冬瓜實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選與評(píng)價(jià)

葉新如 朱海生 林 琿 劉建汀 王 彬 陳敏氡 溫慶放

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心/福建省蔬菜工程技術(shù)研究中心,福建 福州 350013)

冬瓜(Benincasa hispida Cogn.)屬葫蘆科冬瓜屬一年生蔓生或架生草本植物[1]。冬瓜的花、葉、果皮、果肉、種子等可用于治療咳嗽、哮喘等疾病,均具有很好的藥食兼用價(jià)值[2-3]。同時(shí),冬瓜富含氨基酸、維生素C、酚類等活性物質(zhì),對(duì)預(yù)防慢性疾病作用顯著,且其不含脂肪,富含丙醇二酸,能有效抑制糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為脂肪[4-5]。目前對(duì)冬瓜的研究主要集中在栽培技術(shù)[6-7]、藥用開發(fā)[8-11]、營養(yǎng)價(jià)值[12-13]、遺傳育種[14-16]等方面,而關(guān)于冬瓜功能基因的克隆表達(dá)及基因組學(xué)的相關(guān)研究尚鮮見報(bào)道。隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,利用分子生物學(xué)技術(shù)闡明冬瓜功能成分和調(diào)控機(jī)理相關(guān)基因表達(dá)已成為研究重點(diǎn)。對(duì)冬瓜相關(guān)基因功能研究是開發(fā)利用這些基因的前提,而基因表達(dá)量的檢測是體現(xiàn)其功能的一個(gè)重要指標(biāo)。內(nèi)參基因作為檢測基因表達(dá)量變化的參照,對(duì)其篩選研究具有重要意義。

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR ( real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)是一種能夠?qū)δ繕?biāo)基因的表達(dá)量進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析的試驗(yàn)技術(shù),常用于各種目標(biāo)基因定量分析和基因表達(dá)量的研究[17]。該技術(shù)利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測整個(gè)PCR 反應(yīng)中每個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,能夠?qū)ζ鹗寄０鍦?zhǔn)確定量,與傳統(tǒng)的基因表達(dá)檢測方法相比,該技術(shù)具有適用性廣、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。目前,基因表達(dá)量的檢測較多涉及到應(yīng)用RT-qPCR 技術(shù),但RT-qPCR 相對(duì)定量表達(dá)結(jié)果的準(zhǔn)確性通常受RNA 產(chǎn)量、引物特異性、內(nèi)參基因等因素影響[18]。內(nèi)參基因是指在基因研究中作為內(nèi)部參照的基因,通常為管家基因,其在各細(xì)胞和組織中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定,在檢測目標(biāo)基因表達(dá)水平變化中需要利用內(nèi)參基因進(jìn)行校正,其穩(wěn)定性對(duì)RT-qPCR 結(jié)果的準(zhǔn)確性具有決定性影響[19-20]。常用的內(nèi)參基因有甘油醛-3-磷酸-脫氫酶基因(GAPDH)、微蛋白基因(TUB)等[21]。大量研究表明,內(nèi)參基因在不同試驗(yàn)條件下表達(dá)存在差異,不存在恒定不變的內(nèi)參基因[22-23],選擇表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因來校正和標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)基因的表達(dá)是有效應(yīng)用RT-qPCR 技術(shù)的基礎(chǔ)[24-25],因此篩選冬瓜不同組織和不同脅迫條件下穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)ρ芯科浠蚨勘磉_(dá)具有重要意義。

截至目前,國內(nèi)外關(guān)于冬瓜內(nèi)參基因篩選的研究報(bào)道僅有張金平等[26]研究發(fā)現(xiàn)節(jié)瓜經(jīng)鐮刀菌酸(fusaric acid,FA)脅迫后Actin 和F-box 表達(dá)穩(wěn)定,在節(jié)瓜不同組織中F-box 基因表達(dá)穩(wěn)定性最高,而在非生物脅迫和不同組織中冬瓜適合的內(nèi)參基因尚未見報(bào)道。本研究以黑皮冬瓜不同脅迫條件(低溫、高溫、干旱)下的葉片和不同組織(根、莖、葉、花)為材料,利用GeNorm、NormFinder 和BestKeeper 對(duì)7 個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析評(píng)價(jià),篩選合適的內(nèi)參基因,以期為冬瓜后續(xù)相關(guān)基因表達(dá)研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料黑皮冬瓜統(tǒng)一播種于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所福清市東張鎮(zhèn)蔬菜科研基地。穴盤育苗,待幼苗長至三葉一心時(shí)分別放入培養(yǎng)箱進(jìn)行處理。

試驗(yàn)處理共分為4 組,第1 組為4℃分別處理0、1、6、12、24 h,取1～2 片真葉；第2 組為42℃分別處理0、1、6、12、24 h,取1 ～2 片真葉；第3 組為26℃,光照16 h,分別斷水0、1、2、3、4 d 進(jìn)行干旱處理,使土壤含水率 分 別 為 92.50%、 79.61%、 68.19%、 56.20%、46.84%,取1 ～2 片真葉；第4 組為正常栽培條件,取根、莖、葉、花4 個(gè)部分。以上處理均設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。采樣后立即用液氮速凍,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)福建省農(nóng)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所蔬菜中心課題組前期對(duì)冬瓜轉(zhuǎn)錄組測序所得試驗(yàn)結(jié)果,篩選出28SrRNA、UBQ、RP Ⅱ、GAPDH、EF-1α、UBC21、TUA 7 個(gè)候選內(nèi)參基因,根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則,利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物(表1)。

表1 候選內(nèi)參基因引物序列Table 1 The primer sequence of candidate reference gene

1.2.2 總RNA 的提取和cDNA 的合成 利用通用植物總RNA 提取試劑盒[BioTeke(北京)公司]提取RNA,通過1%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000 分光光度計(jì)(美國賽默飛世爾科技公司)檢測總RNA 完整性和濃度。cDNA 合成按照PrimeScriptTMⅡ1stStrand cDNA Synthesis Kit 試劑盒[TaKaRa(日本)公司]操作說明書進(jìn)行。

1.2.3 內(nèi)參熒光定量PCR 擴(kuò)增 采用SYBR Green染料法,RT-qPCR 按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒[TaKaRa(日本)公司]操作說明書進(jìn)行,在7500 Real Time System 儀[ABI(美國)公司]上完成,樣品設(shè)3 次重復(fù)。反應(yīng)體系10 μL,包括2×SYBR Premix EX TaqTM5 μL、Primer F (10 μmol·L-1) 0.4 μL、Primer R(10 μmol · L-1) 0.4 μL、 ROX Reference Dye(10 μmol·L-1)0.2 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 2 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s,60℃退火34 s,40 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后進(jìn)行溶解曲線分析,溶解曲線程序：95℃15 s,60℃1 min,95℃15 s。

普通PCR 操作在GeneAmp PCR System 9000 儀[ABI(美國)公司]上完成,反應(yīng)體系20 μL,包括10×PCR buffer(含Mg2+) 2 μL、Primer F (10 μmol·L-1)1 μL、 Primer R (10 μmol·L-1) 1 μL、 dNTP (10 mmol·L-1) 1 μL、Taq (5U) 0.2 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 12.8 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸30 s,35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用GeNorm、NormFinder 和BestKeeper 軟件分析7 個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性。將RT-qPCR 獲得數(shù)據(jù)導(dǎo)出至Microsoft Excel 2010 中,并根據(jù)軟件要求對(duì)循環(huán)閾值(cycle threshold,CT)進(jìn)行轉(zhuǎn)換。每個(gè)軟件產(chǎn)生候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的度量值,可用于對(duì)內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序。GeNorm 軟件根據(jù)內(nèi)參基因平均表達(dá)穩(wěn)定值(average expression stability value,M)確定穩(wěn)定性,M值越小越穩(wěn)定,同時(shí)依據(jù)ⅤN/ⅤN+1確定最適內(nèi)參基因數(shù)量。NormFinder 軟件通過基因表達(dá)穩(wěn)定值(stability,S)對(duì)候選內(nèi)參基因排序,S 值最小的基因穩(wěn)定性最好[27]。BestKeeper 軟件主要比較標(biāo)準(zhǔn)方差(standard deviation, SD) 和皮爾遜相關(guān)系數(shù)(pearsonproduct-momentcorrelationcoefficient,R),SD 值小于1,R 值越接近1,內(nèi)參基因越穩(wěn)定[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 檢測

利用1%的瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)分別檢測總RNA 完整性和濃度?？俁NA 濃度范圍在245.3～535.7 ng·μL-1之間,OD260/OD280 值為1.8 ～2.0,表明提取的總RNA 適合于做進(jìn)一步的研究。

2.2 內(nèi)參基因PCR 檢測

利用普通PCR 對(duì)內(nèi)參基因特異性進(jìn)行檢測,結(jié)果表明,7 個(gè)內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一,大小與目標(biāo)片段相同,說明引物能特異性擴(kuò)增,不存在引物二聚體,適用于RT-qPCR 研究(圖1)。

圖1 冬瓜7 個(gè)候選內(nèi)參基因的RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Specificity of 7 candidate reference genes for RT-PCR amplification

2.3 冬瓜內(nèi)參基因RT-qPCR 分析

2.3.1 溶解曲線分析 以冬瓜cDNA 為模板,經(jīng)RTqPCR 擴(kuò)增,對(duì)候選內(nèi)參基因的引物溶解曲線分析,結(jié)果表明,7 個(gè)候選內(nèi)參基因引物特異性好,均為單峰,樣品間擴(kuò)增曲線重復(fù)性強(qiáng)(圖2)。

2.3.2 表達(dá)豐度分析 7 個(gè)候選內(nèi)參基因平均CT 值介于22.26～24.40 之間(圖3)。根據(jù)CT 值計(jì)算候選內(nèi)參基因表達(dá)水平,候選內(nèi)參基因在不同組織和不同脅迫條件下基因表達(dá)水平存在差異。GAPDH 在低溫和高溫脅迫條件下CT 值整體處于最低(圖4-A、B),表達(dá)量高,而RP ⅡCT 值整體處于最高,表達(dá)量最低；干旱處理2 h 時(shí),7 個(gè)內(nèi)參基因CT 值高于其他4 個(gè)處理,說明基因表達(dá)量最低(圖4-C)；在不同組織中,花中28SrRNA、UBQ、RP Ⅱ、EF-1α 的CT 值顯著低于其他組織中的CT 值(圖4-D),說明這4 個(gè)內(nèi)參基因在花中表達(dá)量相對(duì)較高。

2.4 冬瓜內(nèi)參基因的篩選

根據(jù)GeNorm 軟件得到的默認(rèn)變異系數(shù)(VN/VN+1)確認(rèn)最適內(nèi)參基因數(shù)目。0.15 為程序默認(rèn)的閾值,VN/VN+1＜0.15 時(shí),則認(rèn)為最佳的內(nèi)參基因數(shù)為N個(gè)。在低溫和高溫處理下,樣品VN/VN+1值均大于0.15,無法確定最適的樣品數(shù),這可能與樣品生理狀況、內(nèi)參基因穩(wěn)定性等因素有關(guān)。因此,低溫和高溫處理下選擇VN/VN+1最小值作為最適內(nèi)參數(shù)[15]；在干旱和不同組織條件下,V2/V3均小于0.15(表2)。因此,本試驗(yàn)最適的內(nèi)參基因均為2 個(gè)。

表2 GeNorm 軟件分析不同脅迫處理和不同組織的VN/VN+1Table 2 Analysis of VN/VN+1 in different stress treatments and tissues by GeNorm software

2.4.1 冬瓜不同脅迫條件處理內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性 利用GeNorm 軟件計(jì)算7 個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值,由表3 可知,冬瓜低溫脅迫處理不同時(shí)段M 值排序?yàn)镽P Ⅱ= EF-1α ＜UBC21 ＜UBQ ＜TUA ＜28SrRNA ＜GAPDH；高溫處理不同時(shí)段M 值排序?yàn)門UA= UBQ ＜UBC21 ＜EF-1α ＜GAPDH ＜RP Ⅱ＜28SrRNA；干旱處理不同時(shí)段M 值排序?yàn)門UA=UBQ ＜UBC21＜EF-1α＜28SrRNA＜GAPDH＜RP Ⅱ。在低溫處理下RP Ⅱ和EF-1α 的穩(wěn)定性最好,而28SrRNA 和GAPDH 的穩(wěn)定性差；在高溫處理和干旱處理下TUA和UBQ 的穩(wěn)定性均較好,適合作為內(nèi)參基因。

表3 GeNorm 軟件分析7 個(gè)候選內(nèi)參基因在不同脅迫條件下表達(dá)穩(wěn)定性Table 3 GeNorm ranking of the 7 candidate reference genes with respect to their expression stability under different stress conditions

圖2 7 個(gè)候選內(nèi)參基因RT-qPCR 溶解曲線Fig.2 Melting curves of 7 candidate reference genes for RT-qPCR amplification

圖3 7 個(gè)候選內(nèi)參基因平均CT 值分布Fig.3 Average CT value distribution of seven candidate internal reference genes

圖4 各候選基因在不同脅迫和不同組織中CT 值分布Fig.4 Distribution of CT values of candidate genes under different stress conditions and different tissue

根據(jù)NormFinder 軟件分析結(jié)果可知,在低溫處理?xiàng)l件下7 個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值S 排序?yàn)镋F-1α＜RP Ⅱ＜TUA＜28SrRNA＜UBC21＜UBQ＜GAPDH；高溫處理?xiàng)l件下7 個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值S 排序?yàn)門UA=UBQ＜GAPDH＜UBC21＜EF-1α＜RP Ⅱ＜28SrRNA；干旱處理?xiàng)l件下內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值S 排序?yàn)門UA=UBQ＜UBC21＜EF-1α＜GAPDH＜28SrRN＜RP Ⅱ(表4)。低溫處理下EF-1α 的S 值最低,穩(wěn)定性最好,其次是RP Ⅱ；高溫和干旱處理下TUA 和UBQ 的S 值最低,穩(wěn)定性最好,這與GeNorm 軟件分析結(jié)果一致。

BestKeeper 軟件直接利用CT 值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。由表5 可知,在低溫處理下EF-1α 和RP Ⅱ的R值最趨近于1,相關(guān)性好,且SD 值均小于1,GAPDH 的SD 值最高。說明在低溫脅迫處理下RP Ⅱ和EF-1α適合作為內(nèi)參基因,而GAPDH 穩(wěn)定性差,不適合作為內(nèi)參基因,這與之前穩(wěn)定性分析結(jié)果一致。高溫處理下,UBQ 的SD 值最小,穩(wěn)定性最好,28SrRNA 的SD 值大于1,說明其穩(wěn)定性最差,與GeNorm 和NormFinder的結(jié)果一致。干旱處理下,UBQ 和TUA 的SD 值小于1,且R 值最接近于1,說明其穩(wěn)定性較好。

綜合3 個(gè)軟件分析結(jié)果,在低溫脅迫處理下EF-1α表達(dá)穩(wěn)定性最好；在高溫和干旱脅迫處理下UBQ 和TUA 表達(dá)穩(wěn)定性最好。

2.4.2 冬瓜不同組織內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性 7 個(gè)內(nèi)參基因在冬瓜不同組織中表達(dá)量不同,GeNorm 軟件分析結(jié)果表明,在冬瓜不同組織中7 個(gè)內(nèi)參基因M 值排序?yàn)閁BQ=EF-1α＜RP Ⅱ＜UBC21＜28SrRNA＜TUA＜GAPDH。NormFinder 軟件分析結(jié)果表明,候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值S 排序?yàn)镋F-1α ＜RP Ⅱ＜UBQ ＜UBC21＜TUA＜28SrRNA＜GAPDH。BestKeeper 軟件分析結(jié)果表明,EF-1α 和RP Ⅱ的SD 值均小于1,且R 值接近于1,說明二者穩(wěn)定性較好；TUA 和GAPDH 的SD值均小于1,但TUA 相關(guān)性差,GAPDH 相關(guān)性最差,為負(fù)值,不適合作為內(nèi)參基因。綜上,EF-1α 為最適內(nèi)參基因(表6)。

表4 NormFinder 軟件分析7 個(gè)候選內(nèi)參基因在不同脅迫條件下表達(dá)穩(wěn)定性Table 4 NormFinder ranking of the 7 candidate reference genes with respect to their expression stability under different stress conditions

3 討論

目前已有關(guān)于植物不同組織和非生物脅迫下內(nèi)參基因篩選的研究報(bào)道。如Wang 等[29]研究表明RP 和EF-1α 適合作為低溫脅迫處理下胡楊(Populus euphratica)的內(nèi)參基因；Hong 等[30]認(rèn)為EF-1α 是短柄草(Brachypodium distachyum)在低溫脅迫處理下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因；Lovdal 等[31]研究表明,不同脅迫處理下番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)的最適內(nèi)參基因不同,其中低溫脅迫處理下EF-1α 和RPLA 表達(dá)最穩(wěn)定,GAPDH 最不穩(wěn)定。本研究結(jié)果表明,冬瓜在低溫脅迫處理下最適合的內(nèi)參基因是EF-1α,而GAPDH穩(wěn)定性最差,不適合作為內(nèi)參基因,這與前人研究結(jié)果一致。高溫脅迫處理下,本研究最適的內(nèi)參基因?yàn)閁BQ 和TUA,與陳楊楊等[32]和史興青[33]研究結(jié)果相似；杜輝輝[34]根據(jù)梭梭(Haloxylon ammodendron)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果對(duì)8 個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行分析,最終認(rèn)為干旱脅迫條件下最適內(nèi)參基因有Ha18SrRNA、HaTUA5 和 HaUBQ10； 周 曉 慧 等[35]篩 選 喀 西 茄(Solanum aculeatissimum)中穩(wěn)定內(nèi)參基因發(fā)現(xiàn)TUA 和EF-1α 不同脅迫條件及不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性最高。本研究結(jié)果表明,干旱脅迫下UBQ 和TUA 是冬瓜最適內(nèi)參基因,這與前人研究結(jié)果一致。

研究內(nèi)參基因穩(wěn)定性時(shí),通常需要對(duì)不同組織基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測,如Jain 等[36]對(duì)水稻(Oryza sativa)內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià),認(rèn)為EF-1α 和UBQ5 在不同組織器官中穩(wěn)定性最好；張崗等[37]篩選鐵皮石斛(Dendrobium officinale)不同組織最適內(nèi)參基因,結(jié)果確定EF-1α 和18SrRNA 為最佳內(nèi)參基因。蘇曉娟等[38]認(rèn)為毛果楊(Populus trichocarpa)不同組織均可使用EF - 1α 作 為 內(nèi) 參 基 因。此 外, 在 菠 蘿 蜜(Artocarpus heterophyllus)[39]和葡萄(Vitis vinifera L.)[40]不同組織中GAPDH 表達(dá)也較穩(wěn)定。本研究結(jié)果表明,冬瓜不同組織中EF-1α 穩(wěn)定性最好,GAPDH穩(wěn)定性最差,這可能是由于試驗(yàn)樣品、方法、時(shí)間和內(nèi)參基因范圍不同,造成篩選出的最適內(nèi)參基因不同。

大量研究表明,不同試驗(yàn)條件下最適候選內(nèi)參基因存在差異,因此,內(nèi)參基因穩(wěn)定性的篩選與分析,是得到可靠基因表達(dá)分析結(jié)果的重要前提。GeNorm、NormFinder 和BestKeeper 是常用的3 個(gè)內(nèi)參基因分析軟件。蔣婷婷等[41]對(duì)石蒜屬(Lycoris)不同組織、不同花發(fā)育期和不同雜交種的幼鱗莖進(jìn)行最適內(nèi)參基因選擇,發(fā)現(xiàn)GeNorm 和NormFinder 軟件分析結(jié)果較為一致,而BestKeeper 軟件分析結(jié)果差異明顯,這可能是由于BestKeeper 軟件不需要將CT 值進(jìn)行轉(zhuǎn)換,是對(duì)原始數(shù)據(jù)最直接的表達(dá),與GeNorm 和NormFinder 軟件相比,在內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析上有效性較差,因此,BestKeeper 軟件分析適用于初篩。肖翠等[42]分析柑橘( Citrus) 內(nèi)參基因穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn), GeNorm 和NormFinder 軟件在整體分析、潰瘍病等分析中有著高度的一致性,但在干旱、低溫脅迫分析中存在差異,其原因可能是GeNorm 和NormFinder 軟件算法不同,NormFinder 軟件能在綜合考量其他內(nèi)參基因基礎(chǔ)上再選擇最適內(nèi)參基因,而GeNorm 軟件不行,這就導(dǎo)致當(dāng)內(nèi)參基因在組間樣品間差異較少時(shí),2 個(gè)軟件分析結(jié)果差異大。本研究中,不存在樣品分組和目的基因分析,且3 個(gè)軟件分析的最適內(nèi)參基因結(jié)果大致相同,因此選擇在3 個(gè)軟件中分析結(jié)果均顯示比較穩(wěn)定的EF-1α 基因作為冬瓜的內(nèi)參基因。

4 結(jié)論

本研究共選取7 個(gè)候選內(nèi)參基因,研究其在冬瓜不同組織和不同非生物脅迫條件下的表達(dá)情況,分析了各候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。結(jié)果表明,7 個(gè)候選內(nèi)參基因在不同組織和不同脅迫處理下均有表達(dá),但表達(dá)量存在差異,其中EF-1α 在低溫脅迫處理下表達(dá)穩(wěn)定性最好；UBQ 和TUA 在高溫和干旱脅迫處理下表達(dá)穩(wěn)定性最好；EF-1α 在不同組織中表達(dá)穩(wěn)定性最好。本研究結(jié)果為冬瓜實(shí)時(shí)熒光定量PCR 內(nèi)參基因的選擇提供了一定的理論參考,為今后冬瓜基因的表達(dá)分析奠定了理論基礎(chǔ)。