豬鏈球菌病實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)研究進(jìn)展

楊慧敏，樊明明,呂玉金，3

(1.河南亞衛(wèi)動物藥業(yè)有限公司，河南 鄭州450031；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州450046；3.河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心；鄭州 450046)

豬鏈球菌(Streptococcus suis，SS)是一種重要的人畜共患病病原菌，根據(jù)其莢膜抗原的不同，將豬鏈球菌共分為35種血清型，部分血清型具有致病性，如2型(SS2)毒力最強(qiáng)，不僅對豬致病，還能引起人發(fā)病和死亡。豬鏈球菌病是國家規(guī)定的二類動物疫病，引起該病的病原主要是C群獸疫鏈球菌和類馬鏈球菌，導(dǎo)致仔豬的腦膜炎、敗血癥等疫病，并常與多種病原混合感染，臨床癥狀復(fù)雜，發(fā)病率和死亡率較高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失；也可感染人，引起人的腦膜炎、心內(nèi)膜炎以及關(guān)節(jié)化膿性炎癥，嚴(yán)重的可引起死亡。

1998年和2005年，我國先后在江蘇省和四川省兩次暴發(fā)人感染豬鏈球菌2型的重大動物疫病群體事件，累計(jì)引起52人死亡，其中致鏈球菌中毒性休克綜合征(Streptococcal toxic shock syndrome STSS)的患者死亡多達(dá)96.2%[1-4]。豬鏈球2型，在世界許多國家和地區(qū)廣泛流行，因此，該病原菌的快速檢測方法以及公共衛(wèi)生學(xué)意義重大。目前除了常規(guī)的微生物學(xué)方法外，血清學(xué)方法、分子生物學(xué)方法以及高通量檢測方法都取得了較大進(jìn)展，本文就豬鏈球菌檢測技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 血清學(xué)方法

血清學(xué)檢測豬鏈球菌的常用方法有很多，包括凝集試驗(yàn)、ELISA法、膠體金免疫層析技術(shù)、熒光檢測技術(shù)等，操作簡便，靈敏度高，較為可靠。

1.1 凝集試驗(yàn)

豬鏈球菌的檢測通常采用平板凝集試驗(yàn)或協(xié)同凝集試驗(yàn)，后者應(yīng)用較為廣泛。協(xié)同凝集試驗(yàn)是將豬鏈球菌抗血清與SPA結(jié)合，成為致敏的載體顆粒，與特異性抗原相遇時，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，而平板凝集試驗(yàn)是在鏈球菌的選擇性培養(yǎng)基上加入抗豬鏈球菌血清，然后接種待檢菌，能形成大的沉淀圈。

1.2 ELISA法

ELISA即酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，Serhir等(1993)利用雙抗體夾心ELISA法對豬鏈球菌1、2、1/2、3和22型進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，特異性為97.6%，敏感性為62.5%，與標(biāo)準(zhǔn)檢測技術(shù)(生化試驗(yàn)、協(xié)同凝集試驗(yàn))的結(jié)果一致。此外，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附法(Dot-ELISA)由于操作相對簡單、結(jié)果易于觀察，也常用于鏈球菌的檢測。歐瑜等[5]通過利用制備的豬鏈球菌溶菌酶釋放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)的抗體，建立了檢測豬鏈球菌的Dot-ELISA和間接ELISA方法，靈敏度高，可用于流行病學(xué)調(diào)查。

1.3 膠體金免疫層析技術(shù)

該技術(shù)原理是將免疫金標(biāo)記技術(shù)與抗原抗體的特異性反應(yīng)結(jié)合在一起，以此鑒定細(xì)菌。因操作簡單、靈敏高效、穩(wěn)定性好、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，在臨床及檢疫診斷領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。鞠瑩等[6]通過制備膠體金顆粒、豬鏈球菌2型(SS2)的多克隆抗體，并用膠體金顆粒標(biāo)記SS2的多克隆抗體，制備了SS2的膠體金免疫層析試紙條，該試紙條靈敏度高、特異性好。

1.4 免疫熒光技術(shù)

該技術(shù)原理是將抗體或抗原用熒光物質(zhì)標(biāo)記，從而顯示相應(yīng)抗原或抗體的一種技術(shù)，因一般采用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行示蹤抗原，所以被稱為熒光抗體技術(shù)。武紅敏等[7]通過制備能與SS2的重要毒力相關(guān)因子抗體結(jié)合的CdSe/ZnS量子點(diǎn)熒光探針，達(dá)到了檢測豬鏈球菌的目的。

2 分子生物學(xué)方法

該方法敏感性和特異性相對于常規(guī)檢測技術(shù)有明顯的提高，而且通過測序分析，可對致病菌的來源和進(jìn)化過程進(jìn)行研究，對發(fā)病豬的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查具有重要的意義。

2.1 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)在病原檢測方面具有高效率、特異性強(qiáng)和準(zhǔn)確率高等的優(yōu)點(diǎn)，近年來，被廣泛應(yīng)用于耐藥菌和致病菌[8]的檢測。國內(nèi)外的研究人員開展了大量關(guān)于豬鏈球菌PCR診斷技術(shù)的研究，中國檢疫科學(xué)研究院和江蘇檢驗(yàn)檢疫局建立了豬鏈球菌2型的快速PCR檢測方法，4小時內(nèi)即可完成檢測。

2.1.1 多重PCR

多重PCR可實(shí)現(xiàn)多個保守片段的同時擴(kuò)增，相對于普通PCR具有較大優(yōu)勢。陳博文等[9]建立了能同時檢測豬鏈球菌2型的CPS、MRP以及EF等毒力因子的多重PCR檢測方法，并驗(yàn)證了該方法的可靠性。孫學(xué)飛等[10]建立了SS2的1、2、7、9血清型四重PCR方法。結(jié)果顯示，對人工模擬感染實(shí)驗(yàn)的SS的敏感性為103CFU/g，快速有效，可在3小時左右得到檢測結(jié)果。黃婕峰[11]建立了SS2的3型、8型、21型、23型血清型的多重PCR方法，敏感性、準(zhǔn)確性、特異性都較好。

2.1.2 實(shí)時熒光定量PCR

實(shí)時熒光定量PCR(FQ-PCR)能實(shí)現(xiàn)病原體的快速準(zhǔn)確檢測，該方法克服了免疫學(xué)檢測的不足，對確定疾病所處的感染階段提供了檢測手段。孫洋等[12]以SS2的特異性基因CPS2J為靶基因，利用SYBR Green I與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光的原理，建立了豬鏈球菌2型的PCR檢測方法，能實(shí)時定量檢測SS2。

2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)(LAMP技術(shù))

LAMP技術(shù)是核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，能在等溫條件下實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、簡便、低成本的基因擴(kuò)增，具有高特異性和高靈敏性，在分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域得到十分廣泛的應(yīng)用，具有廣闊的發(fā)展前景。

朱水榮等[13]針對SS2中國分離株(05ZYH33)89K基因序列設(shè)計(jì)LAMP引物4條，應(yīng)通過優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系，建立了檢測SS2的方法，應(yīng)用所建立的方法對SS2和其他菌株進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示SS2菌株檢測結(jié)果為陽性，非SS2菌株結(jié)果為陰性。張鳳玉等[14]設(shè)計(jì)合成了SS2 89K毒力島Ⅳ型分泌系統(tǒng)的virB4-89K基因的LAMP引物，建立了高致病性SS2的LAMP方法，且該方法具有良好的特異性、敏感性。

2.3 利用分子伴侶(Cpn60)基因?qū)ωi鏈球菌的基因分群

分子伴侶(Cpn60)基因具有普遍存在性、高保守性和部分變異性的特點(diǎn)，可依據(jù)其對SS基因進(jìn)行分群。Ronald Brousseau等[15]通過擴(kuò)增分析豬鏈球菌中編碼Cpn60的基因，結(jié)果顯示與采用16SrRNA的分群結(jié)果相同，系統(tǒng)進(jìn)化樹和序列也相似，且Cpn60的區(qū)分度比16SrRNA更大，為快速鑒定血清型提供了可靠的幫助。

3 高通量檢測技術(shù)

高通量檢測技術(shù)包括基因芯片技術(shù)、高通量測序技術(shù)等?；蛐酒夹g(shù)又稱DNA微陣列，其基本原理是核酸分子雜交，通過特定的基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，制備檢測用基因芯片，然后與PCR擴(kuò)增后的熒光標(biāo)記的靶標(biāo)雜交，通過檢測熒光信號的強(qiáng)度來分析、檢測病原[16]。鄭峰等[17]設(shè)計(jì)合成了豬鏈球菌cps1、cps2及cps9基因的保守區(qū)特異性寡核苷酸探針，實(shí)現(xiàn)了豬鏈球菌主要致病血清型SS1、SS14、SS2、SS1/2等的鑒別。劉玲玲[18]通過2型標(biāo)準(zhǔn)菌株特異性探針制作基因芯片，成功地檢測到豬鏈球菌 2 型特異區(qū)基因。邱小彤[19]建立了使用Luminex xTAG技術(shù)可以同時檢測21種豬鏈球菌的高通量檢測方法，并能進(jìn)行血清分型。

4 小結(jié)

豬鏈球菌是豬群中一種常見的條件致病菌，也是一種重要的人獸共患病病原，快速檢測技術(shù)對該病的預(yù)防和治療非常關(guān)鍵。微生物學(xué)和血清型診斷依然是最基本的診斷方法，隨著新檢測技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用，免疫學(xué)技術(shù)如免疫熒光技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)、ELISA法以及高通量檢測技術(shù)等為豬鏈球菌的病原學(xué)鑒定及毒力因子的監(jiān)測工作提供了更多更快速準(zhǔn)確的方法，為疫苗研究和免疫防控提供科學(xué)依據(jù)。