加熱處理對蜂蜜酒香氣物質的影響

李蕊蕊 趙新節(jié) 原苗苗, 姜凱凱 孫玉霞,?

(1山東省農業(yè)科學院農產品研究所/山東省農產品精深加工技術重點實驗室/農業(yè)部新食品資源加工重點實驗室,山東 濟南 250100；2齊魯工業(yè)大學山東省微生物工程重點實驗室,山東 濟南 250353)

蜂蜜是指蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露,與自身分泌物結合后,經充分釀造形成的天然甜味物質,富含葡萄糖、果糖以及酶、維生素、礦物質等多種微量成分,具有較好的生理功能和藥理活性,是一種傳統(tǒng)的天然保健食品。目前,蜂蜜售價較低,為了提高蜂蜜的產品附加值,釀造蜂蜜酒是一種可行的辦法[1]。

蜂蜜酒是由蜂蜜發(fā)酵而成的酒精飲料,酒精度一般在8%～18%[1],是世界上最古老的發(fā)酵飲料。蜂蜜酒不僅保留了天然蜂蜜的營養(yǎng)成分和保健功能,而且提高了氨基酸、維生素、礦物質等重要生物活性物質的含量[2]。但目前蜂蜜酒的生產存在發(fā)酵延遲、易發(fā)酵終止、產品缺乏穩(wěn)定性及酵母發(fā)酵產生敗味等問題,這些問題與蜂蜜的品種、發(fā)酵溫度、發(fā)酵醪液的營養(yǎng)成分(氮源和維生素)、酵母種類、pH 值和發(fā)酵工藝等因素有關,受上述因素的影響,蜂蜜酒的產量逐年下降[2]。為了克服這種狀況,需要對蜂蜜酒的生產工藝進一步優(yōu)化[1]。酒精發(fā)酵前發(fā)酵醪液的滅菌處理是蜂蜜酒釀造的關鍵技術之一。加熱處理可通過改變酚類物質的含量改變蜂蜜酒的抗氧化活性[3],是最為常見的滅菌方式之一[4-5]。此外,滅菌處理方法還偏重亞硫酸鹽(鈉鹽、鉀鹽或商品的片劑,通過釋放二氧化硫氣體來進行殺菌)[6]、二氧化硫氣體[7]、巴氏滅菌[8]和超濾[9]等,這些方法有些通過使蛋白質變性和凝固,促使發(fā)酵醪液的澄清,但在生產應用中可能會給蜂蜜酒帶來硫臭味或對生產設備要求較高。本研究以荊條蜜為原料,在酒精發(fā)酵前采用加熱處理對發(fā)酵醪液進行滅菌,探討加熱處理對蜂蜜酒香氣成分的影響,旨在為蜂蜜酒的生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：荊條蜜,購自山東蒙甜蜂業(yè)有限公司,2 個不同批次的蜂蜜,分別為白色和淺琥珀色。輔料：釀酒酵母FX10,購自煙臺通商國際貿易有限公司；發(fā)酵助劑Fermaid O,購自上海杰兔工貿有限公司。

磷酸氫二銨(ammonium phosphate,DAP),連云港恩尚化工產品貿易有限公司。氫氧化鈉(分析純),天津市風船化學試劑科技有限公司；氯化鈉(分析純),國藥集團化學試劑有限公司；4-甲基-2-戊醇(色譜純,98%),美國Aldrich 公司；乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、1-丙醇、異丁醇、正丁醇、1-己醇、庚醇、1-辛醇、苯甲醇、2-壬酮、己酸、辛酸、癸酸標準品,美國Sigma 公司。

1.2 主要儀器與設備

ORION RTAR A211 pH 計,賽默飛世爾科技(中國)有限公司；PAL 自動進樣器,瑞士思特斯分析儀器有限公司；GC-7890A/MS-5977A 氣相色譜-質譜聯用儀、DB-WAX 色譜柱,美國安捷倫科技有限公司。

1.3 蜂蜜酒的釀造工藝

將蜂蜜用去離子水稀釋至比重1.090,依次添加0.25 g·L-1氯化鎂、0.25 g·L-1氯化鈣、1 g·L-1磷酸氫二銨(DAP)及0.2 g·L-1發(fā)酵助劑Fermaid OTM,用檸檬酸緩沖液調節(jié)pH 值至3.5,滅菌處理(對照組：不加熱；處理組[10]：加熱溫度80℃,加熱時間20 min),然后添加0.02%釀酒酵母FX10,放置在室溫條件下自然發(fā)酵(加熱處理的樣品待溫度降至室溫后,對其比重和pH 值進行微調至與加熱前相同,然后再添加釀酒酵母)。發(fā)酵期間,每天通過測定蜂蜜酒比重來監(jiān)控發(fā)酵進程,比重持續(xù)3 d 不發(fā)生變化,即認為酒精發(fā)酵終止。酒精發(fā)酵結束后取樣測定其香氣物質和基本理化指標,每處理均重復3 次。

1.4 蜂蜜酒基本理化指標的測定

根據GB/T 15038-2006 葡萄酒、果酒通用分析方法[11]測定蜂蜜酒中的還原糖、總酸、揮發(fā)酸含量及酒精度。

1.5 蜂蜜酒中揮發(fā)性化合物的測定

用配帶有PAL 自動進樣器的氣相色譜法質譜聯用儀檢測蜂蜜酒中的揮發(fā)性化合物,選擇DB-WAX[0～250℃(260℃)：30 m×250 μm×0.25 μm]毛細管色譜柱,頂空固相微萃取進樣,20 mL 頂空瓶中依次加入2 g 氯化鈉、8 mL 樣品及20 μL 內標(4-甲基-2-戊醇,濃度2.000 g·L-1)45℃預熱頂空瓶10 min,萃取頭萃取頂空瓶液面上方氣體45 min,萃取過程頂空瓶在Agitator 中不停搖動,萃取頭在進樣口250℃解析10 min。采用不分流模式進樣,恒流模式,柱流量0.8 mL·min-1。程序升溫：初始溫度40℃,以1℃·min-1升至45℃,保持2 min；以3℃·min-1升至84℃,保持2 min； 以 3℃·min-1升 至 120℃, 保 持 3 min； 以3℃·min-1升至200℃；以5℃·min-1升至230℃,運行總時間71.667 min。MSD 傳輸線250℃,質譜選擇SCAN模式進行掃描。

1.6 蜂蜜酒中揮發(fā)性化合物的定性定量分析

定性分析：采用氣相色譜-質譜-計算機聯用儀進行分析鑒定。分析結果運用計算機譜庫(NIST14)進行初步檢索和分析,再結合相關文獻進行人工譜圖解析,確定揮發(fā)性物質的各個化學成分。

定量分析：對于己有標樣的香氣物質,利用其在模擬酒溶液中的標準曲線定量。對沒有標樣的物質利用化學結構、官能團相似、碳原子數相近的標樣標準曲線進行半定量[12-13]。

1.7 感官評價方法

取適量各試驗的蜂蜜酒于酒杯中,由8 名受過葡萄酒果酒品評專業(yè)訓練的人對試驗蜂蜜酒的色澤、香氣、口感和典型性品評打分,滿分為100 分,綜合評分為去除最高分和最低分后的平均值。

1.8 數據處理

采用SPSS 19.0 進行主成分分析,使用Microsoft Excel 2007 作圖。

2 結果與分析

2.1 蜂蜜酒的基本理化指標分析

酒精發(fā)酵前對蜂蜜醪液加熱處理,會對蜂蜜酒的基本理化指標產生影響。由表1 可知,加熱處理有助于提高蜂蜜酒的酒精度,降低其還原糖含量,即加熱處理有助于蜂蜜酒的酒精發(fā)酵的順利進行。此外,加熱處理后蜂蜜酒的總酸含量低于對照組,揮發(fā)酸含量略高于對照組。

2.2 加熱處理對蜂蜜酒揮發(fā)性化合物含量的影響

采用HS-SPME 和GC-MS 聯用方法對蜂蜜酒的揮發(fā)性物質進行提取并檢測。由表2 可知,蜂蜜酒中共檢測出77 種揮發(fā)性物質,其中酯類39 種、醇類20 種、酸類8 種、萜烯類4 種、羰基化合物6 種,各樣品中均能檢測到的揮發(fā)性物質共有21 種。加熱處理后,2 種蜂蜜酒中香氣物質的種類和含量均明顯增加,以白色荊條蜜為原料釀造的蜂蜜酒,經加熱處理后,其香氣物質的含量為300.95 mg·L-1,顯著高于對照組(66.07 mg·L-1)；以淺琥珀色荊條蜜為原料釀造的蜂蜜酒,經加熱處理后,其香氣物質含量為581.53 mg·L-1,高于對照組(185.45 mg·L-1)。此外,經加熱處理的淺琥珀色-荊條蜜酒共檢測出57 種香氣物質,對照組僅檢測出39 種。比較以2 種不同色澤的荊條蜜為原料發(fā)酵的蜂蜜酒,發(fā)現淺琥珀色-荊條蜜酒中的香氣物質含量高于白色-荊條蜜酒(P＜0.05)。

表1 蜂蜜酒的基本指標含量Table 1 Content of main parameters in mead

表2 蜂蜜酒揮發(fā)性化合物總含量匯總表Table 2 Total contents of volatile compounds of mead /(mg·L-1)

由表3 可知,在檢測到的39 種酯類物質中,含量較高的有乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯和9-十六碳烯酸乙酯。其中, 癸酸乙酯含量最高時可達134.29 mg·L-1,辛酸乙酯含量最高可達102.33 mg·L-1。與對照組相比,發(fā)酵前加熱處理可使蜂蜜酒中酯類物質的含量和種類增加。就白色-荊條蜜酒而言,加熱處理后的酒樣共檢測出28 種酯類物質,其含量可達210.13 mg·L-1,占總香氣物質含量的69.82%；對照酒樣僅檢測出13 種酯類物質,含量為20.84 mg·L-1,占總香氣物質含量的31.54%。分析淺琥珀色-荊條蜜酒發(fā)現,加熱處理的酒樣共檢測出33 酯類物質,其含量可達339.80 mg·L-1,占總香氣物質含量的58.43%；對照中僅檢測出12 種酯類物質,含量為37.91 mg·L-1,占總香氣物質含量的20.44%。此外,加熱處理的酒樣中乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯和9-十六酸烯酸乙酯含量與對照組相比均有較大程度的增加。在檢測到的20 種醇類物質中,含量較高的有丙醇、異丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇、3,7-二甲基-1-辛烯-3-醇和β-苯乙醇,且加熱處理的酒樣中這6 種醇類物質的含量均高于對照組。此外,加熱處理的酒樣中還檢出正辛醇、正癸醇和棕櫚醇。加熱處理的酒樣未檢測到3-乙氧基-1-丙醇和2-乙基己醇。

由表2 可知,加熱處理可顯著增加高級醇的含量,白色-荊條蜜酒中醇類物質含量為50.09 mg·L-1,淺琥珀色-荊條蜜酒中醇類物質含量可達188.62 mg·L-1。加熱處理的蜂蜜酒的高級醇在揮發(fā)性物質中所占的比例均有所下降,白色-荊條蜜酒由52.96% 降至16.65%,淺琥珀色-荊條蜜酒由71.89%降至32.44%,這可能是由于加熱處理使蜂蜜酒酯類物質含量明顯增加,導致醇類物質在總香氣物質中所占比例減少。加熱處理對酸類物質種類無較大影響,但酸類物質含量明顯增加,加熱處理的蜂蜜酒酸類物質的含量約是對照組的5 倍。在所有的酒樣中均可檢測到辛酸、癸酸、9-癸烯酸和月桂酸(表3),加熱處理的蜂蜜酒中4 種主要的酸類物質均明顯增加。此外,加熱處理的酒樣與對照組相比未檢測出乙酸,但檢測到丁酸。

綜合表2、表3 可知,加熱處理的酒樣中萜烯類物質的種類和總含量均有所下降,加熱后的酒樣中均未檢測到松油醇和香茅醇,里那醇的含量降低而橙花叔醇的含量增加。加熱處理的酒樣中羰基化合物的種類也有所下降,但含量變化不一。此外,加熱處理增加了酒樣中2-壬酮的含量,降低了甲基異丁基酮和乙偶姻的含量。

2.3 蜂蜜酒揮發(fā)性化合物主成分分析

采用主成分分析(principal component analysis,PCA)對蜂蜜酒香氣物質的主成分進行分析,由圖1 可知,蜂蜜酒主成分PC1(65.78%)和PC2(22.34%)累積方差貢獻率88.12%。圖中樣品編號見表3。

圖1 蜂蜜酒揮發(fā)性化合物主成分得分圖Fig.1 Score chart of the principal component of volatile compounds in mead

由圖1 可知,加熱處理的淺琥珀色-荊條蜜酒樣位于第一象限內,與之有關的物質共有32 種(酯類20種、醇類9 種、酸類2 種、羰基化合物1 種),含量較高的揮發(fā)物質主要包括乙酸苯乙酯、辛酸-3-甲基丁酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、異丁醇、異戊醇、苯乙醇、癸酸和9-癸烯酸；加熱處理的白色-荊條蜜酒樣位于第四象限內,與之有關的物質共有26 種(酯類18 種、醇類3 種、酸類3 種、萜烯類1 種、羰基化合物1 種),含量較高的相關揮發(fā)物質主要包括乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、正癸醇、2,3-丁二醇、辛酸、9-癸烯酸和2-壬酮。在2 種色澤的蜂蜜酒中,與加熱處理的酒樣相關的揮發(fā)性物質主要為酯類物質。加熱處理提高了蜂蜜酒中酯類物質的種類和含量。對照組酒樣均位于第二象限,起主要作用的揮發(fā)性物質共有17 種(酯類1 種、醇類6 種、酸類3種、萜烯類3 種、羰基化合物4 種),其中含量較高的揮發(fā)物質主要是丙醇、乙酸,說明對照組中酯類物質的貢獻不大,而醇類是主要的揮發(fā)性物質。

2.4 加熱處理對蜂蜜酒感官評價的影響

由8 名受過葡萄酒果酒品評專業(yè)訓練的人對試驗蜂蜜酒的色澤、香氣、口感和典型性進行品評打分,結果表明,與對照組相比,加熱處理的蜂蜜酒的蜂蜜香和果香更加純正,滋味更加醇美柔和(表4)。

3 討論

本研究中,加熱處理組的蜂蜜酒酒精度均高于對照組,可能是因為蜂蜜中含有轉化酶能夠抑制蜂蜜酒發(fā)酵,加熱處理在抑制酶活性的同時還具有殺菌的作用,從而有利于酒精發(fā)酵的進行[1,18]。酯類物質主要在發(fā)酵過程中形成,能夠賦予酒新鮮的水果香氣,是果香的主要來源[19]。酯類物質的感覺閾值很低,易被感知。此外,酯類物質之間可以相互影響,具有協同作用[20-21]。本試驗結果表明,蜂蜜酒樣中含量較高的酯類物質主要有乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯和9-十六碳烯酸乙酯,與前人研究結果[3,22]相似。Wintersteen等[3]對蕎麥蜜酒和大豆蜜酒的香氣物質進行了研究,共檢測出7 種主要的酯類物質,分別為丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯。Lilly 等[22]發(fā)現蜂蜜酒中的酯類物質主要依賴酵母菌的生物合成,且乙酸乙酯是蜂蜜酒中主要的酯類物質。加熱處理可以增加蜂蜜酒中酯類物質的含量和種類,這可能是因為加熱處理組的蜂蜜酒樣酒精度高于對照組,即發(fā)酵過程中酵母代謝旺盛,糖消耗快,酵母在消耗糖類的過程中積累較多的ATP 使輔酶A 活性增強,促使酯類的生成[23]。本研究中,加熱處理的蜂蜜酒樣中乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯和9-十六酸烯酸乙酯的含量均高于對照組。酵母代謝過程中異戊醇乙酰轉移酶催化異戊醇和乙酰輔酶A 合成乙酸異戊酯,異戊醇是氨基酸分解的產物[24-25],Mancilla-Margalli 等[26]研究發(fā)現異戊醇是加熱過程中美拉德反應的產物,由此導致加熱處理后蜂蜜酒中乙酸異戊酯含量顯著增加。

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表4 蜂蜜酒的感官評價得分Table 4 Sensory evaluation of mead

高級醇是在釀造酒的過程中,由蛋白質、氨基酸及糖類化合物分解而成的,主要包括丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、戊醇、異戊醇、己醇和庚醇等[27]。高級醇在香氣物質中占有較大的比例,當葡萄酒中高級醇的含量低于300 mg·L-1時,會增加香氣的復雜性,對葡萄酒的品質有積極的作用[28]。在本研究中,加熱處理顯著增加了酒樣中高級醇含量,但加熱處理的蜂蜜酒中高級醇在揮發(fā)性物質中所占的比例均有所下降,可能是由于加熱處理的蜂蜜酒酯類物質含量顯著增加,導致醇類物質在總香氣物質中所占比例減少。所有試驗酒樣中均可以檢測到含量較高的4 種酸類物質,分別為辛酸、癸酸、9-癸烯酸和月桂酸,這與Sroka 等[29]研究發(fā)現蜂蜜酒中含有較高含量的中鏈脂肪酸,如辛酸、癸酸和月桂酸的結果一致。

4 結論

采用HS-SPME 和GC-MS 聯用方法對蜂蜜酒的揮發(fā)性物質進行提取并檢測,共檢測出77 種揮發(fā)性物質,其中酯類39 種,醇類20 種、酸類8 種、萜烯類4 種及羰基化合物6 種。在酒精發(fā)酵前對蜂蜜醪液進行加熱處理可以顯著增加蜂蜜酒中香氣物質的種類和含量,其中,含量較高的酯類物質有乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯和9-十六碳烯酸乙酯；醇類有丙醇、異丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇、3,7-二甲基-1-辛烯-3-醇和β-苯乙醇；酸類有辛酸、癸酸、9-癸烯酸和月桂酸。加熱處理的蜂蜜酒中萜烯類物質和羰基化合物的種類均有所下降,含量變化不一。對蜂蜜酒的香氣物質進行主成分分析發(fā)現,酯類在加熱處理的蜂蜜酒中起主要貢獻,在對照組蜂蜜酒中貢獻較少,醇類物質是對照組蜂蜜酒揮發(fā)性物質的主要成分。目前,國內外對蜂蜜酒的研究尚淺,今后應加強對適合發(fā)酵蜂蜜酒的蜜源及酵母方面的研究,以期獲得更高品質的蜂蜜酒。