陳劍杰 曹謹(jǐn)玲 賀鑫晉 郭文靜 羅永巨 高榮琨
(1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/山西省生態(tài)畜牧與環(huán)境獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山西 太谷 030801;2 廣西水產(chǎn)研究所,廣西 南寧 530021)
多環(huán)芳烴(polycyclicaromatic hydrocarbons,PAHs)是一類(lèi)種類(lèi)多、分布范圍廣的有機(jī)污染物,因其特定的理化性質(zhì)使其可以直接或間接危害生物,是能加劇環(huán)境污染的物質(zhì)。苯并芘(BaP)作為PAHs 的代表,廣泛分布于自然界的大氣、土壤和水體中,一方面損害生物圈、破壞生態(tài)平衡、威脅生物多樣性;另一方面嚴(yán)重威脅著人類(lèi)和各種生物的生存、進(jìn)化、繁衍及生存環(huán)境。朱利中等[1]檢測(cè)杭州市地表水中多環(huán)芳烴污染情況,發(fā)現(xiàn)苯并芘平均濃度最高達(dá)1.582 mg·L-1;田蘊(yùn)等[2]于2001年調(diào)查廈門(mén)西港表層海水中多環(huán)芳烴的分布情況,發(fā)現(xiàn)苯并芘含量為0.6 ~23.4 ng·L-1;周芳等[3]研究表明,太湖梅梁灣水中苯并芘平均濃度為0.3~0.4 mg·L-1。苯并芘特有的理化性質(zhì)、廣泛的毒性作用,使其存在于水體、沉積物或水生生物體內(nèi)會(huì)對(duì)水中生物產(chǎn)生較為嚴(yán)重的負(fù)面影響[4-5],Carlson 等[6]研究發(fā)現(xiàn)苯并芘對(duì)日本青鳉有一定的免疫毒性,會(huì)降低其機(jī)體對(duì)細(xì)菌感染的抵抗能力;王云等[7]等研究表明,苯并(α)芘能對(duì)褐菖肝臟造成抗氧化損傷,使其DNA 鏈斷裂,且存在劑量效應(yīng)關(guān)系;Hoffmann 等[8]研究發(fā)現(xiàn)苯并芘作用于斑馬魚(yú)后會(huì)對(duì)其產(chǎn)生一定的生殖毒性。目前,關(guān)于苯并芘對(duì)魚(yú)類(lèi)的毒性作用研究[9-11]已有大量報(bào)道,而苯并芘對(duì)魚(yú)類(lèi)肝、腎抗氧化系統(tǒng)、非特異性免疫和組織結(jié)構(gòu)的毒性作用尚鮮見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究以我國(guó)淡水鯉魚(yú)作為受試生物,研究苯并芘對(duì)魚(yú)類(lèi)肝、腎抗氧化系統(tǒng)、非特異性免疫和組織結(jié)構(gòu)的毒性作用,以期為進(jìn)一步探究苯并芘對(duì)魚(yú)類(lèi)的毒性效應(yīng)機(jī)制提供理論依據(jù)。
健康鯉魚(yú)300 尾,平均體重為18±0.86 g,由清徐漁場(chǎng)提供,經(jīng)5%食鹽水消毒后,在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng)7 d,選擇大小均勻、體表無(wú)傷的個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)。
苯并芘(BaP) 購(gòu)自美國(guó)AccuStandard 公司;助溶劑為二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),購(gòu)自美國(guó)Amresco 公司;溶壁微球藻凍干粉購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;L-dopa(levodopa)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;考馬斯亮藍(lán)(coomassie dimethyl sulfoxide brilliant blue G-250)、酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)、 超 氧 化 物 歧 化 酶(superoxide dismutase,SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、 谷 胱 甘 肽 ( glutathione, GSH)、 丙 二 醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;其他試劑均為分析純。BX53 顯微鏡成像系統(tǒng)(日本奧林巴斯);AUY-120 型電子分析天平(日本島津公司);UV2100 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海尤尼柯公司);MK3 酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo 公司);TGL-10B 高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng));XZ-0142 水質(zhì)分析儀(上海希慶電子科技有限公司)。
將鯉魚(yú)隨機(jī)分為5 組,包括對(duì)照組:0 μg·L-1BaP(CK1)、0.001% DMSO(CK2)和處理組:0.1(T1)、0.5(T2)、1.0(T3)μg·L-1BaP(助溶劑DMSO 終濃度為0.001%)。每組設(shè)3 個(gè)平行,每個(gè)平行包括鯉魚(yú)15尾,試驗(yàn)期間每5 d 徹底清潔水族箱1 次,持續(xù)30 d,試驗(yàn)期間持續(xù)充氧,試驗(yàn)所用水符合漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 11607-1989[12]。
1.4.1 NBT 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的測(cè)定 每組隨機(jī)取3 尾魚(yú)(每個(gè)平行1 尾),清水沖洗體表,擦干后用注射器尾靜脈采血于抗凝管中備用。按照參考文獻(xiàn)[13]的方法測(cè)定NBT 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù):取50 μL 血細(xì)胞滴在蓋玻片上,室溫下于濕盒內(nèi)溫育30 min,然后用pH 值6.4 0.067 mol·L-1磷酸緩沖液(phosphatic buffer solution,PBS)輕輕地洗滌蓋玻片以完全去除紅細(xì)胞,隨后滴加0.2 g·L-1硝基四氮唑藍(lán)(nitrotetrazolium blue chloride,NBT)50 μL,將蓋玻片反扣于載玻片上,濕盒內(nèi)溫育30 min,于顯微鏡下隨機(jī)6 個(gè)視野進(jìn)行觀(guān)察計(jì)數(shù),淺黑色細(xì)胞即為NBT 陽(yáng)性細(xì)胞。
1.4.2 酶活性的測(cè)定 各試驗(yàn)組分別隨機(jī)取鯉魚(yú)15尾(每個(gè)平行5 尾)擦干,于冰塊上解剖分離肝和腎臟,用4℃的生理鹽水漂洗后拭干水分,以1 ∶10(質(zhì)量體積比)加入4℃生理鹽水勻漿,3 000 r·min-1離心10 min,取上清液,4℃保存?zhèn)溆?。SOD 活性采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定[14];CAT 活性采用鉬酸銨法測(cè)定[14];GSH 含量采用DTNB 比色法測(cè)定[15];MDA 含量采用TBA 法測(cè)定[16];ACP、AKP 活性采用磷酸苯二鈉法測(cè)定[14];溶菌酶(lysozyme, LZM)活性參考劉睿智等[17]的方法,以溶壁微球藻菌凍干粉為底物進(jìn)行測(cè)定;酚氧化酶(phenoloxidase,PO)活性參照考文獻(xiàn)[18]的方法,以L(fǎng)-dopa 為底物進(jìn)行測(cè)定;蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。上述指標(biāo)均在當(dāng)天完成測(cè)定。
1.4.3 肝、腎組織切片的制備 試驗(yàn)30 d 后,各試驗(yàn)組分別隨機(jī)取試驗(yàn)魚(yú)2 尾,擦干表面后解剖分離肝、腎組織。組織切片制備按照參考文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行:組織用Bouin’s 液(波恩氏液)固定24 h 后,70%酒精沖洗,梯度酒精(75%、85%、95%、100%)脫水,二甲苯透明,組織浸蠟后用溶解好的石蠟進(jìn)行組織包埋,石蠟切片機(jī)切片厚度約6 μm,經(jīng)HE(蘇木精-伊紅)染色中性膠封片后利用顯微鏡成像系統(tǒng)觀(guān)察并拍照。
采用SPSS 16.0 進(jìn)行單因素方差分析和LSD 法多重比較,顯著性水平為P<0.05,相關(guān)性分析采用雙變量相關(guān)分析。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
圖1 BaP 暴露對(duì)鯉魚(yú)NBT 陽(yáng)性細(xì)胞的影響(n=6)Fig.1 Effect of BaP exposure on NBT positive cells in carp(n=6)
由圖1 可知,與CK1 相比,CK2 的NBT 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著性差異,處理組(T1、T2、T3)NBT 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著下降(P <0.05),分別較CK1 下降13.53%、18.82%、33.53%。相關(guān)性分析表明,暴露30 d 后,BaP 暴露濃度與鯉魚(yú)NBT 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.781,P<0.05)。
由圖2 可知,BaP 暴露30 d 后,與CK1 相比,對(duì)CK2 的肝、腎抗氧化能力的影響無(wú)顯著性差異,但對(duì)處理組(T1、T2、T3)肝、腎抗氧化能力產(chǎn)生一定影響。CK1 相比,T1、T2、T3 肝、腎組織中的SOD、CAT、GSH活性均呈先上升后下降的趨勢(shì),而MDA 含量則呈先下降后上升的趨勢(shì)。T1、T2 肝組織的SOD 活性與CK1 相比分別提高10.24%和3.12%,且T1 顯著高于CK1,T3 肝組織SOD 活性與CK1 相比顯著下降9.91%。T1 肝組織的CAT 活性較CK1 顯著提高15.55%,而T2、T3 肝組織的CAT 活性較CK1 分別下降5.61%和16.67%,且T3 顯著低于CK1。與CK1 相比,T1、T2 肝組織的GSH 活性分別升高2.06%和2.29%,T3 肝組織的GSH 活性下降1.02%,但各處理組肝線(xiàn)織GSH 活性與CK1 均無(wú)顯著性差異。與CK1相比,T1 肝組織MDA 含量下降0.49%,T2、T3 肝組織MDA 分別分別上升1.21%、6.19%,且T3 顯著高于CK1。腎組織SOD 活性T1、T2 與CK1 相比分別升高8.81%和6.54%,且T1 顯著高于CK1,T3 腎組織SOD活性較CK1 顯著下降8.61%。處理組(T1、T2、T3)腎組織的CAT 活性較CK1 分別升高8.37%、14.28%和6.08%,且T2 顯著高于CK1。與CK1 相比,T1、T2 腎組織的GSH 活性分別升高4.98%和8.22%,而T3 腎組織的GSH 活性顯著下降15.49%。與CK1 相比,T1腎組織的MDA 含量下降0.96%,而T2、T3 腎組織的MDA 含量分別上升1.24%、20.07%,且T2、T3 均顯著高于CK1。
圖2 不同BaP 濃度暴露對(duì)鯉魚(yú)肝、腎抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of BaP exposure on capability of anti-oxidative in the liver and kidney of the carp
由圖3 可知,試驗(yàn)30 d 后,與CK1 相比,CK2 肝、腎特異性免疫能力無(wú)顯著性差異,而處理組(T1、T2、T3)鯉魚(yú)肝、腎的特異性免疫能力均受到一定的影響。與CK1 相比,處理組肝組織的AKP、ACP、LZM 和PO活性總體均呈先上升后下降的趨勢(shì)。其中T1 肝組織的AKP 活性較CK1 上升3.23%,T2、T3 肝組織AKP活性較CK1 分別下降3.96%和9.01%,且T3 肝組織的AKP 活性顯著低于CK1。與CK1 相比,T1 肝組織的ACP 活性上升1.89%,而T2、T3 肝組織的ACP 活性分別下降2.64%、7.53%,且T3 肝組織的ACP 活性顯著低于CK1。與CK1 相比,T1、T2 肝組織的LZM 活性分別上升3.49%、1.98%,而T3 肝組織的LZM 活性顯著下降4.66%。與CK1 相比,T1、T2 肝組織的PO活性分別上升5.29%、0.18%,而T3 肝組織的PO 活性顯著下降8.61%。與CK1 相比,T1 腎組織的AKP活性升高1.76%,而T2、T3 腎組織的AKP 活性分別下降2.30%、5.58%,且均顯著低于CK1。與CK1 相比,T1、T2 腎組織的ACP 活性分別升高6.21%、2.07%,而T3 腎組織ACP 活性顯著下降7.53%。與CK1 相比,T1 腎組織LZM 活性升高1.27%,T2、T3 腎組織LZM 活性分別下降0.98%、4.65%,且T3 顯著低于CK1。T1、T2 腎 組 織PO 活 性 較CK1 分 別 升 高2.58%、1.41%,而T3 腎組織PO 活性顯著下降6.91%。
圖3 BaP 暴露對(duì)鯉魚(yú)肝、腎非特異性免疫能力的影響Fig.3 Effect of BaP exposure on capability of non-specific immunity in the liver and kidney of the carp
相關(guān)性分析表明,暴露30 d 后,BaP 暴露濃度與肝SOD、CAT 活性呈負(fù)相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別為-0.602、-0.673,P<0.01),與MDA 含量呈正相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.638,P<0.01)。BaP 暴露濃度與腎組織SOD、GSH 活性呈負(fù)相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別為-0.531、-0.481,P<0.05),與MDA 含量呈正相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.804,P<0.01)。BaP 暴露濃度與肝AKP、ACP、PO 活性呈負(fù)相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別為-0.735、-0.596、-0.665,P<0.01),與LZM 活性呈負(fù)相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.537,P <0.05)。BaP 暴露濃度與腎組織AKP、ACP、PO 活性呈負(fù)相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.590、-0.461、-0.523,P <0.05),與LZM 活性呈負(fù)相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.607,P<0.01)。
由圖4 可知,CK1 肝細(xì)胞以中央靜脈為中心,呈放射狀排列,細(xì)胞呈近圓形,形狀較規(guī)則,界線(xiàn)清晰,核多位于細(xì)胞中央。CK2 的肝細(xì)胞形態(tài)正常,排列比較規(guī)則,界限清楚,核清晰可見(jiàn)。T1 肝細(xì)胞排列紊亂,可見(jiàn)肝細(xì)胞空泡變性,部分細(xì)胞界限模糊,少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)萎縮,T2 肝組織結(jié)構(gòu)輕度紊亂,肝細(xì)胞空泡變性,細(xì)胞界限模糊,T3 肝細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞界限模糊,肝細(xì)胞空泡變性,部分細(xì)胞萎縮。
由圖5 可知,CK1、CK2 均表現(xiàn)為腎組織結(jié)構(gòu)完整,腎小管細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,界限明顯。T1 腎組織結(jié)構(gòu)輕度紊亂,腎小管管腔輕微狹窄,T2 腎組織結(jié)構(gòu)紊亂,腎小管管腔狹窄,T3 腎組織結(jié)構(gòu)紊亂程度加重,可見(jiàn)腎小管萎縮。
圖4 BaP 暴露對(duì)鯉魚(yú)肝組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of BaP exposure on liver structure of carp
圖5 BaP 暴露對(duì)鯉魚(yú)腎組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effect of BaP exposure on kidney structure of carp
正常情況下,生物體具有生成自由基和消除自由基的動(dòng)態(tài)平衡能力。受到外源污染物脅迫時(shí),生物體內(nèi)的這種平衡可能被打破,導(dǎo)致體內(nèi)自由基增多,進(jìn)而引起損傷。此時(shí)生物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)會(huì)起到防御作用,其中SOD 可以使超氧化物陰離子(O2-)轉(zhuǎn)化為H2O2和O2;CAT 能很快分解H2O2使其轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O和O2;GSH 能夠使H2O2還原為H2O,而其自身被氧化為氧化型谷胱甘肽(glutathione oxidized,GSSG),GSSG在谷胱甘肽還原酶的作用下,被還原成GSH,以維持清除體內(nèi)自由基的過(guò)程。MDA 是由自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化作用生成的分解物質(zhì),其含量可以反映機(jī)體細(xì)胞受自由基危害的情況[14,19-23]。本研究中,與CK1相比,不同濃度BaP 作用于鯉魚(yú)30 d 后,鯉魚(yú)的抗氧化酶活性和MDA 含量均呈現(xiàn)不同程度的變化,肝、腎組織中SOD、CAT、GSH 活性均呈先上升后下降趨勢(shì),而MDA 含量呈先下降后升高趨勢(shì),這與黃周英等[24]和曹謹(jǐn)玲等[25]的研究結(jié)果相似。這可能是由于低濃度BaP 暴露使鯉魚(yú)體內(nèi)自由基的生成與消除失衡,刺激了機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng),促使其抗氧化能力代償性增強(qiáng)去消除體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)量自由基,但隨著B(niǎo)aP 濃度繼續(xù)升高后,體內(nèi)自由基也持續(xù)積累,細(xì)胞損傷加重,使鯉魚(yú)抗氧化系統(tǒng)的清除功能趨于飽和,進(jìn)而表現(xiàn)出SOD、CAT、GSH 活性降低、MDA 含量上升。
在魚(yú)類(lèi)健康養(yǎng)殖領(lǐng)域,關(guān)于水體中污染物對(duì)魚(yú)類(lèi)免疫系統(tǒng)影響的研究是非常重要的。雖然魚(yú)類(lèi)屬于低等脊椎動(dòng)物,但已擁有免疫的基本特性。非特異性免疫在魚(yú)類(lèi)的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用,其中魚(yú)類(lèi)血液中的NBT 陽(yáng)性細(xì)胞起著非常關(guān)鍵的作用,其吞噬能力的高低可以反映魚(yú)類(lèi)非特異性免疫能力的強(qiáng)弱,因此,對(duì)于NBT 陽(yáng)性細(xì)胞的檢測(cè)可以反映機(jī)體的非特異性細(xì)胞免疫狀態(tài)[14,26]。研究表明,水體中污染物可以引起魚(yú)類(lèi)NBT 陽(yáng)性細(xì)胞的下降[13]。本研究也發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,處理組(T1、T2、T3)的NBT 陽(yáng)性細(xì)胞均表現(xiàn)出顯著下降趨勢(shì),且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系,說(shuō)明BaP 暴露能夠使鯉魚(yú)的非特異性細(xì)胞免疫能力下降。LZM 能水解革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁的粘肽乙酰氨基多糖,并使之裂解釋放,破壞和消除侵入機(jī)體的異物,因此LZM 是生物體極為重要的非特異性免疫因子,其活力也是衡量機(jī)體免疫狀態(tài)的指標(biāo)之一[27]。PO 作為生物體液免疫的重要因子廣泛分布于動(dòng)物體內(nèi),可以通過(guò)包裹和黑化而限制外源物引起的損傷,從而達(dá)到提高防御能力的作用[14,18]。劉睿智等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)BaP 對(duì)褐菖鮋腎臟、脾臟的LZM 和PO 活性均有一定影響,且隨著B(niǎo)aP 濃度的增加,LZM 和PO 活性均呈先上升后下降趨勢(shì),這與本研究結(jié)果基本一致。這可能是由于BaP 為低濃度時(shí),魚(yú)體產(chǎn)生較強(qiáng)的應(yīng)激反應(yīng),在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)下溶菌酶和酚氧化酶水平升高,而B(niǎo)aP 為高濃度時(shí),魚(yú)體的免疫機(jī)能逐漸耗竭,酶水平降低。ACP、AKP 屬于磷酸單酯酶,是廣泛分布在機(jī)體內(nèi)的重要代謝調(diào)控酶。ACP 和AKP 作為動(dòng)物溶酶體酶的重要組成部分, 在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,對(duì)動(dòng)物生存具有重要意義[14,28-30]。本研究中,與對(duì)照組相比,鯉魚(yú)肝、腎組織ACP、AKP 活性在BaP 低濃度暴露情況下呈升高趨勢(shì),這可能是由于在BaP 低濃度暴露時(shí)鯉魚(yú)肝、腎組織中的抗應(yīng)激水平得以提升,同時(shí)免疫能力增強(qiáng),而高濃度BaP 作用時(shí)造成的組織細(xì)胞損傷大于其免疫能力,從而導(dǎo)致ACP、AKP 活性受到抑制。研究發(fā)現(xiàn)BaP 作用于生物體后會(huì)產(chǎn)生損傷作用。馮濤等[31]研究表明,BaP 可以造成大彈涂魚(yú)肝細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)胞器的損傷;翁朝紅等[32]也發(fā)現(xiàn)BaP 作用于黑鯛后,會(huì)導(dǎo)致其肝、脾、腸組織結(jié)構(gòu)受到不同程度的損害,且隨著B(niǎo)aP 暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。本研究結(jié)果也表明BaP 暴露能造成鯉魚(yú)肝、腎組織結(jié)構(gòu)不同程度的損害,且損害程度隨著B(niǎo)aP 濃度的升高而加重,這可能是由于BaP 作用于機(jī)體后,在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物會(huì)引發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性作用,且隨著暴露濃度的增加,當(dāng)毒性作用超過(guò)機(jī)體抵抗力的時(shí)候可能會(huì)使機(jī)體造成的損傷進(jìn)一步加重[33-35]。
綜上所述,水體中的一定濃度的BaP 對(duì)鯉魚(yú)肝、腎組織抗氧化酶(SOD、CAT、GSH)活性、MDA 含量、免疫相關(guān)酶(ACP、AKP、LZM、PO)活性和NBT 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及肝、腎組織結(jié)構(gòu)均有不同程度的影響,但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
本研究表明,水體中BaP 對(duì)鯉魚(yú)肝、腎組織抗氧化能力、非特異性免疫能力和NBT 陽(yáng)性細(xì)胞以及組織結(jié)構(gòu)均有不同程度的影響,且BaP 對(duì)這些影響存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。