棉花GhCAD6基因表達(dá)及其功能分析研究

胡文冉, 李曉東, 周小云, 李曉榮, 楊 洋, 李 波

1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所, 新疆農(nóng)作物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 烏魯木齊 830091;2.新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究所, 烏魯木齊 830000

新中國成立以來，我國棉花(Gossypiumhirsutum)產(chǎn)量和品質(zhì)都得到了大幅度的提高。但還存在著纖維比強(qiáng)度偏低及纖維品質(zhì)諸指標(biāo)搭配不合理等問題，難以滿足國內(nèi)外市場和紡織工業(yè)的多種需求[1]。新疆作為我國最大的優(yōu)質(zhì)棉生產(chǎn)基地也存在著同樣的問題，嚴(yán)重影響著我國棉花在國際上的競爭力[2]。由于缺乏優(yōu)異種質(zhì)和親本材料，所以在常規(guī)育種方面棉花纖維品質(zhì)改良效果并不明顯。目前棉花纖維改良的途徑已從常規(guī)育種轉(zhuǎn)向常規(guī)育種與生物技術(shù)育種相結(jié)合，其中轉(zhuǎn)基因研究是棉纖維品質(zhì)改良的一個(gè)重要方面。

棉花纖維是由胚珠外珠被表皮層的單細(xì)胞分化發(fā)育而成，在發(fā)育過程中主要經(jīng)歷纖維原始細(xì)胞分化和突起、纖維細(xì)胞的伸長、次生壁增厚和棉纖維脫水成熟4個(gè)階段[3]。棉花纖維發(fā)育過程也是其纖維品質(zhì)形成的過程。棉花纖維品質(zhì)的主要恒定指標(biāo)包括纖維長度、比強(qiáng)度、馬克隆值、色澤等。目前利用基因工程技術(shù)將調(diào)控棉花纖維發(fā)育相關(guān)的基因?qū)朊藁ㄒ蕴岣呙藁ɡw維品質(zhì)方面的研究也已經(jīng)取得了初步進(jìn)展。主要表現(xiàn)以下幾個(gè)方面：①與纖維伸長相關(guān)的基因：如伸長蛋白基因(Expansin)[4]、木聚葡糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶(XTH)[5]、E6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的兔角蛋白基因(keratin)[6]、蠶絲心蛋白基因(fibroin)[7]、棉纖維特異表達(dá)啟動(dòng)子GAE6-3A驅(qū)動(dòng)的蠶絲芯蛋白輕鏈基因(FBN)[8]；②棉纖維細(xì)胞植物激素合成及信號途徑相關(guān)基因：被報(bào)道對棉纖維發(fā)育具有明顯影響并獲得轉(zhuǎn)基因棉花植株的有油菜素內(nèi)酯(BR)相關(guān)基因GhBRII[9,10]、編碼類固醇5α還原酶活力基因GhDET2[11]、赤霉素(GA)相關(guān)基因棉花赤霉素G20氧化酶1基因GhG20ox1[12]、棉花阿拉伯半乳糖蛋白基因GhAGP4[13]、細(xì)胞激動(dòng)素(CK)相關(guān)基因GhCKX[14]；③棉花纖維中細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白及其調(diào)節(jié)因子：棉花肌動(dòng)蛋白基因GhCAT1[15,16]、棉花切割蛋白基因GhKTN1[17]、棉花肌動(dòng)蛋白解聚因子GhADF1[18]、芥末膜連蛋白基因(AnnBj1)[19]、棉花膜聯(lián)蛋白基因GbAnn9[20]；④影響糖類物質(zhì)代謝的基因：纖維素合酶基因acsA和acsB基因[21,22]、蔗糖磷酸化合酶SPS基因[23]、蔗糖合酶基因Sus[24,25]、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因GhUGP1[26]；⑤苯丙烷代謝相關(guān)基因：棉花苯丙烷類化合物木質(zhì)素合成基因GhLIM2[27]。這些基因轉(zhuǎn)入受體棉花后，分別獲得了比受體纖維品質(zhì)有所提高的轉(zhuǎn)基因后代株系，另外還有許多和棉纖維品質(zhì)相關(guān)的基因仍在研究之中。

現(xiàn)有研究表明苯丙烷類代謝是棉花纖維中僅次于纖維素代謝的第二大代謝途徑，苯丙烷代謝和棉花纖維細(xì)胞壁發(fā)育密切相關(guān)，其代謝產(chǎn)物苯丙烷類化合物和棉花纖維品質(zhì)密切相關(guān)[28～31]。肉桂酸脫氫酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD)是苯丙烷代謝途徑上一個(gè)重要的基因家族，在形成細(xì)胞壁交聯(lián)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁的延伸停止、次生壁發(fā)育起始及次生壁的發(fā)育中起重要作用。ChCAD6基因是CAD基因家族中重要的功能基因，該基因的表達(dá)量與棉花纖維的次生壁發(fā)育同步[28]。本團(tuán)隊(duì)從發(fā)育的棉花纖維中克隆出調(diào)節(jié)細(xì)胞壁交聯(lián)結(jié)構(gòu)形成的相關(guān)主效基因GhCAD6(GenBank序列號為：EU281305.1)，將GhCAD6基因利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到棉花受體，獲得了轉(zhuǎn)化GhCAD6基因的陽性植株[32]。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究外源GhCAD6基因在棉花基因組中的表達(dá)及其在不同發(fā)育階段棉纖維中的表達(dá)量，為研究外源GhCAD6改良棉花纖維品質(zhì)的機(jī)理提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GhCAD6基因轉(zhuǎn)入陸地棉新陸早36號，將收獲的轉(zhuǎn)基因棉籽種植后，在每年的選育過程中每代都選擇抗卡那霉素后代植株，并結(jié)合纖維品質(zhì)測試結(jié)果選擇纖維品質(zhì)變化明顯的轉(zhuǎn)基因材料作為下一次種植的材料，連續(xù)種植6代后獲得轉(zhuǎn)基因株系作為本試驗(yàn)中的轉(zhuǎn)基因材料(T6)。對照為未轉(zhuǎn)基因的新陸早36號(CK)。試驗(yàn)材料于2016年種植于新疆瑪納斯分子育種試驗(yàn)基地。

苗期再次對T6代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行卡那霉素的抗性篩選，分別采摘抗卡那霉素的轉(zhuǎn)基因植株和對照棉樣的葉片液氮中迅速冷凍，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在棉花盛花期標(biāo)記抗卡那霉素植株當(dāng)天開花的棉鈴，按5 DPA、10 DPA、15 DPA、20 DPA和25 DPA共5個(gè)時(shí)期采集棉鈴，5 DPA采集20～30個(gè)、10 DPA 20～25個(gè)、15 DPA 15～20個(gè)、20 DPA采集10～15個(gè)、25 DPA采集5～10個(gè)，采摘后立即迅速用鑷子去除棉殼，用預(yù)先準(zhǔn)備好的錫箔紙包好，每包1～2個(gè)棉鈴，做好標(biāo)記，將包裹棉鈴的錫箔紙迅速投入液氮中速凍，-80℃冰柜中保存?zhèn)溆?；對照棉樣相同發(fā)育時(shí)期的棉鈴也采用和轉(zhuǎn)基因植株相同的處理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1目的基因及功能片段的PCR檢測 按植物基因組DNA提取試劑盒(購自天根公司)使用說明提取棉花幼嫩葉片中的DNA。根據(jù)基因序列用Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)引物，然后送由北京六合華大基因科技有限公司合成。其中抗性標(biāo)記基因NPTⅡ-F：5′-GCACAACAGACAATCGGC-TGCTC-3′，NPTⅡ-R：5′-GCCATGGGTCACGAC-GAGATCC-3′，擴(kuò)增片段大小為496 bp；目的基因GhCAD6-F：5′-TGTGCAGGGGTGACAGTTTAC-3′，GhCAD6-R：5′-CCCAATAAAACTCCCTGTAATCG-3′，擴(kuò)增片段大小為501 bp。

分別對抗卡那霉素植株進(jìn)行卡那霉素基因NPTⅡ和GhCAD6基因的PCR檢測。并以對照葉片基因組DNA為陰性對照，以E6-pCAMBIA-2300-GhCAD6質(zhì)粒為陽性對照，無菌水為空白對照，提取的轉(zhuǎn)基因棉花基因組DNA為模板，反應(yīng)體系(20 μL)：DNA(100 ng/μL) 1 μL，2×PCR Mix 10 μL，引物(10 μmol/L) 0.75 μL，ddH2O補(bǔ)足。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，52℃退火30 s，72℃延伸45 s， 35個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物置1.5%瓊脂糖中電泳，并用紫外凝膠成像儀觀察檢測結(jié)果。

1.2.2PCR陽性植株基因組的Southern雜交檢測 以PCR檢測為陽性的植株葉片基因組DNA為模板，CK葉片基因組DNA為陰性對照，質(zhì)粒E6-pCAMBIA-2300-GhCAD6 DNA為陽性對照。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XbaⅠ酶切基因組及質(zhì)粒DNA，酶切體系：18 μL DNA(1 μg/μL)，限制性內(nèi)切酶XbaⅠ 2 μL， 10×buffer 5 μL，無菌水補(bǔ)足至50 μL，37℃酶切18 h。上述1.2.1中得到的目的基因GhCAD6的PCR產(chǎn)物采用天根通用型DNA純化回收試劑盒純化，按照地高辛標(biāo)記的雜交試劑盒Ⅰ(Roche公司)說明書標(biāo)記探針。按照地高辛試劑盒說明書和分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)[33]配制藥品，進(jìn)行Southern雜交檢測。

1.2.3不同發(fā)育階段棉纖維中GhCAD6的熒光定量PCR檢測 ①棉花纖維RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄。熱硼酸-蛋白酶K法[34]提取經(jīng)Southern雜交檢測出現(xiàn)雜交信號的轉(zhuǎn)基因植株發(fā)育5 DPA、10 DPA、15 DPA、20 DPA、25 DPA的棉纖維中的RNA，采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

對預(yù)測模型正負(fù)樣本比例、特征量、算法核心參數(shù)進(jìn)行調(diào)優(yōu)，針對性提高預(yù)測結(jié)果的正確率及預(yù)測精度。整體調(diào)優(yōu)參數(shù)如下：

②實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。選擇GhUBQ7作為內(nèi)參基因，在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的序列信息，使用NCBI引物設(shè)計(jì)工具，Primer-Blast進(jìn)行設(shè)計(jì)，并使用相關(guān)程序?qū)σ镄蛄羞M(jìn)行特異性檢驗(yàn)，由上海生物工程公司合成引物。引物序列如下：GhCAD6-F：5′-GTTCCTGGGCATGAAGTGGT-3′，GhCAD6-R：5′-TGCAACATCCAACAAGACAACC-3′；GhUBQ7-F：5′-AGA-GGTCGAGTCTTCGGACA-3′，GhUBQ7-R：5′-GCTTGATCTTCTTGGGCTTG-3′。

以稀釋后的棉花纖維cDNA為模板，以GhCAD6-F和GhCAD6-R為引物，選用棉花纖維的GhUBQ7為內(nèi)參基因，GhUBQ7-F和GhUBQ7-R為內(nèi)參基因引物，進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)體系(20 μL)為：SYBR? Select Master Mix (2X) 10 μL，F(xiàn)orward Primer (10 μmol/L) 0.40 μL，Reverse Primer(10 μmol/L) 0.40 μL，cDNA 1 μL，RNase-free 水補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)條件為：UDG Activation AmpliTaqDNA，50℃ 2 min；Polymerase, UP Activation，95℃ 2 min；95℃，15 s，60℃，1 min，40個(gè)循環(huán)。得到各自的Ct值(循環(huán)閾值)。所有反應(yīng)包括3次生物學(xué)重復(fù)。

③成熟棉花纖維品質(zhì)檢測。分別收獲轉(zhuǎn)基因單株和受體(CK)自然成熟棉花纖維，用小型軋花機(jī)脫籽，纖維送農(nóng)業(yè)部品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心采用大容量纖維測試儀(HVI)檢測棉花纖維品質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因后代PCR檢測

利用能夠起到篩選作用的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTⅡ)作為檢測基因， PCR產(chǎn)物大小為496 bp，結(jié)果如圖1所示，結(jié)果初步說明檢測基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入棉花基因組中。

經(jīng)上步檢測之后，在已經(jīng)篩選出的部分陽性克隆中，利用能夠擴(kuò)增GhCAD6基因的特異性引物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因后代的PCR檢測，PCR產(chǎn)物大小501 bp，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果初步說明目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入棉花基因組中。

圖1 轉(zhuǎn)基因后代NPTⅡ引物PCR檢測結(jié)果Fig.1 PCR amplification with NPTⅡ primers for generation of transgenic cotton.注：M. DL2000 Marker; 1.陽性對照; 2.非轉(zhuǎn)基因?qū)φ? 3.陰性對照; 4～17.轉(zhuǎn)基因后代(T6)棉花樣品。

圖2 轉(zhuǎn)基因后代GhCAD6引物PCR檢測結(jié)果Fig.2 PCR amplification with GhCAD6 primers for generation of transgenic cotton.注：M. DL2000 Marker; 1～14.轉(zhuǎn)基因后代(T6)棉花樣品; 15.非轉(zhuǎn)基因?qū)φ? 16.陰性對照; 17.陽性對照

根據(jù)卡那霉素篩選和PCR檢測結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)GhCAD6基因的植株經(jīng)過6代篩選后，已基本保持穩(wěn)定，只有極少數(shù)非轉(zhuǎn)基因植株。

2.2 轉(zhuǎn)基因后代植株葉片Southern雜交檢測

使用目的基因GhCAD6重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收后作為探針。圖3為目的基因的Southern雜交結(jié)果，其中未轉(zhuǎn)化植株CK-沒有出現(xiàn)雜交信號，而轉(zhuǎn)基因植株1～4均出現(xiàn)了明顯的雜交信號，表明GhCAD6基因以單拷貝的形式整合到受體棉花基因組中。

2.3 轉(zhuǎn)基因后代植株纖維熒光定量PCR檢測

圖3 轉(zhuǎn)GhCAD6基因棉花后代部分材料的Southern雜交結(jié)果Fig.3 The Southern blotting results of some GhCAD6 transgenic cotton offspring.注：CK-:陰性對照;1～4.轉(zhuǎn)基因植株;CK+:陽性對照。

的總RNA，利用紫外分光光度儀測定其吸光度，其OD260/OD280在1.81～2.06，說明總RNA的純度較高?？俁NA的電泳檢測結(jié)果如圖4所示，28 S與18 S條帶清晰，且28 S條帶亮度約為18 S條帶亮度的2.0倍，說明樣品的RNA保存完好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。下方還能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的條帶，主要是由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA等)組成。

圖4 纖維總RNA電泳圖Fig.4 Electropherogram of total RNA in cotton fiber.

2.3.2擴(kuò)增曲線與熔解曲線分析 經(jīng)分析得知，目的基因GhCAD6的Ct值范圍為27～32，內(nèi)參基因GhUBQT的Ct值范圍為23～27。基因GhCAD6和內(nèi)標(biāo)基因GhUBQT的熔點(diǎn)峰分別出現(xiàn)在79℃和83.5℃，曲線平穩(wěn)，試驗(yàn)的結(jié)果是單一的峰型，峰尖且窄，而且每個(gè)峰的位置基本一致，說明試驗(yàn)條件合適，引物設(shè)計(jì)合理，在PCR擴(kuò)增過程中沒有非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)，是非常理想的熔解曲線，可進(jìn)行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

2.3.3GhCAD6基因在不同纖維發(fā)育階段的表達(dá)量 棉纖維不同發(fā)育階段中GhCAD6基因的表達(dá)量結(jié)果見圖5，從圖5中可以看到在非轉(zhuǎn)基因棉花纖維中GhCAD6基因的整體表達(dá)趨勢是先升高再降低，隨著棉花纖維的發(fā)育在開花后20天(20 DPA)時(shí)GhCAD6基因的表達(dá)量達(dá)到最高，但在25 DPA時(shí)表達(dá)量又迅速下降。而在轉(zhuǎn)基因棉花植株，GhCAD6的表達(dá)量在纖維發(fā)育15 DPA時(shí)出現(xiàn)降低趨勢，其他時(shí)期的表達(dá)趨勢與其對照相似，其中10 DPA和20 DPA時(shí)表達(dá)量與15 DPA間存在顯著差異，15～20 DPA與10 DPA間存在顯著差異，25 DPA與20 DPA間存在顯著差異。而5～20 DPA是棉花纖維伸長的關(guān)鍵時(shí)期，由此說明GhCAD6基因在纖維伸長期起著十分重要的作用。從圖5中可以看出轉(zhuǎn)GhCAD6基因的后代材料中GhCAD6基因的表達(dá)量明顯低于其對照材料，其中15～25 DPA時(shí)轉(zhuǎn)基因材料和其對照間GhCAD6基因的表達(dá)量存在極顯著差異。

2.4 GhCAD6基因?qū)γ蘩w維品質(zhì)的影響

表1是部分轉(zhuǎn)GhCAD6基因單株纖維品質(zhì)檢測結(jié)果，從表中可以看出將GhCAD6基因?qū)朊藁ê?，后代植株纖維上半部平均長度、比強(qiáng)度和整齊度都比對照有所增加，其中對照纖維長度為27.72 mm，轉(zhuǎn)基因植株纖維平均長度在29.38～31.28 mm之間，平均值為30.40 mm，和對照相比增幅在6%～13.9%之間；對照斷裂比強(qiáng)度為26.1 cN/tex，轉(zhuǎn)基因斷裂比強(qiáng)度在28.0～33.2 cN/tex之間，平均值為30.17 cN/tex，和對照相比增幅在7.3%～27.2%之間，整齊度增高，馬克隆值增大，伸長率下降。

圖5 纖維不同發(fā)育階段GhCAD6基因的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression of GhCAD6 gene at different developmental stages of cotton fiber.注：不同小寫字母與大寫字母表示在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。

編號上半部平均長度(mm)斷裂比強(qiáng)度(cN/tex)整齊度指數(shù)(%)馬克隆值伸長率(%)早3627.7226.184.404.626.70轉(zhuǎn)基因株系131.2831.085.604.686.00轉(zhuǎn)基因株系230.9930.484.903.936.20轉(zhuǎn)基因株系331.5631.486.404.175.90轉(zhuǎn)基因株系430.7830.884.904.476.00轉(zhuǎn)基因株系530.8630.485.604.736.30轉(zhuǎn)基因株系630.8330.286.304.456.20轉(zhuǎn)基因株系730.0628.285.404.916.30轉(zhuǎn)基因株系829.9628.886.704.796.00轉(zhuǎn)基因株系930.0329.386.004.866.00轉(zhuǎn)基因株系1030.1529.186.304.766.10轉(zhuǎn)基因株系1130.6128.086.705.046.20轉(zhuǎn)基因株系1229.9328.786.604.936.30轉(zhuǎn)基因株系1329.8929.885.305.096.90轉(zhuǎn)基因株系1429.5529.085.204.846.80轉(zhuǎn)基因株系1529.6029.185.004.966.90轉(zhuǎn)基因株系1630.3832.586.204.787.00轉(zhuǎn)基因株系1730.9333.286.604.667.00轉(zhuǎn)基因株系1830.7532.985.705.017.00轉(zhuǎn)基因株系1929.3830.485.805.016.90轉(zhuǎn)基因株系平均值30.4030.285.854.746.42

3 討論

本實(shí)驗(yàn)使用的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法得到的棉花新陸早36號轉(zhuǎn)GhCAD6基因的T6代材料。在每次的選育過程中每代都選擇棉花纖維長度增加較多，變化明顯的轉(zhuǎn)基因抗卡那霉素后代植株作為下一次種植的材料，該方法大大縮短了得到高純度的轉(zhuǎn)基因后代材料所需要的時(shí)間。在本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因株系種植到T6代時(shí)已基本穩(wěn)定，僅有較少的分離。經(jīng)PCR檢測發(fā)現(xiàn)目的基因和標(biāo)記基因已存在于轉(zhuǎn)基因植株葉片基因組中，Southern雜交檢測出雜交信號，目的基因以單拷貝的形式插入到受體基因組中并得以表達(dá)，說明該目的基因能夠在轉(zhuǎn)基因后代中穩(wěn)定遺傳。

基因表達(dá)的定量檢測方法很多，主要從蛋白表達(dá)水平、mRNA表達(dá)水平及外源DNA幾個(gè)方面入手，包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)[36,37]、蛋白雜交[38,39]、高效液相色譜(HPLC)[40,41]、Southern雜交[42]、Northern雜交[43]、生物芯片技術(shù)(Biochips)[44]及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)、半定量RT-PCR[45]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)[46]等。各個(gè)檢測方法在檢測基因表達(dá)量時(shí)都有其優(yōu)缺點(diǎn)，其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有特異性高、靈敏度高、可定量、有效解決PCR污染問題及自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，保證了結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域。但對于棉花纖維富含酚類化合物、多糖、次生代謝產(chǎn)物和內(nèi)源RNA酶活性高等特點(diǎn)，適宜的棉花纖維RNA提取方法、合適的引物及內(nèi)參基因是保證實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)施的關(guān)鍵，合適的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件也是實(shí)驗(yàn)實(shí)施必不可少的步驟之一。在本研究中，針對棉花纖維的特點(diǎn)，選用熱硼酸-蛋白酶K法提取出棉花纖維中的RNA，避免了酚類、糖類等化合物對RNA的污染及RNA的完整性，再結(jié)合本研究中的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件，從而保證了該技術(shù)在檢測GhCAD6基因的表達(dá)量的順利實(shí)施。該技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：①自動(dòng)收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，提高了實(shí)驗(yàn)的靈敏度，保證了結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性；②免除了常規(guī)PCR中的電泳、定量掃描等后續(xù)繁瑣步驟，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間；③操作簡單，具有很強(qiáng)的推廣性。CAD位于苯丙烷代謝途徑最后一步反應(yīng)[47]，F(xiàn)an等[28]從發(fā)育的棉花纖維中克隆了2個(gè)肉桂酸脫氫酶基因GhCAD1和GhCAD6的cDNA序列，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因在棉花次生壁增厚期優(yōu)勢表達(dá)，表明CAD可能在棉花纖維次生壁形成過程中有重要的功能。Li等[48]研究表明GhCAD6基因被定位在第26號染色體上，參與棉纖維中的苯丙烷類單元和細(xì)胞壁酚酸的代謝。本研究也表明GhCAD6基因?qū)朊藁ㄊ荏w后，其纖維長度、比強(qiáng)度得到明顯提高，進(jìn)一步證明了該基因在改良棉花纖維中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因后代植株中GhCAD6基因的表達(dá)量在15 DPA時(shí)降低，20 DPA時(shí)又表現(xiàn)升高趨勢，而轉(zhuǎn)基因植株纖維品質(zhì)明顯高于其對照，該結(jié)果與袁輝[49]采用半定量RT-PCR法對棉花纖維發(fā)育過程中基因GhCADx進(jìn)行量化分析的結(jié)果一致。這也可能是轉(zhuǎn)GhCAD6基因造成棉花纖維品質(zhì)改變的原因。但苯丙烷代謝是個(gè)非常復(fù)雜的代謝途徑，涉及很多基因，轉(zhuǎn)基因GhCAD6棉花的植株纖維中GhCAD6的表達(dá)量總體上低于對照的原因還需進(jìn)一步研究。