人源誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞在心血管疾病研究中的應(yīng)用與挑戰(zhàn)

田 蕾 柳金英 白 蕊 吳福建 張惠敏 謝 璇 蘇聰平 王 青 郭淑貞 王 偉 蘭 峰

2017年的《中國(guó)心血管病報(bào)告》顯示，中國(guó)心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）的患病率和病死率仍處在上升階段，CVD死亡占居民死亡構(gòu)成的40%以上，現(xiàn)患人數(shù)約2.9億，心血管疾病的治療仍面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，成為當(dāng)今社會(huì)的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。心血管疾病所造成的心肌損傷表現(xiàn)出具有正常收縮功能的心肌細(xì)胞數(shù)量的相對(duì)或絕對(duì)減少，受損的心肌細(xì)胞通過(guò)纖維組織瘢痕修復(fù)，未受損的心肌細(xì)胞出現(xiàn)代償性肥大，造成心肌收縮功能下降，最終導(dǎo)致心力衰竭。在這過(guò)程中心肌細(xì)胞的再生能力受限成為制約心血管疾病治療的瓶頸，利用干細(xì)胞修復(fù)衰竭的心肌細(xì)胞為突破這一瓶頸帶來(lái)希望。

干細(xì)胞根據(jù)其不同的來(lái)源與分化能力，可分為成體干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞，其最顯著的特征是具有無(wú)限增殖和分化為多種細(xì)胞類(lèi)型的潛能，但胚胎干細(xì)胞主要來(lái)源自早期發(fā)育的胚胎，在使用過(guò)程中受到倫理學(xué)限制，此外，在臨床實(shí)踐中，患者在應(yīng)用由干細(xì)胞分化的細(xì)胞或組織后，需要終身服用免疫抑制劑以對(duì)抗自身排斥反應(yīng)。誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞的出現(xiàn)打破了干細(xì)胞應(yīng)用的中的局限，誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞簡(jiǎn)稱(chēng)iPSC，是人體的體細(xì)胞經(jīng)過(guò)重編程后獲得的具有自我更新和多能分化能力等類(lèi)似胚胎干細(xì)胞的生物特性的一種細(xì)胞。2006年，日本Yamanaka團(tuán)隊(duì)首次通過(guò)4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、c-Myc與Klf4轉(zhuǎn)染到小鼠的成纖維細(xì)胞中，成功的獲得了類(lèi)似胚胎干細(xì)胞的多潛能干細(xì)胞，從而建立了小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系[1]。2007年，Takahashi等通過(guò)對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行重編程，獲得人源誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSC）[2]?！禨cience》雜志將該項(xiàng)研究成果列為2008年世界十大科技突破的第二位。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞不僅避免了在倫理、道德、宗教、以及免疫排斥等方面的諸多問(wèn)題，此外還克服了既往對(duì)疾病研究中由于機(jī)制復(fù)雜及相關(guān)細(xì)胞組織難以獲得而使研究舉步維艱的困難。目前的研究顯示，iPSCs在心肌損傷的修復(fù)，心血管相關(guān)的模型的構(gòu)建以及藥物心血管系統(tǒng)藥物安全性評(píng)價(jià)等方面展現(xiàn)出特有的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景，本文將從這三個(gè)方面展開(kāi)介紹。

1.人源誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞分化心肌細(xì)胞

Kehat團(tuán)隊(duì)[3]最初報(bào)道，通過(guò)擬胚體和使用含有血清的培養(yǎng)基分化出心肌細(xì)胞，但其分化效率僅為5%～10%。之后的研究就分化效率的提高進(jìn)行深入探索，Mummery等[4]報(bào)道了成功通過(guò)與小鼠內(nèi)胚層樣細(xì)胞（END2）共培養(yǎng)以增強(qiáng)分化效率。使用細(xì)胞因子如激活素A（activin A）和BMP4（bone morphogenetic protein 4）在基于胚狀體的分化中實(shí)現(xiàn)了更高效的誘導(dǎo)心肌細(xì)胞[5-6]。2009年，Zwi團(tuán)隊(duì)[7]成功的將hiPSC分化出可跳動(dòng)的、具有正常細(xì)胞形態(tài)及電生理特性的心肌細(xì)胞。隨后多種成分及功能明確的化學(xué)小分子誘導(dǎo)分化的方法漸趨成熟。2014年，研究通過(guò)調(diào)控經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路的“CDM3”分化體系，在不使用血清的情況下，成功的將hiPSC分化心肌細(xì)胞，且心肌細(xì)胞的純度為90%～95%[8]。而通過(guò)去除培養(yǎng)基中的谷氨酸與葡萄糖成功分化出純度超過(guò)99%的心肌細(xì)胞[9]。

從iPSCs分化出心肌細(xì)胞，可以自主收縮，隨著心肌細(xì)胞的發(fā)育成熟具備良好的肌節(jié)結(jié)構(gòu)及心肌特異性的動(dòng)作電位和鈣瞬變并表達(dá)肌漿網(wǎng)蛋白和離子通道的特點(diǎn)。此外，研究人員使用多種方法，如延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間、電刺激、機(jī)械刺激、流體力學(xué)以及改良培養(yǎng)基等，促進(jìn)iPSCs來(lái)源的心肌細(xì)胞成熟。2018年，哥倫比亞大學(xué)的Kacey團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出一種全新的方法，在僅持續(xù)4周的生物反應(yīng)器培養(yǎng)下利用血液衍生的iPSCs培育出類(lèi)似成年的人心肌組織。他們將通常需要9個(gè)月的發(fā)育時(shí)間壓縮到比其他研究更快更完整的經(jīng)歷心臟成熟，分化成熟的心肌細(xì)胞胞核增多、肌節(jié)成熟，T管形成，心肌收縮的頻率、幅度、能量代謝的轉(zhuǎn)變及鈣處理等均與成人的心肌細(xì)胞高度一致[10]。這些方法均為iPSCs分化的心肌細(xì)胞的應(yīng)用提供質(zhì)量保證。

2.人源誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞對(duì)心肌損傷的修復(fù)

自2006年，發(fā)現(xiàn)iPSCs以來(lái)，其在包括各種心血管疾病在內(nèi)的多種疾病的潛在治療應(yīng)用價(jià)值受到廣泛關(guān)注。2014年，對(duì)患有年齡相關(guān)性黃斑變性的患者進(jìn)行了世界上第一個(gè)自體iPSCs衍生細(xì)胞的移植，在移植后的第一年，在沒(méi)有應(yīng)用免疫抑制劑的情況下，沒(méi)有出現(xiàn)畸胎瘤形成或移植的iPSCs衍生的視網(wǎng)膜上皮（RPE）細(xì)胞的免疫排斥跡象[11]。這無(wú)疑鼓舞著iPSCs的臨床應(yīng)用。誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞對(duì)心肌損傷的修復(fù)主要表現(xiàn)在其對(duì)心肌梗死或心肌缺血后心肌損傷的修復(fù)，預(yù)期移植干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞通過(guò)對(duì)心肌細(xì)胞的收縮功能和營(yíng)養(yǎng)作用改善心臟功能。對(duì)于前一個(gè)目的，移植細(xì)胞和宿主心肌的電生理整合非常重要。而營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)主要?dú)w因于移植細(xì)胞分泌因子，如生長(zhǎng)因子。Shiba等[12]通過(guò)豚鼠模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，移植胚胎干細(xì)胞源的心肌細(xì)胞能夠與周?chē)拗餍募⌒纬砷g隙鏈接，并實(shí)現(xiàn)1∶1宿主偶聯(lián)。Chong團(tuán)隊(duì)[13]通過(guò)將10億個(gè)人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的心肌細(xì)胞注射入心肌缺血的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物獼猴的心肌內(nèi)，觀察2～7周后發(fā)現(xiàn)，外源性的心肌細(xì)胞能移植入心肌內(nèi)，并實(shí)現(xiàn)肌化與肌電同步。使用人胚胎干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞能夠在免疫抑制劑治療后的心梗動(dòng)物模型的心臟中成功移植。

Kawamura等[14]報(bào)道使用豬心肌梗塞模型移植由來(lái)自人類(lèi)iPSCs分化的心肌細(xì)胞，可以顯著改善急性心肌梗死清晰度動(dòng)物模型的心臟功能。Lei等[15]通過(guò)將200萬(wàn)個(gè)計(jì)量的人源誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞注入到心肌損傷模型豬的心臟，發(fā)現(xiàn)iPSCs源的細(xì)胞不僅可以植入到模型豬的心臟中，并且能在維持心率正常的情況先下，顯著改善心肌損傷造成的心肌凋亡，改善左心室功能及心肌代謝功能等。2015年，Menasche團(tuán)隊(duì)[16]首次報(bào)道了成功運(yùn)用人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的心肌祖細(xì)胞移植到晚期缺血性心力衰竭患者的心臟中。綜上，考慮到來(lái)源iPSCs的心肌細(xì)胞的顯著優(yōu)勢(shì)，其臨床應(yīng)用前景廣闊。

3.人源誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞在心血管疾病模型中的應(yīng)用

人與小鼠的心肌細(xì)胞電生理特性存在顯著差異，小鼠的心肌細(xì)胞具有較短的動(dòng)作電位時(shí)程和較快的心率（≈600次/min），這些差異是小鼠模型無(wú)法充分再現(xiàn)人類(lèi)心血管疾病的重要原因，而人原代的心肌細(xì)胞又難以在體外穩(wěn)定的取樣和保持，而來(lái)自患者體細(xì)胞誘導(dǎo)的iPSCs分化的心肌細(xì)胞，具備人體整套的遺傳背景，能夠建立患者特異性的疾病模型，較動(dòng)物細(xì)胞相比，可以更好的應(yīng)用于人類(lèi)疾病的研究。

基于iPSCs的疾病模型的最早報(bào)道之一是長(zhǎng)QT綜合征（long QT syndrome，LQT），長(zhǎng)QT綜合征是由復(fù)極相關(guān)的離子通道基因突變引起，患者心電圖表現(xiàn)出QT間期延長(zhǎng)，增加致命性室性心律失常的風(fēng)險(xiǎn)。目前發(fā)現(xiàn)的遺傳性LQT有13種亞型，已經(jīng)報(bào)道的基于iPSCs的長(zhǎng)QT綜合征疾病亞型的模型有LQTS1[17-19]，LQTS2[20-23]和LQTS3[24-25]，首先被報(bào)道的是LQTS1，該亞型是由KCNQ1（KCNQ1-190Q）突變引起的，KCNQ1（KCNQ1-190Q）為編碼慢速延遲整流外向鉀通道IKsa亞單位的基因，從KCNQ1突變患者源的IPSCs分化的心室肌細(xì)胞電生理檢測(cè)顯示出延長(zhǎng)的動(dòng)作電位時(shí)程，IKs電流降低，使用IKs阻滯劑后未見(jiàn)改善，進(jìn)一步證實(shí)了其IKs通道異常[17]。此外，有關(guān)LQTS2亞型的文章報(bào)道，由于2型長(zhǎng)QT綜合征是由（KCNH2-A614V突變引起的，KCNH2參與編碼快速激活延遲整流鉀通道IKr的α亞單位基因，運(yùn)用伴有KCNH2突變的iPSCs分化的心肌細(xì)胞，其電生理檢測(cè)顯示動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)，IKr電流降低，對(duì)突變的基因進(jìn)行基因敲減可以糾正電生理異常[23]。此外，由SCN5A負(fù)責(zé)編碼鈉內(nèi)流通道亞單位的基因突變?cè)斐傻拟c通道異常是LQT3的主要病因，2013年，Terrenoire和Ma團(tuán)隊(duì)，分別成功的使用患者特異性的iPSCs構(gòu)建了LQTS3疾病模型[24-25]。另外基于iPSCs疾病模型研究還包括Timothy綜合征[26]，該疾病是由負(fù)責(zé)編碼CaV1.2的L型鈣通道的基因CACNA1C突變引起，該病患表現(xiàn)出QT間期延長(zhǎng)，自閉癥和免疫缺陷等一系列病癥，使用帶有CACNA1C突變的IPSCs分化的心室肌細(xì)胞的電生理檢測(cè)結(jié)果顯示動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)和頻繁的延遲后去極化，L-型鈣通道失活受損，導(dǎo)致該通道功能亢進(jìn)，使用促進(jìn)CaV1.2失活的化合物roscovitine后能顯著縮短心室肌細(xì)胞的動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間。

此外，患者特異性的iPSCs也被用于體外構(gòu)建心肌病疾病模型，最早的報(bào)道之一是有關(guān)LEOPARD綜合征的研究[27]，該疾病的主要的臨床表現(xiàn)包括肥厚型心肌病、肺動(dòng)脈瓣狹窄、生長(zhǎng)遲緩及耳聾等，LEOPARD綜合征是由PTPN11基因突變引起的，該基因是一種蛋白酪氨酸磷酸酶，在RAS/MAPK信號(hào)通路上發(fā)揮重要作用，患者源的IPSCs分化的心肌細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞形態(tài)增大和NFATC4的核異位，這些與肥厚性心肌病的細(xì)胞變化一致，另外，心肌細(xì)胞還表現(xiàn)出ERK和MEK的磷酸化上調(diào)。而基于擴(kuò)張性心肌病患者iPSCs分化的心肌細(xì)胞，表現(xiàn)出肌小節(jié)紊亂、收縮功能下降及鈣通道異常等一系列與擴(kuò)張型心肌病一致的細(xì)胞特征，運(yùn)用美托洛爾可以改善擴(kuò)張型心肌病患者iPSCs分化的心肌細(xì)胞在TNNT2點(diǎn)突變的疾病表型[28-31]。致心率失常性右心室心肌病是另一種以患者iPSCs構(gòu)建的心肌病疾病模型，伴有PKP2點(diǎn)突變的患者成纖維細(xì)胞源iPSCs分化的心肌細(xì)胞在正常的培養(yǎng)條件下未表現(xiàn)出病理學(xué)表型，但當(dāng)培養(yǎng)基中補(bǔ)充了限定因子誘導(dǎo)脂肪生成途徑激活后，心肌細(xì)胞不僅表現(xiàn)出脂肪生成的增加還表現(xiàn)出心肌細(xì)胞的凋亡，該研究也表明誘導(dǎo)成人體內(nèi)新陳代謝條件可以促進(jìn)體外細(xì)胞模型的疾病表型的表現(xiàn)[32]。

其他類(lèi)型的基于患者源的iPSCs構(gòu)建的心血管疾病模型還包括Barth綜合征，Barth綜合征是由TAZ基因突變導(dǎo)致的，該突變?cè)诰€粒體結(jié)構(gòu)中起重要作用，突變的TAZ引起線粒體結(jié)構(gòu)和功能的異常，研究證實(shí)源自Barth綜合征患者iPSCs衍生的心肌細(xì)胞顯示線粒體功能障礙，收縮功能異常及活性氧增高，加入線粒體靶向的抗氧化劑mito TEMPO可以糾正Barth綜合征患者iPSC源的心肌細(xì)胞異常[33]。

綜上所述，現(xiàn)代研究不僅證明使用患者源的iPSCs分化的心肌細(xì)胞構(gòu)建疾病模型的可行性，還為治療基因突變導(dǎo)致的心血管疾病的治療提供了新的見(jiàn)解。

4.人源誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞在心血管疾病藥物安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

基于安全性考慮，約30%的潛在候選藥物在臨床開(kāi)發(fā)階段中止，其中大部分是因?yàn)樾难懿涣挤磻?yīng)而排除在外，近年新上市藥物如Avandia、馬來(lái)酸羅格列酮等，因?yàn)榛颊叻煤螽a(chǎn)生了嚴(yán)重的心臟毒副作用，而被緊急撤回[34]?？梢?jiàn)，藥物的心臟毒性是制約藥物研發(fā)的難題，也是藥物臨床前安全評(píng)價(jià)研究的重要問(wèn)題。由于藥物引起的心臟毒性的實(shí)際風(fēng)險(xiǎn)是由多個(gè)心臟通路調(diào)控的，因此如目前采用的穩(wěn)定表達(dá)hERG的細(xì)胞系（即KCNH2，編碼IKr通路）來(lái)鑒定具有阻斷IKr電流傾向的化合物安全性評(píng)價(jià)可能不足以描述實(shí)際的風(fēng)險(xiǎn)。缺乏特異性也可能導(dǎo)致高估藥物的實(shí)際心臟毒性，終止?jié)撛谟行У男滤幯邪l(fā)。iPSCs源的心肌細(xì)胞有助于解決這些局限，大多數(shù)在成人心肌細(xì)胞中出現(xiàn)的電流可以在iPSCs分化的心肌細(xì)胞中重現(xiàn)。2011年，Gou等[35]報(bào)道運(yùn)用單層搏動(dòng)的iPSC-CM建立體外高通量篩選模型，精確的對(duì)藥物引起的心臟功能異常進(jìn)行了精確的檢測(cè)，即通過(guò)帶有微電極陣列的96孔板，檢測(cè)iPSC-CM同步收縮的頻率、節(jié)律以及幅度，通過(guò)該篩選模型評(píng)價(jià)了28種已知具有心臟毒性的化合物，研究結(jié)果證實(shí)該模型能夠靈敏、精確的檢測(cè)出該化合物的特異性心率改變及振幅改變。iPSC-CM模型的建立開(kāi)拓了藥物體外心臟毒性檢測(cè)的新領(lǐng)域，該模型能夠更加全面、特異性地檢測(cè)藥物的心臟毒性。近年來(lái)，多潛能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞在心臟毒性篩選中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。Eldrige等[36]通過(guò)運(yùn)用ErbB信號(hào)通路的抑制劑和激活劑處理的hiPSC來(lái)源的心肌細(xì)胞，能夠緩解或加重多柔比星誘導(dǎo)的心肌損傷。2016年，Paul[37]團(tuán)隊(duì)運(yùn)用接受阿霉素治療的乳腺癌患者的iPSCs分化的心肌細(xì)胞，分別從心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、心肌細(xì)胞的收縮功能、線粒體膜電位、氧化應(yīng)激等方面全面系統(tǒng)的評(píng)價(jià)阿霉素的心臟毒性。為阿霉素心臟毒性的藥理機(jī)制提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。iPSCs分化的心肌細(xì)胞相當(dāng)于胚胎心肌細(xì)胞，針對(duì)藥物的安全性測(cè)試，心肌細(xì)胞需要顯示出于成人心肌一致的藥物反應(yīng)，因此研究人員不斷提高心肌細(xì)胞的成熟程度以提高iPSCs源的心肌細(xì)胞對(duì)藥物心臟毒性預(yù)測(cè)水平，隨著iPSCs分化成熟心肌細(xì)胞的技術(shù)不斷完善，其將在心血管藥物的研發(fā)、篩選及早期毒性評(píng)價(jià)發(fā)揮重要作用[38]。

5.挑戰(zhàn)與展望

綜上所述，近年來(lái)，hiPSCs源分化的心肌細(xì)胞廣泛運(yùn)用于心血管疾病模型的制備、疾病機(jī)制研究、疾病治療以及藥物篩選等方面。但hiPSC源的心肌細(xì)胞的應(yīng)用仍面臨許多問(wèn)題：首先，就其在損傷心肌的修復(fù)作用的研究中發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)化的干細(xì)胞對(duì)機(jī)體存在損害，容易產(chǎn)生免疫排斥，研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源自某種遺傳背景的ES細(xì)胞當(dāng)移入遺傳背景相同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，會(huì)產(chǎn)生畸胎瘤，即出現(xiàn)免疫耐受。此外，干細(xì)胞作為一種外源性的物質(zhì)移植入心臟是否能引起致命性的心率失常尚存有爭(zhēng)議，目前發(fā)現(xiàn)iPSC移植可發(fā)生室性早搏，但發(fā)生率并不顯著，目前主要考慮可能與移植IPSC后分布密度不均及注射過(guò)程中的不良刺激有關(guān)。此外，hiPSC疾病模型的制備及藥物篩選中的運(yùn)用也存在一定的局限，盡管iPSCs衍生的心肌細(xì)胞能更真實(shí)的模擬機(jī)體的心肌細(xì)胞功能，但針對(duì)涉及多種細(xì)胞類(lèi)型且機(jī)制復(fù)雜的心血管疾病，更需要構(gòu)建組織或者器官水平的疾病模型，雖然通過(guò)hiPSC可以分化出上皮細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞，但模擬心臟組織還很難實(shí)現(xiàn)。最后，目前hiPSC獲得的心肌細(xì)胞主要為心室肌細(xì)胞，只包含較少的心房肌細(xì)胞與竇房結(jié)細(xì)胞，對(duì)分化出高純度亞型特異性的心肌細(xì)胞技術(shù)還需進(jìn)一步研究完善。希望隨著基因編輯以及組織工程技術(shù)的發(fā)展，hiPSCs分化心肌細(xì)胞的研究也不斷深入，早日構(gòu)建出表型成熟和亞型特異的心肌細(xì)胞模型，更好的應(yīng)用在心血管疾病的基礎(chǔ)研究與臨床實(shí)踐中。