紫外光與脈沖強(qiáng)光照射麥角甾醇轉(zhuǎn)化VD2研究

楊 開(kāi) 李 珅 孫培龍

(浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程系,浙江 杭州 310000)

維生素D(vitamin D,VD)作為人體生長(zhǎng)發(fā)育必需的一種類(lèi)固醇激素[1],能夠調(diào)節(jié)人體內(nèi)鈣和磷的代謝,并影響細(xì)胞增殖分化[2]。VD 族中主要活性形式為VD2和VD3,其中VD3主要通過(guò)存在于動(dòng)物表皮和真皮內(nèi)的7-脫氫膽固醇經(jīng)紫外照射發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化而生成,是人體能夠自身合成的一類(lèi)激素；VD2則主要通過(guò)存在于食用菌、動(dòng)物肝臟、酵母菌中的麥角甾醇經(jīng)紫外線(xiàn)照射發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化而生成[3-4]。以往研究側(cè)重于嬰幼兒缺乏VD 導(dǎo)致的佝僂病及高齡人群的軟骨病和骨質(zhì)疏松癥[5-6],但近年來(lái)隨著研究的不斷深入,逐步發(fā)現(xiàn)VD 缺乏也是罹患癌癥、自發(fā)性免疫疾病、傳染病、心血管疾病和精神疾病等多種常見(jiàn)疾患的關(guān)鍵誘因[7-8]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),全球性VD 不足的發(fā)生率為30%～50%[9-10],全球數(shù)十億人存在VD 不足或缺乏狀態(tài),且呈逐年上升趨勢(shì),VD 的缺乏已成為全球性公共健康問(wèn)題之一。由于不同地區(qū)光照時(shí)間的長(zhǎng)短不同,導(dǎo)致部分常年缺少光照地區(qū)的人群普遍出現(xiàn)內(nèi)源性VD3合成不足,因此,對(duì)于如何快速有效提高人體外源性VD2的攝入顯得越發(fā)重要。而食用菌中富含的VD2源-麥角甾醇,是良好的VD2來(lái)源之一。

野生或栽培的食用菌中均含有豐富的麥角甾醇,經(jīng)紫外光照射后可轉(zhuǎn)化為VD2,是很好的VD2來(lái)源之一。紫外按波段可分為UVA(320 ～400 nm)、UVB(290～320 nm)和UVC(200～275 nm)。經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間的光照,麥角甾醇會(huì)生成光甾醇、速甾醇等副產(chǎn)物。Phillips 等[11]研究發(fā)現(xiàn)照射環(huán)境對(duì)食用菌中麥角甾醇轉(zhuǎn)化VD2過(guò)程有重要影響；Wittig 等[12]發(fā)現(xiàn)不同UV波段對(duì)食用菌麥角甾醇轉(zhuǎn)化VD2過(guò)程有不同影響；胡彬彬等[13]、孫夢(mèng)姣等[14]以UV 燈分別輻照不同時(shí)期、不同部位的食用菌,發(fā)現(xiàn)食用菌不同部位的麥角甾醇含量不同,轉(zhuǎn)化效果也不同。上述關(guān)于麥角甾醇轉(zhuǎn)化VD2的研究均以UV 燈作為光源對(duì)食用菌麥角甾醇進(jìn)行照射處理,生成VD2的得率在3.21%～4.42%之間,同時(shí)伴隨光甾醇、速甾醇等副產(chǎn)物的生成[15-16],增加了后期提純的難度。

脈沖強(qiáng)光(intense pulsed light,IPL)殺菌技術(shù)是近年出現(xiàn)的一種利用瞬間放電的脈沖工程技術(shù)和特殊的惰性氣體,對(duì)食品表面、包裝材料及器械進(jìn)行快速滅菌的非熱物理殺菌新技術(shù)[17]。它利用惰性氣體燈發(fā)出與太陽(yáng)光譜相近、波譜范圍由紫外線(xiàn)至紅外線(xiàn)區(qū)域的強(qiáng)烈脈沖閃光殺滅固體表面、氣體和透明液體中的微生物[18],具有高能量、高穿透性的特點(diǎn)[19]。

本試驗(yàn)采用UVC 和IPL 兩種光照處理手段對(duì)麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液和食用菌麥角甾醇提取液進(jìn)行麥角甾醇轉(zhuǎn)化VD2研究,觀察照射能量與后期反應(yīng)對(duì)VD2轉(zhuǎn)化效率及副產(chǎn)物的影響,以期為食用菌麥角甾醇轉(zhuǎn)化VD2研究及相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢 菇(Agaricus bisporus)、 猴 頭 菇(Hericium erinaceus)、香菇(Lentinus edodes)、灰樹(shù)花(Grifola frondosa),4 種食用菌均為干品子實(shí)體,由浙江省慶元縣濛州有機(jī)食用菌產(chǎn)品有限公司提供。

麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品、VD2標(biāo)準(zhǔn)品,上海阿拉丁試劑有限公司；色譜純甲醇和二氯甲烷,天津四友化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇、氫氧化鉀等其余試劑均為分析純,上海凌峰試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Waters1525 型高效液相色譜分析儀,美國(guó)Waters有限公司；Cosmosil C18高效液相色譜柱(250 mm×4.6 mm),北京英萊克科技發(fā)展有限公司；26 W 短波段紫外燈管(波長(zhǎng)253.7 nm),雪萊特光電科技股份有限公司；YE-01 IPL 照射箱(26 W),常州蘭諾有限公司；ME204E 電子天平,梅特勒-托利多精密儀器制造公司；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠；DKS24 型電熱恒溫水浴鍋,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV-Int150 紫外能量計(jì),深圳致佳儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 精確稱(chēng)取麥角甾醇、VD2兩種標(biāo)準(zhǔn)品各100 mg 溶于無(wú)水乙醇,配制成1.0 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)母液,然后將兩種標(biāo)準(zhǔn)母液分別稀釋成0、25、50、100、200、400 μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)液,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.2 食用菌中麥角甾醇的提取 參照楊安倫等[20]、張萱等[21]的方法并略作改進(jìn)。以雙孢菇麥角甾醇提取率為響應(yīng)值,提取溶劑(乙醇)的濃度、料液比、提取時(shí)間和提取溫度為考察因素,采用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面分析方法,優(yōu)化食用菌麥角甾醇提取工藝條件,并采用此優(yōu)化提取工藝分別對(duì)猴頭菇、香菇、灰樹(shù)花3 種食用菌中的麥角甾醇進(jìn)行提取和樣品制備。

1.3.2.1 提取溶劑對(duì)食用菌中麥角甾醇提取效果的影響 精確稱(chēng)取雙孢菇干粉0.2 g,依次精密加入40%、60%、80%、100%的乙醇溶液各4.0 mL,置于80℃水浴提取60 min,待冷卻后過(guò)濾,濾液用無(wú)水乙醇定容至10 mL,然后進(jìn)行麥角甾醇的含量測(cè)定及提取量分析。按照公式計(jì)算麥角甾醇的提取量：

1.3.2.2 提取溫度對(duì)食用菌中麥角甾醇提取效果的影響 精確稱(chēng)取雙孢菇干粉0.2 g,準(zhǔn)確加入4.0 mL無(wú)水乙醇,分別在20、40、60、80℃水浴中提取60 min,待冷卻后過(guò)濾,濾液用無(wú)水乙醇定容至10 mL,測(cè)定提取液中麥角甾醇的含量。

1.3.2.3 提取時(shí)間對(duì)食用菌中麥角甾醇提取效果的影響 精確稱(chēng)取雙孢菇干粉0.2 g,準(zhǔn)確加入4.0 mL無(wú)水乙醇,在80℃水浴鍋中分別提取30、60、90、120 min,冷卻后過(guò)濾,濾液用無(wú)水乙醇定容至10 mL,測(cè)定提取液中麥角甾醇的含量。

1.3.2.4 料液比對(duì)食用菌中麥角甾醇提取效果的影響 精確稱(chēng)取雙孢菇干粉0.2 g,以料液比1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40 分別加入相應(yīng)體積的無(wú)水乙醇,置于80℃水浴提取60 min,待冷卻后過(guò)濾,濾液用無(wú)水乙醇定容至10 mL,測(cè)定提取液中麥角甾醇的含量。

1.3.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,以提取時(shí)間(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、乙醇濃度(D)作為4 個(gè)考察因素,雙孢菇麥角甾醇提取量(Y)為指標(biāo),應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與因素見(jiàn)表1。

1.3.2.6 皂化劑堿濃度對(duì)食用菌中麥角甾醇提取效果的影響 精確稱(chēng)取雙孢菇干粉0.2 g 各4 份于具塞試管中,每管內(nèi)均加入4.0 mL 無(wú)水乙醇和1.0 mL 皂化液(4 種不同濃度的皂化液依次為2、3、4、5 mol·L-1KOH 溶液,每個(gè)具塞試管中添加的皂化液濃度不同),于80℃處理60 min 后,用95%乙醇充分洗滌并收集濾液。濾液經(jīng)濃縮干燥后加入10 mL 萃取劑(5 mL 正己烷和5 mL 水),充分振蕩后靜置提取20 min,用移液管吸取正己烷層2.0 mL,無(wú)水乙醇溶解并定容至10 mL,然后測(cè)定定容后溶液中的麥角甾醇含量。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.2.7 醇?jí)A對(duì)食用菌中麥角甾醇提取效果的影響 精確稱(chēng)取雙孢菇干粉0.2 g 各4 份于具塞試管,分別 加 入2.0、 1.3、 1.0、 0.8 mL 的 KOH 溶 液(4 mol·L-1)和4.0 mL 無(wú)水乙醇,于80℃處理60 min 后,用95%乙醇充分洗滌并收集濾液。濾液經(jīng)濃縮干燥后加入10 mL 萃取劑(5.0 mL 正己烷和5.0 mL 水),充分振蕩后靜置提取20 min,用移液管吸取正己烷層2.0 mL,無(wú)水乙醇溶解并定容至10 mL,然后測(cè)定容后溶液中的麥角甾醇含量。

根據(jù)優(yōu)化后的雙孢菇麥角甾醇提取條件,分別對(duì)香菇、灰樹(shù)花、猴頭菇3 種食用菌中的麥角甾醇進(jìn)行提取,提取液保留備用。

1.3.3 光轉(zhuǎn)化VD2的效果分析

1.3.3.1 UVC 照射處理 分別取麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液(1.0 mg·mL-1)及上述食用菌麥角甾醇提取液各20 mL 于50 mL 燒杯中,用UVC 依次進(jìn)行5、10、30、60 min 的照射處理,應(yīng)用紫外能量計(jì)測(cè)得照射能量分別為0.033、0.069、0.226、0.656 J·cm-2。

1.3.3.2 IPL 照射處理 分別稱(chēng)取麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液(1.0 mg·mL-1)及上述食用菌麥角甾醇提取液各20 mL 于50 mL 燒杯中,用IPL 依次進(jìn)行5、10、30、60 min的照射處理,應(yīng)用紫外能量計(jì)測(cè)得照射能量分別為0.098、0.208、0.600、1.108 J·cm-2。

1.3.3.3 麥角甾醇提取液的熱反應(yīng)處理 將照射后的麥角甾醇提取液的杯口覆蓋保鮮膜,避光條件下80℃水浴30 min,冷卻至室溫后用無(wú)水乙醇定容至10 mL,進(jìn)行麥角甾醇和VD2含量的分析測(cè)定。

1.3.3.4 熱處理的避光貯藏 將上述熱處理的樣品液避光條件下放置24 h,用無(wú)水乙醇定容至10 mL,進(jìn)行麥角甾醇和VD2含量的分析測(cè)定。

1.3.4 麥角甾醇、VD2含量的檢測(cè) 參考Guan 等[22]的方法。分別將未經(jīng)照射的麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液(空白液)、UVC、IPL 照射處理后的麥角甾醇提取液用0.45 μm 濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC 分析。測(cè)定條件：流動(dòng)相A(甲醇∶水=80 ∶20,v/v)和流動(dòng)相B(甲醇∶二氯甲烷=75 ∶25,v/v),梯度洗脫過(guò)程：0 ～5 min,50%～80%B；5 ～15 min,80%～100% B；15 ～20 min,50% B；流速0.8 mL·min-1, 進(jìn) 樣 體 積10 μL, 檢 測(cè) 波 長(zhǎng)254 nm。

根據(jù)樣品測(cè)定的色譜峰面積,在相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出對(duì)應(yīng)的含量, 按照公式計(jì)算VD2得率：

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)圖像處理；SPSS 16.0 和Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和差異顯著性分析,P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥角甾醇與VD2 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

由圖1 可知,VD2標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為15.486 min,麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為17.178 min。以進(jìn)樣濃度(X,mg·mL-1)為橫坐標(biāo),相應(yīng)的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析,麥角甾醇、VD2含量的回歸方程分別為：Y1=139 95X1-359 25,R2=0.999 61；Y2=183 91X2-857 30, R2=0.999 86。

2.2 食用菌中麥角甾醇的提取

2.2.1 提取工藝條件的優(yōu)化 食用菌中的麥角甾醇易溶于醇類(lèi)溶劑,如楊安倫等[20]、張萱等[21]及馬元等[23]對(duì)靈芝和金蟬花中麥角甾醇進(jìn)行提取時(shí)發(fā)現(xiàn),甲醇作為提取劑的提取效果優(yōu)于乙醇,但甲醇有一定毒性[24],故選用乙醇作為提取溶劑。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明,提取時(shí)間為60 min 時(shí),雙孢菇中的麥角甾醇提取量最大,而后逐漸下降,說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間加熱會(huì)導(dǎo)致麥角甾醇提取量減少,因而選用60 min 作為最佳提取時(shí)間(圖2-A)；當(dāng)料液比為1 ∶20 時(shí),雙孢菇中麥角甾醇提取量最大,料液比超過(guò)1 ∶20 后麥角甾醇的提取量趨于平穩(wěn),考慮到溶劑和后處理成本,選用料液比為1 ∶20(圖2-B)；隨著提取溫度的升高,雙孢菇中麥角甾醇的提取量也隨之增加,當(dāng)提取溫度為60℃時(shí),麥角甾醇的提取量達(dá)到最大,隨后有所逐漸下降,故選用60℃作為優(yōu)化提取溫度(圖2-C)；隨著乙醇濃度的增加,雙孢菇干粉中的麥角甾醇提取量也隨之增多,因而選擇無(wú)水乙醇作為提取溶劑(圖2-D)。

圖1 VD2 與麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of VD2and ergosterol standard substances

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析 根據(jù)Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,綜合分析單因素,選取對(duì)食用菌麥角甾醇提取率影響較大的提取時(shí)間(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、乙醇濃度(D)作為考察因素,雙孢菇麥角甾醇提取率(Y)為指標(biāo),設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 單因素對(duì)雙孢蘑菇麥角甾醇提取效果的影響Fig.2 Effect of single factor on the extraction of ergosterol from Agaricus bisporus

對(duì)表2 進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面分析,建立多元二次響應(yīng)面回歸模型：

由表3 可知,方程一次項(xiàng)中C、D 為顯著因素；方程二次項(xiàng)中B2和C2為極顯著因素,A2為顯著因素；A與B 之間交互作用顯著。由方差分析可知,模型P＜0.000 1,響應(yīng)面回歸模型達(dá)到高度顯著性水平。決定系數(shù)R2=0.973 2,修正相關(guān)系數(shù)平方為0.973 2,說(shuō)明該模型能反映97.3%響應(yīng)值的變化,失擬項(xiàng)為0.359 1,不顯著,說(shuō)明模型擬合程度較好,試驗(yàn)誤差小,可以很好地描述各因素與響應(yīng)值的真實(shí)關(guān)系。影響食用菌麥角甾醇提取率的各因素按影響大小排序依次為C(提取溫度)＞D(乙醇濃度)＞A(提取時(shí)間)＞B(料液比)。

圖3 分別顯示了提取時(shí)間(A)、提取料液比(B)、提取溫度(C)及乙醇濃度(D)對(duì)雙孢菇麥角甾醇提取率(Y)的影響及四因素之間的交互作用。在響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中,響應(yīng)面曲面越陡、等高線(xiàn)越密集,各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著。結(jié)果表明,在雙孢菇麥角甾醇常規(guī)提取工藝過(guò)程中,提取時(shí)間(A)、料液比(B)、提取溫度(C)及乙醇濃度(D)之間的交互作用均不顯著。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.2.3 提取參數(shù)優(yōu)化及模型驗(yàn)證 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法優(yōu)化所得的雙孢菇麥角甾醇的提取工藝條件為：提取時(shí)間60 min、乙醇濃度100%、料液比1 ∶19.73 g·mL-1、提取溫度80.16℃,此條件下雙孢菇中麥角甾醇理論提取率為3.64 mg·g-1。為方便實(shí)際操作采用提取時(shí)間60 min、乙醇濃度100%、料液比1 ∶20 g·mL-1、提取溫度80℃的提取工藝條件提取3次,麥角甾醇提取率為3.59 mg·g-1。

2.2.4 食用菌中麥角甾醇提取液的皂化處理 由圖4 可知,當(dāng)V(乙醇) ∶V(KOH)= 4 ∶1、KOH 濃度為4 mol·L-1時(shí),雙孢菇的麥角甾醇提取液的皂化效果較好,提取率為3.19 mg·g-1,低于未皂化處理提取液中的提取率(3.59 mg·g-1),可能是由于皂化反應(yīng)對(duì)游離的麥角甾醇產(chǎn)生了消耗,因此在后續(xù)對(duì)其他食用菌麥角甾醇進(jìn)行提取時(shí)采用無(wú)皂化提取方式。

2.3 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液的轉(zhuǎn)化反應(yīng)

2.3.1 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液的光、熱轉(zhuǎn)化處理 由圖5-A-1、B-1 可知,經(jīng)60 min 的UVC、IPL 光照轉(zhuǎn)化處理,標(biāo)準(zhǔn)液中的麥角甾醇含量均減少,同時(shí)出現(xiàn)了微量的VD2及其前體,說(shuō)明麥角甾醇在外部能量的照射作用下,產(chǎn)生了轉(zhuǎn)化反應(yīng)。UVC 處理組中VD2含量為0.007 4 mg·mL-1,得率為0.74%；IPL 處理組中VD2含量為0.019 mg·mL-1,得率為1.90%。

經(jīng)兩組光照處理后的麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液,再經(jīng)30 min、80℃熱處理,其VD2含量明顯提高,且雜質(zhì)峰含量減小,說(shuō)明加熱處理有效促進(jìn)了VD2各種前體形式向VD2的轉(zhuǎn)化,此時(shí),UVC 處理組中的VD2含量為0.023 3 mg·mL-1,VD2得率為2.33%；IPL 處理組中的VD2含量為0.021 mg·mL-1,得率2.19%(圖5-A-2、B-2)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證VD2前體能否自發(fā)轉(zhuǎn)化為VD2,將經(jīng)光照、加熱處理后的麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液在避光室溫條件下放置24 h,發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)液中雜質(zhì)峰逐漸減少,此時(shí),UVC 處理組中的VD2含量為0.064 mg·mL-1,得率為9.68%,但在8.971 min 出現(xiàn)明顯的雜質(zhì)峰；IPL 處理組中的VD2含量為0.041 mg·mL-1,得率為7.34%；IPL 處理組中VD2含量較UVC 處理組低,但其雜質(zhì)峰少。將標(biāo)準(zhǔn)液置于避光處繼續(xù)保存24 h,發(fā)現(xiàn)溶液中VD2含量未發(fā)生明顯變化,表明光、熱處理再經(jīng)避光放置24 h 后的麥角甾醇向VD2的轉(zhuǎn)化基本完成。

2.3.2 光照時(shí)間對(duì)麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液VD2得率的影響 由圖6 可知,隨著光反應(yīng)、熱反應(yīng)的進(jìn)行,麥角甾醇迅速向VD2轉(zhuǎn)化。光照前期,IPL 處理組中麥角甾醇的轉(zhuǎn)化效率優(yōu)于UVC 處理組,但隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng),UVC 處理組中的VD2轉(zhuǎn)化率逐漸增大,當(dāng)光照時(shí)間為60 min 時(shí),其VD2得率達(dá)到9.68%,明顯高于IPL 處理組(VD2得率為7.34%)。

2.3.3 加熱時(shí)間對(duì)麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液VD2得率的影響 麥角甾醇在經(jīng)過(guò)光照處理后,進(jìn)一步形成VD2前體[25],該前體經(jīng)熱效應(yīng)重排進(jìn)一步生成VD2,此過(guò)程可自發(fā)進(jìn)行,但所需時(shí)間較長(zhǎng)[26]。由圖7 可知,80℃水浴加熱處理光照后的麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液,加熱30 min 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)液中VD2得率快速上升,繼續(xù)延長(zhǎng)加熱時(shí)間,VD2得率逐漸開(kāi)始下降,說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間處于高溫條件下,VD2前體可能會(huì)發(fā)生歧化反應(yīng),使得VD2得率降低。

2.4 食用菌麥角甾醇提取液的光、熱轉(zhuǎn)化處理

依據(jù)上述食用菌麥角甾醇優(yōu)化提取工藝條件和麥角甾醇轉(zhuǎn)化為VD2的光、熱轉(zhuǎn)化條件,分別對(duì)猴頭菇、灰樹(shù)花、香菇、雙孢菇4 種食用菌的麥角甾醇提取液進(jìn)行VD2轉(zhuǎn)化。由表4 可知,4 種食用菌提取液中的麥角甾醇含量差距較大,提取量依次為猴頭菇＞雙孢菇＞香菇＞灰樹(shù)花,灰樹(shù)花的麥角甾醇提取量最低,為2.13 mg·g-1,猴頭菇的麥角甾醇提取量最高,為4.41 mg·g-1。光照處理后,各食用菌麥角甾醇提取液轉(zhuǎn)化生成的VD2含量也明顯不同,UVC 處理組的VD2得率明顯高于IPL 處理組,但2 種光照處理食用菌麥角甾醇提取液的VD2得率均低于同樣處理?xiàng)l件下的麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液,可能是因?yàn)槭秤镁溄晴薮继崛∫旱某煞州^為復(fù)雜,非麥角甾醇類(lèi)物質(zhì)對(duì)光照也有一定的屏蔽作用。

正常的VD 推薦日攝入量(RDI)為400 IU,即10 μg[27]。以4 種食用菌子實(shí)體的VD2得率計(jì)算,則采用UVC 方式需要的食用菌干品量分別為猴頭菇27.0 mg、雙孢菇38.4 mg、香菇62.5 mg、灰樹(shù)花71.4 mg,滿(mǎn)足日常所需VD；而IPL 處理方式需要的食用菌干品量為猴頭菇34.4 mg、雙孢菇41.6 mg、香菇83.3 mg、灰樹(shù)花90.9 mg。

圖3 各因素及相互作用對(duì)麥角甾醇提取量的響應(yīng)面圖及等高線(xiàn)圖Fig.3 Response surface and contour plots of various factors and their mutual interactions on the yield of extracted ergosterol

圖4 雙孢菇麥角甾醇皂化處理Fig.4 Saponification treatment on ergosterol in Agaricus bisporus

表3 回歸方程各項(xiàng)的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

圖5 不同處理?xiàng)l件對(duì)麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液轉(zhuǎn)化VD2 的影響Fig.5 Effect of different treatment conditions on the conversion of ergosterol standard solution to VD2

圖6 光照時(shí)間對(duì)麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液轉(zhuǎn)化VD2 的影響Fig.6 Effect of irradiation time on the conversion of ergosterol standard solution to VD2

圖7 加熱時(shí)間對(duì)麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液轉(zhuǎn)化VD2 的影響Fig.7 Effect of heating time on the conversion of ergosterol standard solution to VD2

表4 光照、熱處理對(duì)食用菌麥角甾醇提取液轉(zhuǎn)化VD2 的影響Table 4 Effect of light and heating treatment on the transformation of VD2 by edible ergosterol extract

3 討論

食用菌麥角甾醇包括游離麥角甾醇和細(xì)胞膜中的結(jié)合麥角甾醇[28]。本研究結(jié)果表明,皂化后的提取液中麥角甾醇含量少于未皂化處理,這可能是由于麥角甾醇高溫下與醇?jí)A發(fā)生氧化反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致麥角甾醇提取率降低,故本試驗(yàn)采用非皂化處理方式,獲得猴頭菇、雙孢菇、香菇、灰樹(shù)花中麥角甾醇提取量為分別4.41、3.55、2.42、2.13 mg·g-1,這與Phillips 等[11]的試驗(yàn)結(jié)果接近。

本研究采用UVC、IPL 對(duì)麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行光照處理,發(fā)現(xiàn)經(jīng)UVC 處理的麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液在8.803 min 出現(xiàn)大的雜質(zhì)峰,而經(jīng)IPL 處理的標(biāo)準(zhǔn)液中副產(chǎn)物較少,說(shuō)明IPL 處理能夠有效減少麥角甾醇轉(zhuǎn)化過(guò)程中副產(chǎn)物的生成,有利于VD2產(chǎn)品的研發(fā)。本試驗(yàn)結(jié)果表明,麥角甾醇經(jīng)短時(shí)間光照處理后,大部分轉(zhuǎn)化為VD2前體,同時(shí)少量VD2前體會(huì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為VD2,再經(jīng)避光條件下熱處理,VD2前體可迅速轉(zhuǎn)化生成VD2。在參考白晨等[29]對(duì)香菇麥角甾醇提取液進(jìn)行UV 照射處理?xiàng)l件的基礎(chǔ)上,本研究對(duì)后期熱處理時(shí)間條件進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)80℃加熱30 min 可獲得較多的VD2。

本研究中,猴頭菇、雙孢菇、香菇、灰樹(shù)花4 種食用菌麥角甾醇提取液經(jīng)光照、加熱和24 h 貯藏處理,UVC 處理組的VD2得率分別為8.40%、7.35%、6.72%、7.62%； IPL 處 理 組 的 VD2得 率 分 別 為6.62%、6.79%、5.26%、5.43%。與UVC 處理組相比,IPL 處理組的VD2得率較低,但I(xiàn)PL 處理能針對(duì)性地促使麥角甾醇向VD2轉(zhuǎn)化,副產(chǎn)物生成量較少,降低了后期VD2分離純化及其產(chǎn)品研發(fā)的難度。此外,與麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液VD2得率相比,食用菌提取液VD2得率均較低,這可能是因?yàn)樘崛∫褐写嬖诘亩喾?、核苷酸等物質(zhì)會(huì)吸收或屏蔽部分光照能量,從而使得VD2轉(zhuǎn)化效率較低[30-31]。經(jīng)光照、加熱處理后,食用菌麥角甾醇提取液于室溫避光條件下放置24 h,發(fā)現(xiàn)放置期間VD2生成量逐漸增加,說(shuō)明麥角甾醇經(jīng)過(guò)光照、加熱處理轉(zhuǎn)化生成的VD2前體,后續(xù)進(jìn)一步自發(fā)向VD2轉(zhuǎn)化,但速率較為緩慢,且在放置24 h 后,提取液中VD2含量趨于穩(wěn)定,表明轉(zhuǎn)化反應(yīng)基本結(jié)束。本研究涉及的處理樣品均為液體,但VD2遇光、熱、氧等易降解,具有不穩(wěn)定性[32-33],故對(duì)于VD2及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)研究仍需進(jìn)一步探討溫度、氧氣、水分、日光等因素對(duì)VD2穩(wěn)定性的影響。

4 結(jié)論

IPL 與傳統(tǒng)UVC 光照處理均能有效促使麥角甾醇轉(zhuǎn)化成VD2,IPL 光照處理能夠在短時(shí)間內(nèi)促使大量麥角甾醇向VD2轉(zhuǎn)化,同時(shí)降低麥角甾醇轉(zhuǎn)化VD2過(guò)程中副產(chǎn)物的生成。IPL 照射處理可作為在以食用菌麥角甾醇作為原料工廠化生產(chǎn)VD2的過(guò)程中的光處理源。食用菌麥角甾醇提取液中VD2得率低于同等處理?xiàng)l件下麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)液中的VD2得率,這可能是因?yàn)橄鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)品,提取液中成分較為復(fù)雜,其他非麥角甾醇類(lèi)物質(zhì)對(duì)光照有一定的屏蔽作用。