊緩慢攪拌，然后用DLS分別檢測不同納米顆粒在相應(yīng)時間點(diǎn)的PS大小，分析其穩(wěn)定性。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) BxPC-3細(xì)胞系用含10% 胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)于恒溫孵育箱中(37 ℃、5% CO2)，當(dāng)細(xì)胞生長到對數(shù)期時，即貼壁面積達(dá)80%～90%時，用0.25%胰酶消化。

1.2.4FACS檢測納米顆粒NoPEG-NPDox、LowPEG-NPDox、HighPEG-NPDox及游離阿霉素(Free Dox)各組細(xì)胞攝取差異 將生長狀態(tài)良好的BxPC-3細(xì)胞植入24孔板，每孔約10萬細(xì)胞。將孔板放到恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)過夜，次日用RPMI-1640完全培養(yǎng)基配置含游離 Dox或納米顆粒NoPEG-NPDox、LowPEG-NPDox、HighPEG-NPDox，使Dox濃度均為3 μg/ml。溫箱孵育2 h，每組3個平行孔，后取出培養(yǎng)板，吸去其中舊的含有顆粒和納米藥物的培養(yǎng)基，后向板中加入適量1×PBS緩沖液清洗3次，充分洗去孔板中藥物殘留。接下來向每孔中加入等量0.25%的胰酶進(jìn)行消化，溫箱孵育3～5 min 終止消化，后將其轉(zhuǎn)移至事先準(zhǔn)備好的潔凈流式管中進(jìn)行離心，4 ℃、1 000 r/min、5 min，結(jié)束后去除上清液，加入適量緩沖液重懸(250 μl左右)，流式上樣檢測，后用FlowJo 7.6.1.處理數(shù)據(jù)，算出不同組細(xì)胞攝取的Dox量。

1.2.5MTT法檢測不同納米顆粒及游離Dox各組對細(xì)胞的殺傷效果 將生長狀態(tài)良好的BxPC-3細(xì)胞種植于96孔板中，5 000細(xì)胞/孔。將其置于溫箱孵育過夜，次日分別加入用RPMI-1640完全培養(yǎng)液配制的含Dox濃度為0.50、 1.00、2.00、4.00 μg/ml的游離Dox和聚磷酸酯納米顆粒NoPEG-NPDox、LowPEG-NPDox、HighPEG-NPDox，500 μl孔, 每組設(shè)4個平行孔，另外設(shè)置只含細(xì)胞不做任何處理的細(xì)胞孔作為空白對照。溫箱孵育4 h，后取出棄去舊的培養(yǎng)液，換上新的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，期間倒置顯微鏡下仔細(xì)觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，培養(yǎng)結(jié)束后向板中加入由培養(yǎng)液和已過濾除菌的MTT溶液混合,濃度為1 mg/ml，100 μl/孔，溫箱孵育4 h后取出向板中加入事先配置好20% SDS細(xì)胞裂解液(100 μl/孔)，放置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，8 h后拿出用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，用軟件Excel 2013、SPSS 16.0和GraphPad.Prism.v 5.0.處理測好的對應(yīng)孔的吸光度(optical density，OD)值，計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)= (藥物細(xì)胞組OD值-空白對照組OD值) / (非光照不加藥細(xì)胞組OD值-空白對照組OD值) ×100%。

1.2.6活死細(xì)胞染色法檢測各組納米顆粒細(xì)胞殺傷情況 BxPC-3細(xì)胞種板步驟基本同流式檢測，將完全培養(yǎng)液配制的含Dox濃度為4 μg/ml的游離組和納米顆粒分別加入到相應(yīng)的孔板中，培養(yǎng)箱孵育4 h后取出棄去舊的培養(yǎng)液，換上新的培養(yǎng)基，繼續(xù)溫箱孵育48 h，后將PBS配好的死細(xì)胞染色液溴乙非啶豪莫二聚體(4 μmol/L)和活細(xì)胞染色液鈣黃綠素乙酰甲酯( 2 μmol/L)加入孔板中，100 μl/孔。室溫孵30 min，后用熒光顯微鏡觀察并拍照保存，最后用軟件Image J處理相應(yīng)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1不同聚磷酸酯納米藥物的PS、分布及其血清中的穩(wěn)定性首先通過核磁表征等證明成功合成了刷狀聚磷酸酯納米顆粒NoPEG-NPDox、LowPEG-NPDox和HighPEG-NPDox。通過DLS檢測證明制備好的納米顆粒NoPEG-NPDox、LowPEG-NPDox或HighPEG-NPDox的PS，大小約為95 nm，見圖1A。PEG殼層的存在阻止了這些運(yùn)載有Dox 納米顆粒的聚集成團(tuán)，將顆粒置于10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隨著時間的延長，顆粒的PS也基本在一個固定PS范圍內(nèi)進(jìn)行波動，說明其在血液中可以穩(wěn)定存在，血清穩(wěn)定性好，見圖1B。

2.2FACS結(jié)果顯示三種納米顆粒中P(CEP30-EEP10)/Dox/NoPEG-NPDox被胰腺癌細(xì)胞攝取更多在細(xì)胞完成溫箱孵育攝取2 h后，F(xiàn)ACS檢測每組細(xì)胞中攝取的Dox量見圖2B。胰腺癌細(xì)胞和三種納米顆粒共孵育2 h后，NoPEG-NPDox胞內(nèi)的Dox平均熒光強(qiáng)度(mean flourscence indensity，MFI)約為LowPEG-NPDox組的2倍(t=8.845,P<0.001)，LowPEG-NPDox組約為HighPEG-NPDox(t=8.367,P<0.001)的1.6倍，其中三組顆粒的Dox的熒光量均低于Free Dox組，NoPEG-NPDox的熒光量僅略低于游離組，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

2.3MTT法顯示納米顆粒NoPEG-NPDox對細(xì)胞的殺傷作用更強(qiáng)加藥孵育后3種納米藥物抑制細(xì)胞的生長作用為NoPEG-NPDox組強(qiáng)于LowPEG-NPDox組，其次是HighPEG-NPDox組,其中Free Dox組略強(qiáng)于NoPEG-NPDox組。如Dox濃度為4.0 μg/ml時，F(xiàn)ree Dox組對細(xì)胞的抑制率為82.40%，接近85%，而NoPEG-NPDox組抑制率也達(dá)到了77.55%，接近于80%，已和游離組細(xì)胞抑制率相近，而其余兩組LowPEG-NPDox和HighPEG-NPDox相對較弱，分別只有58.85%和39.74%，均明顯低于NoPEG-NPDox組。見圖3、表1。

2.4各種納米顆粒對細(xì)胞的殺傷情況活死細(xì)胞染色法結(jié)果顯示：紅色代表死細(xì)胞，綠色代表活細(xì)胞，見圖3B，加藥培養(yǎng)后NoPEG-NPDox組單個視野下死細(xì)胞所占比例高于LowPEG-NPDox組(t=7.594,P<0.01)，LowPEG-NPDox組強(qiáng)于HighPEG-NPDox組(t=7.921,P<0.01)，其中Free Dox組略高于NoPEG-NPDox組(t=7.754,P<0.01)，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3。

圖1 顆粒相關(guān)性質(zhì)的表征

圖2 FACS檢測3種納米顆粒被細(xì)胞攝取情況

A：流式峰圖；B：柱狀圖；1：NoPEG-NPDox組；2：LowPEG-NPDox組；3：HighPEG-NPDox組；4:Free Dox組；與NoPEG-NPDox組比較：***P<0.001；與LowPEG-NPDox組比較：△△△P<0.001；與HighPEG-NPDox組比較：###P<0.001

表1 加藥孵育后各處理組在不同Dox濃度下對BxPC-3細(xì)胞生長的抑制率

與Free Dox比較：*P<0.01，**P<0.001；與NoPEG-NPDox比較：△P<0.01，△△P<0.001；與LowPEG-NPDox比較：#P<0.01，##P<0.001

圖3 三種顆粒對細(xì)胞的殺傷情況

A：MTT法檢測各組顆粒被細(xì)胞攝取后對細(xì)胞產(chǎn)生的殺傷情況；B：活死細(xì)胞染色法檢測各組納米顆粒對細(xì)胞的殺傷效應(yīng)

3 討論

Dox通過細(xì)胞膜進(jìn)入癌細(xì)胞作用于其DNA，進(jìn)而產(chǎn)生較強(qiáng)的抗腫瘤藥理特性，臨床上已用于多種癌癥的治療。但Dox在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也對正常組織產(chǎn)生了一定的毒副作用，這些都限制了其在臨床癌癥治療的應(yīng)用。納米載藥體系，是通過一系列包埋、囊封、吸附的方式將臨床藥物同納米載體相結(jié)合后形成一種穩(wěn)定的納米載藥系統(tǒng)，它可以增加藥物的水溶性，減輕其對正常組織的毒副作用，使得納米藥物在腫瘤部位通過腫瘤的高滲透及滯留效應(yīng)完成在腫瘤部位的富集，為后期藥物在腫瘤部位發(fā)揮療效提供基礎(chǔ)[7]。此外也有相關(guān)研究[8]報道了酸度響應(yīng)的超支化納米材料包載Dox后顯示增強(qiáng)的乳腺癌抑制效應(yīng)。

PEG修飾的聚磷酸酯的化合物近年來越來越受到人們的關(guān)注，在多種癌癥治療方面有顯著療效，已在相關(guān)文獻(xiàn)[9-10]中報道。本研究選用不同密度PEG修飾聚磷酸酯納米載藥體系，PEG修飾后可顯著改善藥物的水溶性，為后期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)藥物在血液中能夠穩(wěn)定存在，延長血液中長循環(huán)奠定基礎(chǔ)。FACS結(jié)果顯示納米顆粒NoPEG-NPDox被細(xì)胞攝取更多，多于LowPEG-NPDox及HighPEG-NPDox，這可能是由于納米顆粒的PEG密度越大時，會使得其柔韌性增加，抵抗細(xì)胞攝取的能力越強(qiáng)，因此沒有PEG鏈修飾的NoPEG-NPDox在三種顆粒中相對攝取最好，而Free Dox屬于小分子物質(zhì)，可以通過擴(kuò)散的形式進(jìn)入細(xì)胞，故同等條件下游離組相對納米顆粒攝取多一些[11]。因NoPEG-NPDox在腫瘤細(xì)胞內(nèi)Dox含量相對最多，故后續(xù)MTT實(shí)驗(yàn)中NoPEG-NPDox的細(xì)胞殺傷效果要強(qiáng)于LowPEG-NPDox，再者HighPEG-NPDox。且Dox濃度為4.0 μg/ml，NoPEG-NPDox的細(xì)胞殺傷效果和游離組接近，為80%左右，說明通過納米載藥系統(tǒng)有效地提高了Dox對胰腺癌細(xì)胞的殺傷作用。

綜上所述，本體外研究證明了納米顆粒NoPEG-NPDox能夠更好地被胰腺癌細(xì)胞攝取，后期殺傷癌細(xì)胞效應(yīng)更強(qiáng)。在細(xì)胞水平上，PEG的密度影響細(xì)胞對其的攝取量，PEG密度越大，細(xì)胞攝取越少，而且雖然游離Dox的攝取量要多于NoPEG-NPDox，但因游離的Dox其本身毒副作用的存在，且體內(nèi)應(yīng)用時它極易被血液系統(tǒng)清除，而要達(dá)到體內(nèi)抑瘤效應(yīng)時，其對正常組織的毒副作用遠(yuǎn)大于抑瘤作用，故遠(yuǎn)期應(yīng)用方面，其整體效果遠(yuǎn)不及聚磷酸酯納米藥物，后者可以避免血液的清除，在血液中長期穩(wěn)定存在，更多的納米藥物在腫瘤部位富集，進(jìn)而對腫瘤部位產(chǎn)生更強(qiáng)殺傷效應(yīng)。而不同PEG密度納米藥物在體內(nèi)應(yīng)用時其體內(nèi)循環(huán)情況是否和細(xì)胞水平一樣，有待進(jìn)一步研究，為臨床實(shí)踐及應(yīng)用提供更多的價值參考。