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    外泌體在膀胱癌中的應(yīng)用和研究進(jìn)展

    2019-02-21 00:16:00陳曉榕王海峰左毅剛
    現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志 2019年3期
    關(guān)鍵詞:泌體外泌體膀胱癌

    陳曉榕 王海峰 左毅剛

    在全球范圍內(nèi),膀胱癌的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位居第9位,約20%~30%的患者在初次就診時(shí)即被診斷為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer, MIBC),即使初次診斷為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC)也有10%~30%的患者進(jìn)展為MIBC[1]。2015年,中國膀胱癌僅在男性患者中的全年新發(fā)病例約為6.2萬例,發(fā)病率為8.83/10萬[2]。目前診斷和監(jiān)測(cè)膀胱癌的主要手段依然是膀胱鏡檢查和活檢,但膀胱鏡作為一種侵入性檢查,在膀胱癌的監(jiān)測(cè)上比較費(fèi)力、耗時(shí),所以急需一種簡(jiǎn)便和敏感性、特異度均較高的檢測(cè)方法來診斷、監(jiān)測(cè)膀胱癌的復(fù)發(fā)和進(jìn)展。自2007年Valadi等[3]闡述了外泌體在細(xì)胞間遺傳物質(zhì)交流中發(fā)揮的重要作用并引發(fā)眾多學(xué)者的興趣后,國內(nèi)外學(xué)界也掀起一股研究外泌體的熱潮。隨后,大量的研究表明了外泌體在腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)展、診斷及治療方面具有重要意義[4-7]。本文將重點(diǎn)闡述外泌體在膀胱癌診療中的應(yīng)用及研究進(jìn)展。

    一、外泌體

    外泌體是由正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞自分泌、旁分泌及內(nèi)分泌的一種直徑約30~100 nm的胞外囊泡,并由磷脂雙分子層特異性地將蛋白質(zhì)、微小RNA(microRNA, miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)等物質(zhì)包裹其內(nèi),可穩(wěn)定存在于體液中。外泌體不僅可作為“垃圾袋”將親代細(xì)胞內(nèi)無用或多余的細(xì)胞成分轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外,也可作為信使在細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞。

    1.外泌體的包埋作用:雖然我們已經(jīng)知道外泌體中含有大量的蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)等,但這些物質(zhì)被包裹到外泌體中的機(jī)制尚未被明確。Villarroya-Beltri等[8]將人類原始T細(xì)胞提取的外泌體分別與不同涂層的鏈霉親和素珠,包括生物素化的外泌體miRNA(miRNA-198)涂層、生物素化的胞漿miRNA(miRNA-17)及陰性對(duì)照(poly-A)涂層或無涂層的鏈霉親和素珠,進(jìn)行共同培養(yǎng),然后通過質(zhì)譜分析法、免疫沉淀、qPCR、電泳遷移率改變?cè)囼?yàn)等方法,證明了一種普遍存在的RNA結(jié)合蛋白——不均一型核糖核蛋白A2B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1, hnRNPA2B1)在外泌體中泛素化后與miRNA-198中的GGAG/CCCU序列特異性結(jié)合,可介導(dǎo)miRNA-198主動(dòng)進(jìn)行外泌體包埋,這種作用可能取決于hnRNPA2B1和細(xì)胞骨架成分相互作用的能力。同時(shí)將GGAG/CCCU序列進(jìn)行突變,發(fā)現(xiàn)miR-198與hnRNPA2B1結(jié)合被抑制。此外Santangelo等[9]也發(fā)現(xiàn)另一種RNA結(jié)合蛋白——突觸素結(jié)合細(xì)胞質(zhì)RNA作用蛋白(synaptotagmin-binding cytoplasmic RNA-interacting protein, SYNCRIP)通過與表達(dá)特異性短序列——hEXO序列的miRNA相結(jié)合,能夠介導(dǎo)miRNA在外泌體中的包埋作用,且將hEXO序列植入其他miRNA中以增強(qiáng)其在外泌體中的表達(dá)水平。以上試驗(yàn)都說明了外泌體的內(nèi)含物并不是被隨機(jī)分配,而是通過某些確切的分子機(jī)制進(jìn)行包埋的。

    2.外泌體與受體細(xì)胞的作用方式:外泌體由親代細(xì)胞分泌后可通過以下方式靶向地與受體細(xì)胞相結(jié)合:①外泌體被受體細(xì)胞膜完全內(nèi)吞,將囊泡內(nèi)物質(zhì)傳遞至受體細(xì)胞中,包括脂質(zhì)筏介導(dǎo)、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和網(wǎng)格蛋白非依賴性內(nèi)吞作用[10-11]。②外泌體表面的跨膜蛋白(如PGRL、LAMP1、LAMP2等)與受體細(xì)胞相應(yīng)受體直接接觸,進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。③外泌體與受體細(xì)胞膜直接接觸,通過質(zhì)膜融合的方式將外泌體內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)[11]。上述作用方式都說明了外泌體內(nèi)的物質(zhì)并不是黏附于細(xì)胞表面而是被腫瘤細(xì)胞攝取的。這與Franzen等[12]以PKH-26標(biāo)記外泌體后與膀胱癌細(xì)胞共培養(yǎng),通過IDEAS軟件對(duì)PKH-26的熒光強(qiáng)度和PKH-26+點(diǎn)數(shù)測(cè)定的結(jié)果是一致的。

    二、外泌體與膀胱腫瘤微環(huán)境

    到目前為止,大量的研究已經(jīng)證明外泌體與腫瘤細(xì)胞或周圍正常組織細(xì)胞之間存在信息交流,這在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要意義。Zheng等[13]首次證實(shí)了正常細(xì)胞分泌的外泌體中磷酸酶和張力蛋白同源基因同源物假基因1(phosphatase and tensin homolog pseudogene 1, PTENP1)減少可促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,提示正常組織細(xì)胞與膀胱癌細(xì)胞間存在信息交流。同樣在Park等[4]的研究中,體外培養(yǎng)膀胱腫瘤T24系細(xì)胞后通過超速離心提取外泌體,再分別比較經(jīng)磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer, PBS)處理和提取的外泌體處理后的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(lymphatic endothelial cells, LECs)的增殖和轉(zhuǎn)移情況,發(fā)現(xiàn)外泌體可增強(qiáng)LECs的增殖和轉(zhuǎn)移(P<0.05),且LECs分泌的外泌體也具有吸引膀胱癌細(xì)胞并誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)移的作用。Ringuette等[14]的研究表明膀胱癌源性的外泌體可以通過激活TGFβ/SMAD信號(hào)通路使正常的膀胱成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┌Y相關(guān)性成纖維細(xì)胞,從而促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

    除外泌體與周圍組織細(xì)胞的信息交流可導(dǎo)致腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移外,還有研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌源性外泌體可通過增強(qiáng)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT),從而達(dá)到促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的效應(yīng)。Xue等[15]在正?;蛉毖鯒l件下分離出高表達(dá)lncRNA-UCA1的膀胱癌5637系細(xì)胞源性外泌體后,與低表達(dá)lncRNA-UCA1的膀胱癌UMUC2系細(xì)胞共同培養(yǎng),并通過透射電鏡、納米顆粒追蹤和蛋白印跡分析進(jìn)行鑒定,評(píng)估細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低氧狀態(tài)下的5637系細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中l(wèi)ncRNA-UCA1表達(dá)明顯升高,并通過EMT促進(jìn)UMUC2系膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和進(jìn)展。Franzen等[16]通過超速離心的方法從浸潤(rùn)性膀胱癌T24或UMUC3系細(xì)胞培養(yǎng)液或是直接從患者的尿液中提取外泌體,然后將其與尿路上皮細(xì)胞共同培養(yǎng),通過評(píng)估其EMT水平后發(fā)現(xiàn),相比于PBS處理后的尿路上皮細(xì)胞,經(jīng)膀胱癌外泌體處理后的尿路上皮細(xì)胞所表達(dá)的間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(包括α-平滑肌動(dòng)蛋白、S100A4等)明顯上調(diào)。

    三、外泌體內(nèi)含物與膀胱癌的診斷

    作為標(biāo)志物應(yīng)具有易分離、易獲取、敏感度及特異性高等特點(diǎn)。外泌體廣泛存在于人的體液中,如血液、尿液等,可通過相對(duì)無創(chuàng)的方法獲取,且相較于裸露在細(xì)胞外液中的miRNA、lncRNA等物質(zhì)而言,外泌體具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu),能在4 ℃或-20 ℃過夜儲(chǔ)存的條件下不影響外泌體的攝取[17],這說明外泌體可穩(wěn)定存在于體液中。Baumgart等[18]通過比較不同侵襲力的膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系及其外泌體的miRNAs表達(dá),首次闡明了外泌體內(nèi)的分子含量與親代細(xì)胞是部分相似的,這為外泌體作為膀胱癌的診斷標(biāo)志物提供了理論基礎(chǔ)。

    1.蛋白質(zhì):Chen等[19]識(shí)別了2 964種存在于人類尿液外泌體中的蛋白,其中107種被選做候選標(biāo)志物,并采用液相-二級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)膀胱癌患者(n=28)和疝氣患者(n=12)的尿液標(biāo)本中的29種蛋白進(jìn)行精確定量,其中有24種蛋白的表達(dá)在二者之間有顯著差異(P<0.05)。隨后用酶聯(lián)免疫法證實(shí)了TACSTD2在膀胱癌患者中的表達(dá)比疝氣患者高出2.1~3.9倍,在閾值為 2.47 ng/ml時(shí),其敏感度和特異性分別為73.6%和76.5%,且在不同級(jí)別膀胱癌患者中的表達(dá)也有差異(P=0.014)。 Silvers等[20]獲取正常尿路上皮組織(n=9)、Tcis(n=13)、不包括Tcis的NMIBC(n=15)、MIBC(n=13)分泌的外泌體,并分析其蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)S100A4、HEXB、SND1及TALDO1在膀胱癌患者尿液外泌體中的水平具有顯著差異(P<0.05)。其中MIBC細(xì)胞質(zhì)中TALDO1的比例顯著下降,且與腫瘤特異性生存率呈正相關(guān)(P=0.008)。Tsumura等[21]分別檢測(cè)不同分期的膀胱尿路上皮癌患者(n=52)和健康對(duì)照組患者(n=28)術(shù)前血清中尿蛋白Ⅲ水平,結(jié)果顯示膀胱癌患者的尿蛋白Ⅲ水平與對(duì)照組相比明顯升高(P<0.05),且其升高水平與肌層浸潤(rùn)程度、病理分級(jí)、淋巴血管侵犯呈正相關(guān)(P<0.02)。這一系列研究說明外泌體的蛋白質(zhì)表達(dá)在膀胱癌患者中具有顯著的特異性,因此通過對(duì)外泌體蛋白質(zhì)表達(dá)的評(píng)估可以幫助我們?cè)谂R床上區(qū)別膀胱癌患者與健康人,甚至是區(qū)分膀胱癌的分級(jí)、分期。

    2.miRNA:Baumgart等采用基因芯片技術(shù)證實(shí)在MIBC與NMIBC細(xì)胞分泌的外泌體中,7種miRNA包括 miR-141-3p、miR-200a-3p、miR-200b-3p、miR-200c-3p、miR-205-5p、miR-224-5p和miR-429-3p表現(xiàn)出下調(diào)的趨勢(shì),而另外2種miRNA包括miR-99a-5p、miR-137-3p則呈上調(diào)趨勢(shì)。Andreu等[22]分別提取健康人、低級(jí)別膀胱癌和高級(jí)別膀胱癌患者尿液外泌體,用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)let-7c、miR-30c-2、miR-146a-5p、miR-194-5p和miR-375的表達(dá)水平,結(jié)果顯示miR-375在高級(jí)別膀胱癌患者外泌體中明顯下調(diào)(P=0.03),而miR-146a則在低級(jí)別膀胱癌患者中呈上調(diào)趨勢(shì)(P=0.03)。以上實(shí)驗(yàn)說明在不同級(jí)別的膀胱癌患者中miRNA的表達(dá)水平是有差異的,同時(shí),也提示可以通過尿液外泌體miRNA定量分析對(duì)膀胱癌患者進(jìn)行分期、分級(jí),并調(diào)整治療方案。事實(shí)上單個(gè)的miRNA表達(dá)異常可能對(duì)膀胱癌的診斷存在偏差,這時(shí)可以考慮聯(lián)合多個(gè)miRNA指標(biāo)達(dá)到更高的診斷效能。如Miah等[23]分別對(duì)膀胱癌患者(n=68)和與其年齡相匹配的對(duì)照組(n=53)中的15種miRNA進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)miR-1224-3p在診斷膀胱癌方面的特異性為83%,敏感度為77%,聯(lián)合miR-15b、miR-135b和miR-1224-3p的診斷敏感度可達(dá)到94.1%。Hanke等[24]則提出尿液外泌體中miR-126與miR-152 的比值在膀胱癌診斷中的特異性為82%,敏感度為72%。

    3.lncRNA:Berrondo等[25]對(duì)膀胱尿路上皮癌患者(n=10)和健康對(duì)照組患者(n=7)進(jìn)行l(wèi)ncRNA測(cè)序后,發(fā)現(xiàn)包括HYMA1、LINC00477、 LOC100506688和OTX2-AS1在內(nèi)的4種lncRNA在高級(jí)別膀胱癌患者外泌體中的表達(dá)明顯上調(diào)。Yan等[26]通過對(duì)110例Ta/T1期膀胱癌組織及其鄰近的正常組織HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)表達(dá)的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)HOTAIR高表達(dá)與膀胱癌的高復(fù)發(fā)率密切相關(guān),這與Berrondo等敲除HOTAIR可減少腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)的結(jié)論一致。因此HOTAIR(HR=4.712,95%CI=2.894~8.714,P<0.001)可作為膀胱癌獨(dú)立的復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)因子。Zheng等分別提取膀胱癌患者和健康對(duì)照組患者血清外泌體,通過受試者工作特征曲線分析得出PTENP1的表達(dá)水平對(duì)診斷膀胱癌的敏感度和特異性分別為65.4%和84.2%,且與病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),并證實(shí)PTENP1可拮抗miRNA-17以減少PTEN表達(dá)的效應(yīng)。Zhan等[6]采用受試者工作特征曲線分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組(n=208)和驗(yàn)證組(n=160)共368個(gè)尿液樣本進(jìn)行8種候選lncRNA表達(dá)的分析,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合MALAT1、PCAT-1和SPRY4-IT1 3種lncRNA對(duì)兩組膀胱癌患者診斷的曲線下面積(AUC)分別為0.854和0.813,均高于尿液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)(AUC=0.619)。MALAT1、PCAT-1和SPRY4-IT13在膀胱癌患者中的表達(dá)明顯上調(diào),其診斷敏感度和特異性分別為72.1%和84.6%、72.1%和81.7%、66.3%和76.9%。Kaplan-Meier分析表明PCAT-1(P<0.001)和MALAT1的表達(dá)與NMIBC患者的無復(fù)發(fā)生存率呈負(fù)相關(guān)(P=0.002)。

    四、外泌體與膀胱癌的治療

    基于外泌體可在細(xì)胞間進(jìn)行信息交流的特點(diǎn),學(xué)者們進(jìn)行了大量以外泌體作為載體傳遞藥物的研究,并取得了良好的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果。Greco等[27]從人胚胎腎293細(xì)胞(HEK293)和間充質(zhì)干細(xì)胞提取出外泌體,并通過電穿孔的方法將PLK-1小干擾RNA(small interfering, siRNA)和對(duì)照siRNA加載到外泌體中,并與膀胱癌UMUC3系細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞共培養(yǎng),在48 h后觀察到UMUC3系細(xì)胞在與加載了PLK-1 siRNA 外泌體共培養(yǎng)后增殖程度明顯降低(P<0.01)。Ha等[28]提出以人體自身細(xì)胞分泌的外泌體作為siRNA的載體可以避免巨噬細(xì)胞和溶酶體的吞噬作用,引發(fā)的免疫排斥反應(yīng)較小的觀點(diǎn),更進(jìn)一步地為外泌體的靶向治療提供了理論基礎(chǔ)。還有其他將治療藥物裝載到外泌體中或?qū)⑼饷隗w制成疫苗等方式也可作為抗腫瘤靶向治療的方法,甚至有研究表明這樣可以減少藥物的劑量,對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生更少的毒性作用[29]。Kumari等[30]則發(fā)現(xiàn)了一種在胞質(zhì)中的蛋白NF2,其表達(dá)程度在外泌體的形成中起著重要作用,貝伐單抗可通過抑制NF2介導(dǎo)外泌體生成的作用來阻斷蛋白與蛋白之間的相互作用,從而達(dá)到抑制膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的效應(yīng)。Viaud等[31]發(fā)現(xiàn)用IF-γ處理后的單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞分泌的樹突細(xì)胞源性外泌體(Dex)與未成熟樹突細(xì)胞分泌的外泌體相比,表達(dá)了更高水平的CD40、CD80、CD86等分子,這使得IF-γ-Dex具有更強(qiáng)的免疫原性,能夠刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答,從而清除腫瘤細(xì)胞。目前這種IF-γ-Dex疫苗已進(jìn)入大規(guī)模制作的Ⅱ期試驗(yàn)。事實(shí)上基于外泌體特異性包埋、與受體細(xì)胞的作用方式及與腫瘤微環(huán)境之間的信息交流等特點(diǎn),我們也可以通過調(diào)節(jié)上述過程使外泌體在腫瘤靶向治療中獲得滿意療效。

    五、展望

    隨著越來越多的研究證明外泌體在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用,基于外泌體性能的腫瘤診斷和治療方法也逐漸受到大家的廣泛關(guān)注,相信在未來研究領(lǐng)域中,不同細(xì)胞來源外泌體的分泌機(jī)制和生理功能,以及如何控制外泌體的成分表達(dá)從而提高外泌體的抗腫瘤效應(yīng)[32]的一系列研究將成為膀胱癌研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。然而,現(xiàn)有的技術(shù)方法所提取出的外泌體純度不夠、破壞了外泌體的結(jié)構(gòu)或內(nèi)在成分,且提取成本過于昂貴[33],因此限制了外泌體在臨床上的應(yīng)用。相信經(jīng)過多學(xué)科的合作,進(jìn)行大樣本的臨床試驗(yàn)后,我們可以將外泌體正式推進(jìn)臨床醫(yī)生的視野里,也為膀胱癌患者提供更便捷、更經(jīng)濟(jì)、更準(zhǔn)確的診療方法。

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